Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2017-11-30T10:57:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Douglas Tomachewski.pdf: 4287227 bytes, checksum: 4ee4e1b519755860efa6f01d55b3569f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-30T10:57:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Douglas Tomachewski.pdf: 4287227 bytes, checksum: 4ee4e1b519755860efa6f01d55b3569f (MD5) Previous issue date: 2017-09-04 / A identificação de microrganismos, nas áreas da saúde e agricultura, é essencial para compreender a composição e o desenvolvimento do meio. Novas técnicas estão buscando identificar estes microrganismos com mais acurácia, rapidez e com menor custo. Uma técnica cada vez mais estudada e utilizada atualmente é a identificação de microrganismos através de espectros de massa, gerados por uma espectrometria de massa. Os espectros de massa são capazes de gerar um perfil para reconhecimento de um microrganismo, utilizando os picos referentes às mais abundantes massas moleculares registradas nos espectros. Analisando os picos pode-se designar um padrão, como uma impressão digital, para reconhecer um microrganismo, esta técnica é conhecida como PMF, do inglês Peptide Mass Fingerprint. Outra forma de identificar um espectro de massa, é através dos picos que são esperados que se apresentem no espectro, modelo qual este trabalho utilizou. Para prever os picos esperados no espectro, foram calculados os pesos moleculares estimados de proteínas ribossomais. Essas proteínas são denominadas house keeping, ou seja são presentes para o próprio funcionamento celular. Além de apresentarem grande abundância no conteúdo procariótico, elas são altamente conservadas, não alterando sua fisiologia para diferentes meios ou estágios celulares. Os pesos estimados formaram uma base de dados presumida, contendo todas as informações obtidas do repositório do NCBI. Esta base de dados presumida foi generalizada para taxonomia a nível de espécie, e posteriormente submetida à um aprendizado de máquina. Com isso foi possível obter um modelo classificatório de microrganismos baseado em valores de proteínas ribossomais. Utilizando o modelo gerado pelo aprendizado de máquina, foi desenvolvido um software chamado Ribopeaks, capaz classificar os microrganismos a nível de espécie com acurácia de 94.83%, considerando as espécies correlatas. Também foram observados os resultados a nível taxonômico de gênero, que obteve 98.69% de assertividade. Valores de massas moleculares ribossomais biológicas retiradas da literatura também foram testadas no modelo obtido, obtendo uma assertividade total de 84,48% para acertos em nível de espécie, e 90,51% de acerto em nível de gênero. / Identification of microorganisms in health and agriculture areas is essential to understand the composition and development of the environment. New techniques are seeking to identify these microorganisms with more accuracy, speed and at a lower cost. Nowadays, a technique that is increasingly studied and used is the identification of microorganisms through mass spectra, generated by mass spectrometry. The mass spectra are able to generate a recognition profile from a microorganism, using the referring peaks to the most abundant molecular masses recorded in the spectrum. By analyzing the peaks, it is possible to designate a pattern, such as a fingerprint, to recognize a microorganism; this technique is known as the Peptide Mass Fingerprint (PMF). Another way to identify a mass spectrum is through the peaks that are expected to appear in the spectrum, which model this work used. To predict the expected peaks in the spectrum, the estimated molecular weights of ribosomal proteins were calculated. These proteins are responsible for the cellular functioning itself, so-called housekeeping. Besides they being abundant in the prokaryotic content, they are highly conserved, not altering their physiology to different environments or cell stage. The estimated weights formed a presumed database, containing all the information obtained from the NCBI’s repository. This presumed database was generalized at the specie level and later submitted to a machine learning algorithm. With this, it was possible to obtain a microorganism’s classificatory model based on ribosomal proteins values. Using the generated model by the machine learning, a software called Ribopeaks was developed to classify the microorganisms at the specie level with an accuracy of 94.83%, considering the related species. It was also observed the results at genus level, which obtained 98.69% of assertiveness. Values of biological ribosomal molecular masses from the literature were also tested in the acquihired model, obtaining a total assertiveness of 84.48% at the specie level, and 90.51% at the genus level.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-08-11T13:24:14Z No. of bitstreams: 1 Diego Moura Santos. Avaliação... 2014.pdf: 3934510 bytes, checksum: 06fa6fa5250655c119370a03b641e2d0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-11T13:24:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Diego Moura Santos. Avaliação... 