Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-04-24T13:13:49Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Ricardo M. Katak.pdf: 1544893 bytes, checksum: b7b82696df95a9ce886dc0401cb6f29c (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-04-24T13:14:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Ricardo M. Katak.pdf: 1544893 bytes, checksum: b7b82696df95a9ce886dc0401cb6f29c (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-04-24T13:14:36Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Ricardo M. Katak.pdf: 1544893 bytes, checksum: b7b82696df95a9ce886dc0401cb6f29c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-24T13:14:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Ricardo M. Katak.pdf: 1544893 bytes, checksum: b7b82696df95a9ce886dc0401cb6f29c (MD5) Previous issue date: 2015-11-27 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Insect vectors of tropical diseases such as Ae. Aegypti, the main vector of dengue virus, chikungunya, zika and West Nile virus, are a major problem for public health. One of the major control measures is to control the vector. In this regard, we sought to investigate the biological control of Ae. aegypti; with the use of Bacillus spp .; Amazon isolated from different environments. From the different samples, there was obtained a total of 118 bacterial strains, and 41 strains identified by phenotypic characteristics such as bacilli. Of these, 38 were positive and gram 2 gram negative bacilli. The molecular identification of these strains allowed the identification of 29 strains were characterized in three different genres. The molecular characterization of patients bacilli of Cry4 genes, cry11 and PHAC. Cry4 genes were observed in BtAM41, 2R6.2.1LB lines with no toxicity. The Bio19LB lines, BSBioLB, Bio01LB and Bio011LB presented the cry11 genes, as the larvicidal activity were efficient in both phases of bioassays except Bio011 lineage that any result below 50% in the second stage of bioassays. The 2WISP2, K5NA lines, R8ISP2, R15ISP2, Bio16LB, BtAM125LB, BtAM49LB just presented the PhaC gene. Just BtAM49LB strain was effective in larvicidal activity. Considering the results of the first and second stage, the best results when there were interaction sterile lysed cell supernatant (SN), showing 100% in 72 h. In this sense, it is recommended to study the characterization of metabolites of these strains. The K4NA lines; 103PHAISP2, BtAM220NA; ALP2ISP2, BtAM74LB and PHA50ISP2 bear the cry11 and PHAC genes showed no larvicidal activity above 50% considering it was not observed correlation of genes associated with larvicidal activity. Only Bio19LB strain showed the cry11 gene and Cry4, with larvicidal activity above 50% in the supernatant of lysed cells with interaction with 70% mortality within 72 h. There was no correlation of the phaC gene and Cry isolated, but the best results were in the supernatant of lysed cells with consortium, possibitando the possibility of interaction of molecules with insecticidal activity. So before these results are needed more detailed studies to understand and elucidate the interaction of strains that showed higher larvicidal activity, it is concluded that the strains that showed larvicidal activity above 50% and the same carriers of cry11 genes, Cry4 and PHAC can be associated with other virulence and pathogenicity factors, becoming future potential lines for the control of Ae. Aegypti. / Insetos vetores de patógenos tropicais como Ae. Aegypti, principal vetor do vírus dengue, chikungunya, zika e vírus do Nilo Ocidental, são um grande problema para saúde pública. Uma das principais medidas de combate é o controle do vetor. Neste sentido, buscou-se investigar o controle biológico de Ae. aegypti; com uso de Bacillus spp.; isolados de diferentes ambientes Amazônicos. A partir de diferentes amostras, obteve-se o total de 118 linhagens bacterianas, sendo 41 linhagens identificadas por características fenotípicas como bacilos. Destes, 39 foram bacilos gram positivos e 2 gram negativos. A identificação molecular destas linhagens permitiu identificar 29 linhagens, sendo caracterizadas em três gêneros distintos. Quanto a caracterização molecular dos bacilos portadores dos genes Cry4, Cry11 e PhaC. Foram observados genes Cry4 nas linhagens