A dengue é um dos principais problemas de saúde publica do mundo, especialmente nas regiões tropicais e subtropicais. Apesar da magnitude do problema, ainda existem limitações relacionadas ao diagnóstico, devido à presença de resultados falsos negativos, muitas vezes apresentados nos laudos laboratoriais. Estudos com a proteína do envelope são extremamente importantes para o desenvolvimento de novas vacinas e testes de diagnóstico. Os métodos sorológicos são importantes para o diagnóstico das infecções por dengue, entre eles, o imunoensaio enzimático para detecção de IgM contra o vírus da dengue. Neste estudo, 82 amostras de soro de pacientes com suspeita de dengue foram classificadas como positivas ou negativas utilizando o kit comercial Panbio ELISA de Captura Dengue IgM. O desempenho do ensaio do kit comercial foi comparado com os novos ensaios ELISA indireto usando três peptídeos sintéticos derivados da proteína E como substrato. De um total de 82 amostras de soro, (52,4%) foram positivas pelo kit comercial Panbio Dengue IgM ELISA de Captura, 18 (21,9%) apresentaram reatividade contra Pep1, 40 (48,7%) contra o Pep2 e 66 (80,4%) contra Pep3. Entre as amostras de soro classificadas como positivas pelo kit comercial (42), 11 (26%), também foram classificadas como positivas usando o peptídeo Pep1. Vinte e duas (52,3%), utilizando o Pep2 e 40 (95,23%) utilizando Pep3. Entre as amostras classificadas como negativas por meio do kit comercial (40), 28 (70%) foram classificadas como negativas usando como substrato o Pep1, vinte 20 (50%) utilizando como substrato o Pep2 e 13 (32,5%), utilizando como substrato Pep3. Os resultados demonstram que os peptídeos sintéticos podem ter potencial biotecnológico para o desenvolvimento de novas vacinas, tratamentos e testes de diagnósticos. / Dengue is a major public health problem worldwide, especially in the tropical and subtropical regions of the world. Despite the magnitude of the problem, there are still limitations related to the diagnosis, due to the presence of false negative results often presented in the laboratory reports. Studies using the envelope protein are extremely important for the development of new vaccines and new diagnostic tests. Serological methods are important for the diagnosis of dengue infections, and among them, the enzyme linked immunoassay that detects IgM against Dengue virus is very employed. In this study, a panel of 82 serum samples from dengue suspected patients was classified as positive and negative using the commercial ELISA kit Panbio Capture Dengue IgM. Assay performance of the commercial kit was compared with the new indirect ELISA assays using synthetic peptides derived from E protein (Pep1, Pep2 and Pep3) as substrate. Of a total of 82 serum samples, (52.4%) were positive by the commercial ELISA kit Panbio Capture Dengue IgM, 18 (21,95%) showed reactivity against Pep1; 40 (48,78%) against Pep2 and 66 (80,48%) against Pep3. Among the serum samples classified as positive by the commercial kit (42), 11 (26%) are also classified by positive using Pep1 as substrate, 22 (52,3%) using Pep2 as substrate and 40 (95,23%) using Pep3 as substrate. Among the samples classified as negative by the commercial kit (40), 28 (70%) were also classified as negative using Pep1 as substrate, 20 (50%) using Pep2 as substrate and 13 (32.5%) using Pep3 as substrate. The results showed that the synthetic peptides can have biotechnological potential for the development of new vaccines and treatments and diagnostic tests. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-16T22:47:30Z No. of bitstreams: 1 Adriana de Souza Azevedo completo.pdf: 9819625 bytes, checksum: 2453578116f0a15f3832c81fccd0979e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-16T22:47:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adriana de Souza Azevedo completo.pdf: 9819625 bytes, checksum: 2453578116f0a15f3832c81fccd0979e (MD5) Previous issue date: 2011-06-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A dengue é uma doença causada pelo vírus da dengue (DENV1-4). Apesar dos vários estudos, ainda não existe uma vacina comercialmente disponível. A proteína do envelope (E) de DENV apresenta-se como o maior componente protéico da superfície viral. Consequentemente, esta proteína é o principal alvo para a indução de uma resposta imune protetora, provavelmente baseada em anticorpos neutralizantes. No presente trabalho, nós avaliamos o potencial protetor de vacinas de DNA baseadas na proteína E de DENV2. Para isto, foram construídos dois plasmídeos, pE1D2 e pE2D2, que contêm as sequências que codificam o ectodomínio da proteína E (domínios I, II e III) ou somente o seu domínio III, respectivamente, clonadas da montante à sequência que codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA). Os dois plasmídeos mediaram à expressão e secreção das proteínas recombinantes in vitro em células eucarióticas, detectadas com anticorpos anti-DENV2 e avaliadas por ensaios de imunofluorescência ou marcação metabólica seguida de imunoprecipitação. Ambas as vacinas de DNA foram capazes de induzir