Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4538_1.pdf: 335564 bytes, checksum: 60bcb2cdd728f7696f5aef6b5468a9eb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As proteases constituem o grupo mais importante dentre as enzimas industriais, principalmente na indústria de detergentes. Uma fonte alternativa e potencial dessas enzimas são as vísceras de peixes, que constituem subprodutos da aqüicultura. O presente trabalho objetivou a avaliação da estabilidade das proteases de intestino de tilápia do Nilo, a segunda espécie de peixe exótico mais importante na aqüicultura brasileira, e a sua aplicação experimental como aditivo de detergentes através de planejamento estatístico fatorial 24. As proteases do Extrato Enzimático (E.E) foram parcialmente purificadas por tratamento térmico, apresentando um fator de purificação de 3,69 e rendimento de 103.41%. Estas enzimas mostraram atividade máxima e foram estáveis em pH 7,2-11 (120 mim), temperatura ótima de 55 °C e estabilidade a 35 e 45°C. Em presença de Saponin (1 % p/v) a atividade proteolítica foi estimulada aproximadamente 15%, enquanto que em Tween 20 e colato de sódio (1 % p/v) as proteases foram estáveis. O surfactante SDS (1 % p/v) inativou-as após 30 min. Em soluções de peróxido de hidrogênio a 5 % e 10 % (v/v) cerca de 65 % de atividade proteolítica foi mantida após 30 min de incubação. As proteases digestivas foram fortemente ativadas pelos íons Ca2+ e Mg2+ e a hidrólise dos substratos protéicos obedeceu a seguinte seqüência: caseína > azocaseína > hemoglobina > ovoalbumina > BSA.O modelo estatístico sugeriu que todos os fatores escolhidos (concentração do EE; concentração de detergente; tipo de detergente comercial;tempo de incubação) tiveram um impacto significante sobre a resposta atividade enzimática. A melhor condição para a utilização das proteases de tilápia do Nilo como aditivos de detergentes foi com extrato contendo 0,299 mg/mL de proteínas, solução do detergente comercial Astrus® (3,0 mg/mL), por 30 min

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9634_1.pdf: 1724275 bytes, checksum: d4312579b65180a327243bc502d0715f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Nos últimos anos, a aquicultura tem apresentado um rápido desenvolvimento, sendo a carcinicultura um dos segmentos mais lucrativos e crescentes. Apesar do progresso dessa atividade econômica, o custo com a alimentação dos animais ainda representa um dos principais problemas para os produtores. Com isso, a substituição da farinha de peixe, ingrediente mais caro da dieta dos camarões, por fontes protéicas alternativas tem sido cada vez mais frequente. Desta forma, objetivou-se avaliar o efeito da substituição da farinha de peixe por concentrado protéico de soja (SPC) nos níveis de 0% (C), 30% (S30), 60% (S60) e 100% (S100) sobre o desempenho das enzimas digestivas do Litopenaeus vannamei. Para tanto, espécimes com 2,02±0,51g foram submetidos às dietas experimentais ao longo de dez semanas. Após esse período, foi realizada a biometria dos animais. Hepatopâncreas de quinze camarões de cada tratamento foram coletados, homogeneizados em tampão Tris-HCl 10mM, pH 8,0 com adição de NaCl 15mM e centrifugados para obtenção dos extratos enzimáticos. Para a análise das enzimas digestivas presentes nos extratos enzimáticos realizou-se ensaios in vitro na presença dos substratos de cadeia longa (azocaseína 1% e amido 2%), p-nitroanilide (BApNA, SApNA e Leu-p-Nan) e &#946;-naphthylamide (alanina, arginina, leucina, tirosina, serina, glicina, isoleucina e histidina). Além disso, foram realizados SDS-PAGE e zimogramas de atividade proteolítica e amilolítica. Dentre os grupos experimentais o S100 apresentou maior ação enzimática quando empregado os substratos azocaseína 1% (1,18±0,01 U.mg-1) e amido 2% (5,04±0,33 U.mg-1) para a determinação da atividade proteolítica e amilolítica total, respectivamente. Maiores atividades de enzimas quimotripsina (13,78±1,61 U.mg-1) e leucino aminopeptidase (0,45±0,03 U.mg-1) utilizando os respectivos substratos SApNA e Leu-p-Nan foram observadas para o grupo controle (C). Enquanto que a mais elevada atividade tríptica (13,13±0,53 U.mg-1), usando BApNA como substrato, foi constatada para o tratamento S30. Entre os substratos &#946;-naphthylamide analisados, verificou-se valores mais altos de atividade aminopeptídica para arginina e alanina em todos os tratamentos, principalmente