BtAM41, 2R6.2.1LB, com ausência de toxicidade. As linhagens Bio19LB, BSBioLB, Bio01LB e Bio011LB apresentaram os genes Cry11, quanto a atividade larvicida foram eficientes nas duas etapas dos bioensaios exceto a linhagem Bio011 que apresentou resultados abaixo de 50 % na segunda etapa dos bioensaios. As linhagens 2WISP2, K5NA, R8ISP2, R15ISP2, Bio16LB, BtAM125LB, BtAM49LB apresentaram apenas o gene PhaC. Apenas a linhagem BtAM49LB foi eficiente na atividade larvicida. Considerando os resultados dos bioensaios seletivos de extratos brutos de Bacillus spp., os melhores resultados foram quando houve a interação do sobrenadante estéril com células lisadas (SN), apresentando 100 % em 72 h. Neste sentido, recomenda-se estudos da caracterização dos metabolitos destas linhagens. As linhagens K4NA; 103PHAISP2, BtAM220NA; ALP2ISP2, BtAM74LB e PHA50ISP2 portadoras dos genes Cry11 e PhaC, não apresentaram atividade larvicida acima de 50 %, considerando que não foi observado correlação dos genes associados com atividade larvicida. Somente a linhagem Bio19LB apresentou os genes Cry11 e Cry4, apresentando atividade larvicida acima de 50 % na interação de sobrenadante com células lisadas com 70 % de mortalidade em 72 h. Não foi observado correlação dos genes PhaC e Cry nos isolados, mas os melhores resultados foram no consórcio do sobrenadante + células lisadas, possibilitando a hipótese de interação de moléculas com atividade inseticida. Portanto, diante destes resultados são necessários mais estudos detalhados para compreender e elucidar a interação das linhagens que apresentaram maior atividade larvicida, conclui-se que as linhagens que apresentaram atividade larvicida acima de 50 % e as mesmas portadoras dos genes Cry11, Cry4 e PhaC podem estar associados a outros fatores de virulência e patogenicidade, tornando-se futuramente linhagens potenciais para o controle de Ae. Aegypti no Estado do Amazonas.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:32:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 540797 bytes, checksum: 8f31a791537c94182ffb7cf0199e9e42 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bees are essential for the maintenance of biodiversity. They are also responsible for a large percentage of world food production. The species Apis mellifera is considered of great economic value due to its products for human consumption. The creation of insect-resistant transgenic products has increased the chances for the contact between bees and the Cry proteins derived from the bacterium Bacillus thuringiensis, which can be toxic to bees. Therefore, it is very important to study the hazards of toxicity. The study of these proteins in bees can be conducted by using survival analysis techniques, in which the response variable is the time until the occurrence of the event of interest, called failure time. If failure does not occur, time is called censoring, which is some partial information. The main interest is to estimate parameters to describe the survival or hazards, at a given time. In general, when there are covariates that may affect the survival time, adjustment can be performed by the Cox Regression Model, also known as proportional hazards model, through the assumption of proportional hazards among individuals over time. Chapter I, which deals with an adaptation of the Cox Regression model known as Fragility Model, not only explains the hazard of failure from individuals due to the effect of covariates, but also describes the existence of an unobserved random variable that groups individuals in natural or artificial conglomerates. The survival times were modeled to explain the hazard of failure by immature workers of A. mellifera under the effect of covariates; the colony was used as a random variable; and the ingestion of Cry1Ac protein, as fixed explanatory variable. Three different diets were tested to evaluate the toxicity of Cry1Ac on A. Mellifera: pure artificial (D0), artificial diluted in water with Cry1Ac (D2) and artificial diluted in water (D2). The individuals were collected from five different colonies maintained in Viçosa, Minas Gerais, Brazil. The random variable colony (frailty) was significant, which indicates statistical differences in the lifespans of bees from different colonies. Considering this diversity