respostas imunes com produção de anticorpos neutralizantes em camundongos Balb/c, com títulos mais elevados nos animais imunizados com o pE1D2. A vacina pE1D2 também se mostrou mais protetora nos testes de desafio com uma dose letal de DENV2, induzindo 100% de sobrevivência nos camundongos imunizados, enquanto que 45% dos animais vacinados com o plasmídeo pE2D2 morreram após a infecção. Além disso, 10% e 65% dos camundongos imunizados com pE1D2 ou pE2D2, respectivamente, apresentaram morbidade frente ao desafio letal. As vacinas pE1D2 e pE2D2 também foram testadas combinadas com o vírus quimérico YF17D-D2, em um sistema de dose e reforço ou em imunizações simultâneas. O vírus quimérico YF17D-D2 foi construído com a substituição dos genes prM e E do vírus vacinal da febre amarela 17DD pelos genes prM e E de DENV2. A vacina de DNA pE1D2 combinada com a quimera YF17D-D2 induziu altos níveis de anticorpos neutralizantes nos animais vacinados com os diferentes esquemas de imunização. Além disso, esses animais apresentaram 100% de sobrevivência frente ao desafio letal com DENV2, com ausência de qualquer sinal clínico da infecção. O efeito sinérgico da imunização combinada também foi evidenciado quando combinamos a vacina pE2D2 e YF17D-D2, que gerou 100% de sobrevivência nos animais desafiados. A resposta imune celular foi avaliada pela produção de IFN-por células TCD8+ em ensaios de ELISPOT, evidenciando a ativação destas células nos animais imunizados com as pE1D2 independente da sua combinação com a quimera YF17D-D2. Além disso, a análise do perfil fenotípico das células TCD4+ e TCD8+ mostrou um percentual menor de linfócitos CD62L+ nos animais vacinados com o pE1D2 isolado ou combinado com o vírus quimérico, indicando que a vacina de DNA pode influenciar nos processos de ativação das células T. Posteriormente, foram construídas novas vacinas de DNA que codificam os ectodomínios da proteína E de DENV1, 3 e 4 (pE1D1, pE1D3 e pE1D4), cuja expressão foi confirmada in vitro, e que serão testadas futuramente em modelos animais. / Dengue is a disease caused by the dengue virus (DENV1-4). Despite several studies, no effective vaccine is yet commercially available. The envelope protein (E) of DENV is the viral surface major protein component, associated with numerous biological activities. Thus, this protein is the main target for the induction of a protective immune response based on neutralizing antibodies. In the present study, we evaluated the potential of DNA vaccines expressing the DENV2 E protein for the induction of protection. Two plasmids were constructed, pE1D2 and pE2D2, which contain sequences encoding the ectodomain of the E protein (domains I, II and III) or only its domain III, respectively, cloned upstream the encoding sequence of the human tissue plasminogen activator signal peptide (t-PA). Both plasmids mediated expression and secretion of the recombinant proteins in vitro in eukaryotic cells, detected with anti-DENV2 antibodies and evaluated by immunofluorescence or metabolic labeling assay followed by imunopreciptation. Both DNA vaccines were elicited neutralizing antibodies in Balb/c mice, with the highest antibody titers detected in animals immunized with the pE1D2. The pE1D2 vaccine was also more protective in challenge tests with a lethal dose of DENV2, inducing 100% survival in immunized mice, while 45% of animals vaccinated with the plasmid pE2D2 died after infection. Furthermore, 10% and 65% of the mice immunized with pE1D2 or pE2D2, respectively, showed morbidity after virus challenge. The vaccines pE1D2 and pE2D2 were also tested in combination with the chimeric YF17D-D2 virus, in a prime and booster system or with simultaneous immunizations. The YF17D-D2 chimeric virus was previously constructed by replacing the prM and E genes of 17DD yellow fever vaccinal virus with those from DENV2. The pE1D2 DNA vaccine combined with the YF17D-D2 chimera induced high levels of neutralizing antibodies in animals vaccinated with any of the different immunization schedules. Moreover, these animals showed 100% survival rates against a lethal challenge with DENV2, with no clinical signs of infection. The synergistic effect of combined immunization was also evident when we used the pE2D2 DNA vaccine and the YF17D-D2 virus, which generated 100% survival in challenged animals. The cellular immune response was evaluated by the production of IFN- by CD8+ T cells in ELISPOT assays, revealing the activation of these cells in animals immunized with the pE1D2 alone or in combination with the YF17D-D2 chimera. Furthermore, analysis of the phenotypic profile of CD4+ and CD8+ T cells showed low percentage of CD62L+ lymphocytes in animals vaccinated with pE1D2, alone or combined with the chimeric virus, thus indicating that the DNA vaccine can influence the processes of T cell activation. New DNA vaccines encoding the ectodomains of DENV1, 3 and 4 of the envelope protein (pE1D1, pE1D3 and pE1D4) were constructed and the expression of recombinant proteins was confirmed in vitro. These DNA vaccines will be further tested animal models.