no S30 que também obteve maior atividade na presença da glicina (1,05±0,08 U.mg-1). Notou-se que para a serina, a atividade das aminopeptidases sofreu uma redução gradativa à medida que aumentou o nível de SPC na dieta dos camarões. O tratamento S60 apresentou maior atividade aminopeptídica para isoleucina (0,69±0,02 U.mg-1) e histidina (0,85±0,04 U.mg-1). Em relação à leucina e tirosina, a atuação das aminopeptidases mostrou-se indiferente estatisticamente às variações dietárias. De acordo com o perfil eletroforético dos extratos enzimáticos através de SDS-PAGE, foram observadas vinte e seis bandas protéicas, compreendidas entre 6,9 e 198,8 KDa, para todos os tratamentos. O zimograma de protease exibiu dois perfis semelhantes, um com dezoito (C e S30) e outro com doze bandas proteolíticas (S60 e S100). Enquanto que o zimograma de amilase revelou cinco bandas com atividade amilolítica para todos os tratamentos. A análise do ganho de peso corporal médio dos camarões cultivados mostrou valor mais elevado com o uso da dieta S30 (8,48±1,03 g), entretanto não foram evidenciadas diferenças significativas (P<0,05) entre os tratamentos. Os resultados expostos concluíram que a substituição da farinha de peixe por SPC em 30, 60 e 100% nas dietas dos camarões cultivados proporcionou um efeito positivo na performance dos animais. Esses resultados fornecem informações importantes quanto ao potencial do camarão-branco (L. vannamei) em utilizar formulações de alimentos alternativos com baixos níveis de fontes de proteína animal

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo67_1.pdf: 6414769 bytes, checksum: 24f17ceefe3d3e863030a711b06e4946 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste trabalho testou-se a aplicabilidade das proteases de vísceras de peixes como aditivo de detergentes em pó comerciais. Para extração das enzimas foram utilizadas vísceras de Colossoma macropomum (tambaqui) e de Cyprinus carpio (carpa), principal peixe nativo e segundo peixe exótico da aquicultura continental nacional, respectivamente, e de Diapterus rhombeus (carapeba prateada) e Lutjanus synagris (ariocó), peixes de grande importância para a pesca extrativa estuarina e marinha no nordeste brasileiro, respectivamente. A partir deste material obteve-se o extrato bruto. Em um primeiro estudo dos peixes dulcícolas, o extrato bruto passou por uma semi-purificação fracional com etanol. O extrato bruto obtido das vísceras da carapeba prateada, do ariocó e em um segundo estudo o de tambaqui foi inicialmente fracionado com sulfato de amônio e posteriormente purificado em colunas de gel-filtração e de afinidade. As frações obtidas da precipitação com etanol ou sulfato de amônio tiveram sua atividade enzimática e quantidade de proteínas determinadas para escolha da fração a ser trabalhada. A fração saturada com 30-70% de etanol apresentou maior atividade específica tanto no tambaqui quanto na carpa. A fração de sulfato de amônio com saturações de 30-60% para o tambaqui, 60-90% para a carapeba prateada e 40-80% para ariocó apresentou maior rendimento e foi a escolhida para os processos posteriores de purificação da enzima símile a tripsina dos peixes. Verificou-se em que temperatura e pH as proteases da fração com 30-70% de etanol e da enzima pura apresentavam maior atividade, além da sua estabilidade em relação a estes parâmetros. Para testar a compatibilidade com detergentes comerciais, foram utilizados quatro detergentes comerciais, cinco agentes surfactantes e peróxido de hidrogênio em diferentes concentrações. Os resultados obtidos sugerem que as proteases alcalinas encontradas nas vísceras dos peixes estudados apresentam características ideais para utilização na indústria de detergentes em pó, como: retenção de mais de 50% da sua atividade na presença de Surf® e na presença de 5% de H2O2 após 1 hora de incubação a 40ºC. Além disso, a atividade da enzima foi estimulada na presença de surfactantes não-iônicos (tween 20 e tween 80) e iônicos (saponin e colato de sódio)