of frailty, the artificial diet diluted in water showed a higher hazard of failure, significantly different from the effect of the control diet (artificial pure). Therefore, the survival of the bee larvae was decreased due to the addition of water to the diet, which diluted the feed. However, the Cry1Ac-protein-based diet showed no significant hazard of failure when compared with the control. An alternative technique to the Cox model is presented in Chapter II of this work. When no proportional hazards of the individuals over time are observed within the sample, it is necessary to stratify or perform some other weakening of the proportional hazard condition. It can be used the Quantile Regression, which studies the relationship between the dependent variable and the explanatory variables in the conditional quantiles by minimizing the weighted mean absolute errors. This technique has properties of equivariance, invariance for monotomic transformations and robustness in the presence of outliers. Thus, by means of equivariance, they can be applied to data with censoring. It was found that, in the same set of biosafety data from the Cry1Ac protein, in honeybees called A. Mellifera, the hazards of failure by individuals are not proportionalities for the different diets studied. The survival times of bees were adjusted by quantile regression, by using the Portnoy estimator for 14 quantiles. In quantiles {0.10; 0.15; 0.30; 0.40}, the coefficients are negative values significantly different from zero. For such, in these quantiles, the individuals fed with pure diet (D0) had longer survival time compared to those fed with a diet containing Cry1Ac protein (D1). This was observed among younger individuals, since the lifespan of the larvae lifespans in these quantiles are below the average time of life. The coefficients for the quantiles {0.35; 0.50; 0.60} presented statistically significant negative effect. Therefore, water addition to the diet affected the survival of larvae approximately at the average lifespans. / As abelhas são seres indispensáveis para a manutenção da biodiversidade e além disso, são responsáveis por grande porcentagem da produção mundial de alimentos. A Apis mellifera é considerada espécie de grande valor econômico, devido a seus produtos para o consumo humano. Atualmente, com a criação de transgênicos resistentes a insetos, aumentou a possibilidade das abelhas entrarem em contato com as proteínas Cry derivada da bactéria Bacillus thuringiensis, que pode ser toxica às abelhas, tornando o estudo dos riscos de toxicidade importante. Portanto, o estudo dessas proteínas nas abelhas pode ser realizada por meio das técnicas da análise de sobrevivência. Nestas técnicas a variável resposta é o tempo até a ocorrência do evento de interesse, denominado tempo de falha, e se a falha não ocorrer, o tempo é denominado censura, que é uma informação parcial. O principal interesse é estimar parâmetros para descrever a sobrevivência ou riscos, num certo tempo determinado. Usualmente quando existem covariáveis que possam influir no tempo de sobrevivência o ajuste pode ser realizado pelo Modelo Regressão de Cox, também conhecido como de modelo de riscos proporcionais, pela suposição dos riscos proporcionais entre os indivíduos ao longo do tempo. No Capítulo I deste trabalho é realizada uma adaptação da Regressão de Cox conhecida como Modelo de Fragilidade, que além de explicar o risco do indivíduo falhar por influência de covariáveis, também descreve a existência de alguma variável aleatória não observada que agrupa indivíduos em conglomerados naturais ou artificiais. Os tempos de sobrevivência foram modelados para explicar o risco de falhar das operárias imaturas de A. mellifera sob o efeito de covariáveis, sendo a colônia utilizada como variável aleatória e a ingestão da proteína Cry1Ac como variável explicativa fixa. Para avaliar a toxicidade de Cry1Ac sobre A. mellifera, foram testadas três diferentes dietas: artificial pura (D0), artificial diluída em água com Cry1Ac (D2) e artificial diluída em água (D2). Os indivíduos foram coletados de cinco colônias diferentes mantidas em Viçosa, Minas Gerais, Brasil. A variável aleatória colônia (fragilidade) foi significativa, indicando diferenças estatísticas nos tempos de vida das abelhas