2014.pdf: 3934510 bytes, checksum: 06fa6fa5250655c119370a03b641e2d0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A leishmaniose é uma doença de escala global, que afeta 12 milhões de pessoas e pode causar um espectro de doenças que vai desde a forma cutânea localizada, que tende para a cura espontânea, até a forma visceral que é fatal. Apesar da gravidade da doença, até o momento não existe uma vacina efetiva para prevenir a leishmaniose. Dentre os antígenos promissores para o desenvolvimento de uma vacina, destacam-se as proteínas ribossomais (S4, S6, L3 e L5) e a KMP-11, uma proteína de superfície presente nos membros da família tripanosomatidae. Nosso estudo consistiu em avaliar os efeitos da imunização com estes antígenos frente ao desafio com L. major e com L. braziliensis, empregando modelos experimentais de infecção. Primeiramente, avaliamos a capacidade protetora dos antígenos ribossomais frente à infecção por L. major. Dos quatro antígenos avaliados, apenas L3 ou L5 foram capazes de prevenir o desenvolvimento da lesão e de diminuir a carga parasitária. A vacinação de camundongos com estes antígenos, na presença de CpG, induziu um perfil de resposta Th1, com elevada produção de IFN-γ, baixa produção de IL-10 e presença de anticorpos IgG2a. Em seguida, avaliamos a capacidade protetora dos antígenos L3 e L5 contra o desafio por L. braziliensis, na presença da saliva do vetor. A imunização com os antígenos L3 e/ou L5 também induziu uma elevada produção de IFN-γ, resultando em significativa redução na espessura da lesão e menor carga parasitária. Com relação ao antígeno KMP-11, investigamos a sua capacidade protetora utilizando duas estratégias vacinais: a estratégia homóloga que consistiu na imunização de camundongos com um plasmídeo de DNA que codifica KMP11 (DNA KMP-11) e a estratégia heteróloga que consistiu na imunização com nanopartículas de PLGA contendo DNA KMP-11, seguido de um reforço com nanopartículas contendo a proteína KMP-11 sob forma recombinante, na presença de CpG. As nanopartículas protegem o antígeno da degradação enzimática e promovem a liberação controlada deste, além de atuar como um adjuvante. Ambas as estratégias não impediram o desenvolvimento da lesão, após o desafio com L. braziliensis e na presença de saliva do vetor. Entretanto, os animais imunizados com a estratégia heteróloga apresentaram uma maior redução da carga parasitária comparado com o grupo imunizado pela estratégia homóloga. Este efeito foi associado com uma maior produção de IFN-γ e de TNF-α no sítio da infecção. Por fim, avaliamos a indução da resposta imune inata em macrófagos estimulados com KMP-11 encapsulados em nanopartículas. Observamos que a estimulação de macrófagos murinos com KMP-11, encapsulada em nanopartículas de PLGA, reduziu a carga parasitária intracelular e aumentou a produção de oxido nítrico, superóxido, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-1β, IL-18, CCL2/MCP-1, CXCL-1/KC sugerindo a indução de uma potente resposta imune inata. Assim, concluímos que os antígenos L3 e/ou L5 mostraram ser promissores para o desenvolvimento de uma vacina que proteja contra as principais espécies de Leishmania e que o encapsulamento de antígenos em nanopartículas é capaz de induzir uma forte resposta imune. Essa estratégia deve ser considerada quanto ao desenvolvimento de vacinas para a leishmaniose. / Leishmaniasis is a global disease affecting 12 million people and can cause diseases that range from self-healing localized cutaneous leishmaniasis to fatal visceral leishmaniasis. Despite the severity of the disease, there is no effective vaccine to prevent leishmaniasis. Among the promising antigens for the development of a vaccine, stand out the ribosomal proteins (S4, S6, L3, and L5) and KMP-11, a surface protein, widely found in the members of family Trypanosomatidae. Our study evaluated the effects of immunization with these antigens upon challenge with L. major and L. braziliensis, employing the experimental models of infection. First, we evaluated the protective ability of ribosomal antigens to infection by L. major. Among the four antigens examined only L3 or L5 were able to prevent lesion development and decrease the parasite load. Mice vaccinated with these antigens, plus CpG, developed a Th1-type response with high production of IFN-γ, low production of IL-10 and presence of IgG2a antibodies. Next, we evaluated the protective capacity of L3 and L5 antigens against challenge by L. braziliensis, in the presence of sand fly saliva. Vaccination with L3 or L5 also induced a high production of IFN-γ, resulting in significant inhibition of lesion development and lower parasite load. Regarding KMP-11, we investigated its protective capacity using two immunization strategies: the homologous strategy, which consisted in immunizing mice with a plasmid DNA encoding KMP-11(DNA KMP-11) while the heterologous immunization strategy consisted of inoculation of PLGA nanoparticles (NPs) containing DNA KMP-11 followed by a booster inoculation with nanoparticles containing recombinant KMP-11, in the presence of CpG. Nanoparticles protect the antigen from enzymatic degradation and promote controlled release, in addition to acting as an adjuvant. Lesion development was not inhibited following either immunization strategy, after challenge with L. braziliensis in the presence of sand fly saliva. However, animals immunized with the heterologous strategy showed a greater reduction in parasite load compared with the group immunized by the homologous strategy. This effect was associated with increased production of IFN-γ e TNF-α at the infection site. Finally, we evaluated the induction of the innate response in macrophages stimulated with KMP-11 encapsulated in NPs. We observed that stimulation of murine macrophages with KMP-11 encapsulated in NPs reduced the parasitic load and increased production of nitric oxide, superoxide, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-1β, IL-18, CCL2/MCP-1, CXCL-1/KC suggesting the induction of a potent innate immune response. We conclude that the L3 and/or L5 are promising antigens for the development of a vaccine that protects against the main species of Leishmania and that encapsulation of antigens into nanoparticles induces strong immune response. This strategy should be considered for the development of vaccines against leishmaniasis.