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2017-06-30 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The increase in world cheese production, the scarcity of animal rennet, associated with the rejection of genetically modified proteases, encourages the search for new sources of milkclotting enzymes. Among fungi, edible mushrooms have stood out as alternative sources of peptidases that can be used as milk-clotting. This research aimed to evaluate the synthesis of proteases by six edible mushrooms from DPUA Culture Collection and select a milk-clotting producer species with physicochemical characteristics for cheese production. The submerged fermentation was carried out in GYP medium (glucose, yeast extract and peptone) with 0.5% (w/v) of gelatine. The edible mushroom that produced proteases with higher coagulant ratio in the liquid medium was cultivated in Amazon agroindustrial wastes as substrate: angelim sawdust, cupuaçu, exocarp of tucumã, banana leaf and açai seeds, supplemented with rice bran. The proteolytic activity was determined using 1% (w/v) of azocasein as substrate and the determinination of milk-clotting activity was used 10% (w/v) of skimmed milk solution as substrate. Some parameters were used to evaluate the influence of milk-clotting enzymes production (pH of the culture medium, fermentation time, size and age of the inoculum). The enzymes were characterized according to optimums pH and temperature, pH and temperature stabilities, and effect of metallic ions and inhibitors. The cytotoxic effect of the selected mushroom crude extract was evaluated in human MRC-5 fibroblast. The analysis of centesimal and microbiological composition was determined in the elaborated cheese. In submerged fermentation conditions, Pleurotus albidus was the best protease producer (34.00 U/mL) and the synthesis of theses enzymes were stimulated by culture age (10 days) e inoculum volume [5% (p/v)]. The enzymes showed optimum activities at pH 5 and 60°C, with stabilies at pH 5 to 8 and 30°C to 60°C, being classified as cysteine and serine proteases. The milk-clotting enzymes from Pleurotus albidus expressed the highest coagulant ratio (21.60) with maximum activity at 60 °C and pH 6. Iodoacetic acid was the inhibitor of higher action in the proteolytic activity suggesting the presence of cysteine proteases. Pleurotus albidus milk-clotting enzymes showed no toxicity against human fibroblasts (MRC5). In the solid fermentation, Pleurotus albidus presented high enzyme production in the mixture composed by açai seeds and rice bran (90:10, w/w). The milk-clotting enzymes demonstrated coagulant ratio of 14.58, abundant whey formation and strong coagulation in milk solution. The best conditions to milk-clotting enzymes production were: inoculum with 10 days of age, culture medium at pH 6 and inoculum size of 2.5% (p/v). The enzymes exhibited maximum catalytic activity at pH 5 and 55 ° C with stability until 45°C. They were completely inhibited by iodoacetic acid. The cheese produced with Pleurotus albidus milk-clotting enzymes as coagulant agent demonstrated contents of moisture, lipid and protein of 55%, 20% and 18%, respectively. The microbiological analysis showed that the cheese was under the standards required by Brazilian legislation. Pleurotus albidus is a potential source of coagulant that can be applied in dairy industry, especially in the manufacture of cheese. / O aumento da produção mundial de queijos, a escassez do coalho animal e a rejeição de proteases geneticamente modificadas, incentiva a busca por novas fontes de coagulantes do leite. Dentre os fungos, os cogumelos têm se destacado como fonte alternativa de peptidases coagulantes para aplicação na indústria de laticínios. Esta pesquisa teve como objetivo avaliar a síntese de proteases por seis cogumelos do acervo da Coleção de Culturas DPUA para selecionar uma espécie produtora de coagulante com características físico-químicas para elaboração de queijo. A fermentação em meio líquido foi realizada em GYP [(20 g de glicose, 5 g de extrato de levedura, 15 g de peptona/1000 mL de água)], com 0,5 % de gelatina (p/v). O macrofungo produtor de proteases com elevada razão coagulante, em meio líquido, foi cultivado em resíduos lignocelulósicos amazônicos: serragem de angelim, exocarpos de cupuaçu e tucumã, engaço de banana e semente de açaí, suplementados com farelo de arroz. As atividades proteolítica e coagulante foram determinadas utilizando como substratos azocaseína 1% (p/v) e leite desnatado em pó a 10% (p/v), respectivamente. Os parâmetros que influenciam a produção de coagulantes (pH do meio de cultivo, tempo de fermentação, tamanho e idade do inóculo) foram avaliados. O coagulante foi caracterizado quanto ao pH e temperatura ótimos, estabilidade ao pH e à temperatura, e