A formulação HIVBr18, previamente desenvolvida e testada, é uma vacina de DNA que codifica 18 epítopos CD4, promíscuos e conservados do HIV-1, e que após imunização de camundongos transgênicos para diversas moléculas de HLA de classe II humanas, observou-se proliferação de linfócitos T CD4+ e CD8+ e produção de IFN-? direcionadas a múltiplos epítopos codificados pela vacina. Abordamos aqui estratégias baseadas na fusão ou combinação dos epítopos codificados pela vacina HIVBr18 à glicoproteína D (gD) do HSV-1, e também na coadministração de plasmídeos que codificam citocinas (IL-2, -12, -15 e GM-CSF) visando aumentar a imunogenicidade de HIVBr18. A sequencia de DNA que codifica os 18 peptídeos da vacina HIVBr18 foi amplificada por PCR e clonada em um plasmídeo que abrigava a sequencia da gD do HSV-1. dando origem ao plasmídeo pVAX-gDh-HIVBr18. Animais imunizados com gDh-HIVBr18 apresentaram resposta imunológica similar ao grupo que recebeu somente HIVBr18, não sendo diferente também daqueles que receberam plasmídeos gDh-HIVBr18 que sofreram alterações nas sequências para melhorar o padrão de distribuição hidrofóbica e permitir a migração da proteína de fusão para o meio extracelular. Construímos e testamos um plasmídeo bicistrônico que expressa gDh e HIVBr18 isoladamente, mas também não observamos aumento na resposta imune induzida. A coadministração com o plasmídeo HIVBr18 e plasmídeos que codificam as citocinas IL-12, IL-15 e GM-CSF, proporciona um aumento na magnitude da resposta imunológica induzida contra o pool de peptídeos codificados pela vacina, entretanto sem alteração da amplitude da resposta. Além disso, o plasmídeo de GM-CSF induziu maior número de células T CD4+ polifuncionais. Demonstramos também que a coadministração do plasmídeo que codifica GM-CSF, induz uma resposta imune celular de maior magnitude mesmo em uma condição de dose reduzida. Entretanto, observamos que esta citocina não é um bom adjuvante quando utilizamos como vetor de imunização um adenovírus que expressa os 18 epítopos / The formulation HIVBr18, previously developed and tested, is based on a DNA vaccine encoding 18 conserved and promiscuous HIV-1 CD4 epitopes and after immunization of transgenic mice for many human HLA class II molecules using this DNA vaccine, could be observed proliferation of CD4+ and CD8+ T cells and IFN-y production directed to multiple epitopes encoded by the vaccine. We intend to explore here, strategies based on fusion or combination of epitopes encoded by HIVBr18 vaccine with glycoprotein D (gD) of HSV- 1 and also the coadministration of cytokine-encoding plasmids (pIL-2, -12, -15 and pGM -CSF) aiming to enhance immunogenicity of HIVBr18. The DNA sequence of epitopes encoded by HIVBr18 vaccine was amplified by PCR and cloned into a plasmid that contained the sequence of gD, giving rise to plasmid pVAX-gDh-HIVBr18. After mice immunization, animals immunized with this construct showed similar immune response to the group that received HIVBr18, and also the group of animals that received gDh-HIVBr18 plasmid that had been modified by exchange in peptides order to assure to the molecule a better hydrophobic distribution and allow translocation to the extracellular face of cell membrane. We constructed and injected mice with a bicistronic plasmid expressing gDh and HIVBr18, simultaneously and isolated, but no increase in the magnitude of the immune response was observed. HIVBr18 coadministration with cytokine-encoding plasmids pIL-12, pIL-15 and pGM-CSF, provides an increase in the magnitude of immune response induced against the peptides encoded by the vaccine, and similar breadth. In addition, co-immunization with pGM-CSF induced greater number of polyfunctional CD4 + T cells. We also demonstrate that, even in a low dose approach coadministration of pGM-CSF induced a higher immune response than HIVBr18 alone in the same dose. However, we observed that this cytokine is not a good adjuvant when used in combination with an adenovirus that expresses the 18 HIV-1 epitopes.