provenientes de diferentes colônias. Dentro dessa diversidade de fragilidade, a dieta artificial diluída em água apresentou risco maior de falhar, significativamente diferente do efeito da dieta controle (artificial pura). Portanto, a sobrevivência das larvas de abelhas foi diminuída em virtude da adição de água na dieta, pela diluição do alimento. No entanto, a dieta baseada na proteína Cry1Ac não mostrou risco de falha significativo quando comparado com o controle. Uma técnica alternativa ao Modelo de Cox é apresentada no Capítulo II deste trabalho. Quando se verifica que os riscos dos indivíduos, ao longo do tempo dentro da amostra, não são proporcionais, é necessário estratificar ou realizar um outro procedimento na análise. Uma alternativa que pode ser utilizada é a Regressão Quantílica, que estuda a relação entre a variável dependente e as variáveis explicativas nos quantis condicionais, por meio da minimização de erros absolutos ponderados. Esta técnica possui propriedades de equivariância, invariância para transformações monotômicas e robustez na presença de outlier. Assim, pela equivariância podem ser aplicados aos dados com censura. Foi verificado que no mesmo conjunto de dados de biossegurança da proteína Cry1Ac em abelhas denominadas A. mellifera que os riscos de falhar dos indivíduos não são proporcionalidades para as diferentes dietas estudadas. Os tempos de sobrevivência das abelhas foram ajustados pela regressão quantílica, utilizando o estimador de Portnoy para 14 quantis. Nos quantis {0,10; 0,15; 0,30; 0,40} os coeficientes são valores negativos significativamente diferentes de zero. Por tanto, nestes quantis os indivíduos alimentados com a dieta pura (D0) tiveram maior tempo de sobrevivência, que aqueles que têm incorporado à proteína Cry1Ac na dieta (D1), isto aconteceu entre os indivíduos mais novos, já que nesses quantis os tempos de vida das larvas são inferiores ao tempo de vida mediano. Os coeficientes para os quantis {0,35; 0,50;0,60} apresentaram efeito negativo estatisticamente significativos, por tanto a incorporação da água na dieta influiu na sobrevivência das larvas aproximadamente nos tempos medianos de vida.

O algodão transgênico Bollgard® (algodão Bt) contém o gene cry1Ac da bactéria Bacillus thuringiensis, que confere a planta resistência a Lepidopteros. A expressão deste gene na planta pode acarretar efeitos ecológicos adversos à microbiota do solo e da rizosfera. Em casa-de-vegetação, a comunidade bacteriana associada ao algodão Bt foi comparada a do algodão convencional, em dois tipos de solos e quatro estádios fenológicos. Amostras de rizosfera foram avaliadas por técnicas dependentes e independentes de cultivo. As técnicas de contagem de bactérias e DGGE permitiram observar os efeitos do algodão Bt na densidade e diversidade de Pseudomonas e bactérias totais, durante os estádios iniciais de desenvolvimento da planta. A toxina Cry foi detectada na rizosfera de algodão Bt, em todo ciclo da cultura. Nas fases de formação do botão floral e abertura das maçãs, a atividade microbiana foi maior na rizosfera do algodão Bt. Esses resultados indicam o potencial do ambiente rizosférico em reestabelecer à estrutura da comunidade bacterina após um impacto temporal. / The transgenic cotton Bollgard® (Bt cotton) contains the cry1Ac gene from the Bacillus thuringiensis bacterium, which confers the plant resistance against some insects. The expression of this gene in the plant can cause adverse ecological effects on soil and rhizosphere microbiota. In a greenhouse experiment, the bacterial community associate to Bt cotton was compared to non-transgenic parental cultivar plants, in two types of soil at different plant development stages. Rhizosphere communities were evaluated by culture-dependent and independent approaches. Results reveal the effect of the Bt cotton in the density and diversity of Pseudomonas and total bacteria, during initial plant development stages. The Cry toxin was detected in the rhizosphere of Bt cotton, during all plant cycle. In the phases of flower formation and fruit opening, the microbial activity was greater in the rhizosphere of Bt cotton. These results show the potential of the rhizosphere to reestablish the original structure of the bacterial community after a temporary impact.