efeito de íons metálicos e inibidores. A citotoxicidade do coagulante foi avaliada em fibroblastos humanos MRC-5. No queijo elaborado com o coagulante foi determinada a composição centesimal e a microbiológica. Na fermentação submersa, Pleurotus albidus foi o produtor significativo de proteases (34,00 U/mL) e a síntese dessas enzimas foi estimulada pela idade (10 dias) e volume do inóculo (5%, p/v). As proteases mostraram atividade ótima em pH 5 a 60°C, estabilidade em pH (5-8), temperatura de 30°C até 60°C, sendo classificadas como cisteíno e serinoproteases. O coagulante de Pleurotus albidus expressou razão coagulante de 21,60 com máxima atividade a 60 °C, pH 6. Ácido iodoacético inibiu significativamente a atividade coagulante, sugerindo maior quantitativo de cisteínoproteases. As enzimas de Pleurotus albidus não apresentaram toxicidade contra fibroblastos humanos (MRC5). Em matriz sólida, Pleurotus albidus cultivado em semente de açaí e farelo de arroz (90:10, p/p) produziu protease com elevada razão coagulante (14,58), formação de soro abundante e forte coagulação. As condições ideais para produção do coagulante foram: inóculo (10 dias de idade), meio de cultivo pH 6, tamanho do inóculo (2,5%, p/v) e idade do inóculo 10 dias. O coagulante exibiu máxima atividade em pH 5, a 55 °C, com estabilidade até 45 °C, sendo inibido por ácido iodoacético. O quejo elaborado apresentou umidade (55%), lipídios (20%), proteínas (18%) e atendeu aos padrões microbiológicos exigidos pela legislação brasileira. Pleurotus albidus é uma fonte de coagulante que pode ser aplicada na indústria de laticinios, em especial na fabricação de queijo.

Allergen proteases from a number sources including the filamentous fungus A. fumigatus, are thought to be important in the development of severe asthma through protease dependent interactions with the respiratory epithelium. The first aim of the thesis was to determine the effect of a variety of growth substrates on the secretion of proteases from different strains of A. fumigatus. The second aim was to investigate the effects of recombinant allergen proteases Asp f 5 and Asp f 13 expressed in the P. pastoris protein expression system and crude A. fumigatus culture supernatants on airway epithelial cells and determine whether protease induced interleukin 8 (IL-8) release from airway epithelial cells was dependent on the activation of protease activated receptor 2 (PAR-2).Results demonstrated that the AF293 strain of A. fumigatus secreted serine proteases during growth on pig lung homogenate medium and metalloproteases during growth on a casein based medium but suppressed protease secretion in Vogel's minimal medium. Analysis of the secretion and RNA levels of proteases in A. fumigatus showed that the matrix metalloprotease, Asp f 5 and the serine protease, Asp f 13 were up-regulated and secreted during growth in pig lung medium and that the matrix metalloprotease, Lap1 was up-regulated and secreted along with Asp f 5 and Asp f 13 in casein medium. This finding was confirmed using protease inhibitors and by using strains of A. fumigatus in which Asp f 5 and Asp f 13 genes were disrupted. These results suggest that A. fumigatus was able to detect different complex proteins available as substrates in its environment and regulate protease secretion accordingly. Furthermore, in several strains of A. fumigatus, protease activity was not suppressed by growth in Vogel's medium, suggesting differences in the regulation of protease secretion between strains. Both A. fumigatus culture supernatants and recombinant Asp f 5 and Asp f 13 produced in P. pastoris caused epithelial airway cell desquamination, and IL-8 release in a protease and dose-dependent manner. In addition, both recombinant Asp f 5 and Asp f 13 were both shown to cleave PAR-2 at a site that resulted in receptor activation.In conclusion, differences in the secretion of proteases between A. fumigatus strains and during growth of A. fumigatus on different media suggests a requirement for the standardisation of the preparation of A. fumigatus allergen extracts used both in clinical diagnosis of A. fumigatus allergy and in vitro and in vivo research studies. Furthermore, it is proposed that allergen proteases secreted by A. fumigatus may interact with a variety of host proteins including, matrix molecules, enzymes and receptors which may exacerbate allergic airway diseases.