A formulação HIVBr18, previamente desenvolvida e testada, é uma vacina de DNA que codifica 18 epítopos CD4, promíscuos e conservados do HIV-1, e que após imunização de camundongos transgênicos para diversas moléculas de HLA de classe II humanas, observou-se proliferação de linfócitos T CD4+ e CD8+ e produção de IFN-? direcionadas a múltiplos epítopos codificados pela vacina. Abordamos aqui estratégias baseadas na fusão ou combinação dos epítopos codificados pela vacina HIVBr18 à glicoproteína D (gD) do HSV-1, e também na coadministração de plasmídeos que codificam citocinas (IL-2, -12, -15 e GM-CSF) visando aumentar a imunogenicidade de HIVBr18. A sequencia de DNA que codifica os 18 peptídeos da vacina HIVBr18 foi amplificada por PCR e clonada em um plasmídeo que abrigava a sequencia da gD do HSV-1. dando origem ao plasmídeo pVAX-gDh-HIVBr18. Animais imunizados com gDh-HIVBr18 apresentaram resposta imunológica similar ao grupo que recebeu somente HIVBr18, não sendo diferente também daqueles que receberam plasmídeos gDh-HIVBr18 que sofreram alterações nas sequências para melhorar o padrão de distribuição hidrofóbica e permitir a migração da proteína de fusão para o meio extracelular. Construímos e testamos um plasmídeo bicistrônico que expressa gDh e HIVBr18 isoladamente, mas também não observamos aumento na resposta imune induzida. A coadministração com o plasmídeo HIVBr18 e plasmídeos que codificam as citocinas IL-12, IL-15 e GM-CSF, proporciona um aumento na magnitude da resposta imunológica induzida contra o pool de peptídeos codificados pela vacina, entretanto sem alteração da amplitude da resposta. Além disso, o plasmídeo de GM-CSF induziu maior número de células T CD4+ polifuncionais. Demonstramos também que a coadministração do plasmídeo que codifica GM-CSF, induz uma resposta imune celular de maior magnitude mesmo em uma condição de dose reduzida. Entretanto, observamos que esta citocina não é um bom adjuvante quando utilizamos como vetor de imunização um adenovírus que expressa os 18 epítopos / The formulation HIVBr18, previously developed and tested, is based on a DNA vaccine encoding 18 conserved and promiscuous HIV-1 CD4 epitopes and after immunization of transgenic mice for many human HLA class II molecules using this DNA vaccine, could be observed proliferation of CD4+ and CD8+ T cells and IFN-y production directed to multiple epitopes encoded by the vaccine. We intend to explore here, strategies based on fusion or combination of epitopes encoded by HIVBr18 vaccine with glycoprotein D (gD) of HSV- 1 and also the coadministration of cytokine-encoding plasmids (pIL-2, -12, -15 and pGM -CSF) aiming to enhance immunogenicity of HIVBr18. The DNA sequence of epitopes encoded by HIVBr18 vaccine was amplified by PCR and cloned into a plasmid that contained the sequence of gD, giving rise to plasmid pVAX-gDh-HIVBr18. After mice immunization, animals immunized with this construct showed similar immune response to the group that received HIVBr18, and also the group of animals that received gDh-HIVBr18 plasmid that had been modified by exchange in peptides order to assure to the molecule a better hydrophobic distribution and allow translocation to the extracellular face of cell membrane. We constructed and injected mice with a bicistronic plasmid expressing gDh and HIVBr18, simultaneously and isolated, but no increase in the magnitude of the immune response was observed. HIVBr18 coadministration with cytokine-encoding plasmids pIL-12, pIL-15 and pGM-CSF, provides an increase in the magnitude of immune response induced against the peptides encoded by the vaccine, and similar breadth. In addition, co-immunization with pGM-CSF induced greater number of polyfunctional CD4 + T cells. We also demonstrate that, even in a low dose approach coadministration of pGM-CSF induced a higher immune response than HIVBr18 alone in the same dose. However, we observed that this cytokine is not a good adjuvant when used in combination with an adenovirus that expresses the 18 HIV-1 epitopes.