O algodão transgênico Bollgard® (algodão Bt) contém o gene cry1Ac da bactéria Bacillus thuringiensis, que confere a planta resistência a Lepidopteros. A expressão deste gene na planta pode acarretar efeitos ecológicos adversos à microbiota do solo e da rizosfera. Em casa-de-vegetação, a comunidade bacteriana associada ao algodão Bt foi comparada a do algodão convencional, em dois tipos de solos e quatro estádios fenológicos. Amostras de rizosfera foram avaliadas por técnicas dependentes e independentes de cultivo. As técnicas de contagem de bactérias e DGGE permitiram observar os efeitos do algodão Bt na densidade e diversidade de Pseudomonas e bactérias totais, durante os estádios iniciais de desenvolvimento da planta. A toxina Cry foi detectada na rizosfera de algodão Bt, em todo ciclo da cultura. Nas fases de formação do botão floral e abertura das maçãs, a atividade microbiana foi maior na rizosfera do algodão Bt. Esses resultados indicam o potencial do ambiente rizosférico em reestabelecer à estrutura da comunidade bacterina após um impacto temporal. / The transgenic cotton Bollgard® (Bt cotton) contains the cry1Ac gene from the Bacillus thuringiensis bacterium, which confers the plant resistance against some insects. The expression of this gene in the plant can cause adverse ecological effects on soil and rhizosphere microbiota. In a greenhouse experiment, the bacterial community associate to Bt cotton was compared to non-transgenic parental cultivar plants, in two types of soil at different plant development stages. Rhizosphere communities were evaluated by culture-dependent and independent approaches. Results reveal the effect of the Bt cotton in the density and diversity of Pseudomonas and total bacteria, during initial plant development stages. The Cry toxin was detected in the rhizosphere of Bt cotton, during all plant cycle. In the phases of flower formation and fruit opening, the microbial activity was greater in the rhizosphere of Bt cotton. These results show the potential of the rhizosphere to reestablish the original structure of the bacterial community after a temporary impact.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_ana_paula_de_lara.pdf: 4627911 bytes, checksum: 887ee69dd56b73509c1a603e3b25aebd (MD5) Previous issue date: 2013-03-08 / Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram-positive bacteria, ubiquitous, facultative anaerobic, and form spores. During sporulation produce a parasporal crystals inclusion. Within these inclusions there are δ-endotoxin proteins well known for its insecticides proprieties. Among them, the Cry (crystal) is wide employed for biological control of plagues. The δ-endotoxin has an advantage of been more specific than chemical insecticides, thus been consider more favorable for the environment. The aim of this study was to obtain the Cry 11Aa recombinant protein of Bacillus thuringiensis var. israelensis in Escherichia coli, active for use in biocontrol. Two expression E. coli strains were tested: BL 21 (DE3) C41 and BL 21 (DE3) Ril. The protein Cry 11Aa was expressed and secreted in a soluble form by the two strains. The expression was demonstrated by Western Blot using anti-histidin monoclonal antibody. The strain BL 21 (DE3) C41 express the protein Cry 11Aa ~3.6 times more than the strain Rill, and showed a biologic efficiency of 95% of mortality for Culex quinquefaciatus larvae. The data obtained in this study suggest that the protein recombinant Cry 11Aa expressed in E. coli has a potential to be used in biological control. / Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva, de ocorrência ubíqua, anaeróbica facultativa, formadora de esporos. Produz cristais, como inclusões parasporal durante a esporulação. Estas inclusões contêm proteínas chamadas de δ-endotoxinas, que são bem conhecidas pelas suas propriedades inseticidas. Dentre elas as toxinas Cry (crystal) são largamente empregadas no controle biológico de pragas. As δ-endotoxinas têm a vantagem de serem mais específicos do que os inseticidas químicos sintéticos, portanto, são considerados como agentes de controles favoráveis ao meio ambiente. O objetivo deste estudo foi a obtenção da proteína Cry 11Aa recombinante de Bacillus thuringiensis var. israelensis em Escherichia coli, ativa, para utilização no controle biológico.Duas cepas de E. coli de expressão foram testadas: BL 21 (DE3) C41 e BL 21 (DE3) Ril. A proteína Cry 11Aa foi expressa e secretada na forma solúvel pelas duas cepas. A expressão foi demonstrada por Western blot utilizando-se anticorpo monoclonal anti-histidina. A cepa BL 21 (DE3) C41 expressou a proteína Cry 11Aa ~3.6 vezes mais que a cepa BL 21 (DE3) Ril, e apresentou, em teste biológico, uma eficácia de 95% de mortalidade sobre larvas de Culex quinquefaciatus. Com os dados obtidos neste trabalho podemos sugerir que a proteína recombinante Cry 11Aa expressa em E. coli é um potencial candidato para ser utilizado no controle biológico.