Biofilms are bacterial communities that adhere to biotic and abiotc surfaces, and are embedded in a polymeric matrix composed mainly of polysaccharides and proteins. Not only are biofilms a public health problem, but they are also a hindrance in industrial practices. Due to their intractability by conventional cleaning agents, a number of alternative agents, including enzymes, have been investigated as potential biofilm detachment-promoting agents. Two major types of enzymes, i.e. proteases and polysaccharases, have been used for biofilm removal and their use is aimed at degrading or promoting the collapse of the biofilm matrix. Consequently, the aim of this investigation was primarily to assess the use of enzymes originating from a wastewater biofilm to remove biofilms from three Pseudomonas species, viz. P. aeruginosa PAO1, P. fluorescens and P. putida. To investigate, biofilms were sampled from an aerobic reactor at an industrial wastewater treatment plant. Dissolution of the biofilm, as evidenced by reductions in the soluble chemical oxygen demand (COD) and total suspended solids (TSS), coincided with detectable protease and carbohydrate-degrading enzyme activities. Crude extracellular enzyme extracts prepared from the wastewater biofilm were subsequently shown to remove P. aeruginosa PAO1 biofilms from a glass surface, suggesting that the wastewater biofilms expressed enzymes that may be used towards the removal of detrimental biofilms. Consequently, representative bacteria were isolated from the wastewater biofilm and, based on 16S rRNA gene sequencing and analyses, were found to represent four major phylogenetic divisions of bacteria, i.e. Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes. Screening of the bacterial isolates for different enzyme activities indicated that nine isolates produced proteases, while ten isolates produced polysaccharide-degrading enzymes that comprised amylase, xylanase, cellulase, á-glucosidase and â-glucosidase. The ability of these enzymes to degrade proteins and polysaccharides present in purified EPS from P. aeruginosa PAO1, P. putida and P. fluorescens was confirmed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and an increase in the amount of reducing sugar, respectively, while their efficacy to remove single-and multi-species biofilms cultured in microtiter plates was evaluated using a quantitative spectrophotometric assay. Proteases produced by four of the strains were effective in degrading the EPS proteins of all three Pseudomonas spp., while all bacterial strains that produced polysaccharide-degrading enzymes were capable of degrading the EPS polysaccharides, albeit with different efficiencies. Efficient removal of P. aeruginosa PAO1 biofilms was only achieved when mixtures of enzyme extracts, containing protease and different types of polysaccharase activities, were used. Biofilms of P. putida and P. fluorescens were readily removed with single enzyme extracts prepared from B. subtilis and B. pumilus. Enzyme combinations showing high biofilm removal for all three Pseudomonas species were tested against a mixed species biofilm. These enzyme extracts yielded lower biofilm removal efficiencies than those obtained for mono-species pseudomonad biofilms, possibly due to the heterogenous nature of the EPS. Nevertheless, it may be possible that the enzymes identified in this study could be used in combination with other treatments to increase the biofilm removal effectiveness or in combination with other enzymes to degrade the mixture of proteins and polysaccharides present in the EPS of multi-species biofilms. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2011. / Microbiology and Plant Pathology / unrestricted

High molecular weight mouse nerve growth factor(H M W-NGF), in addition to its effects on certain neural elements, is also chemotactic for human polymorphonuclear leukocytes. One of the subunits of H M W-NGF is a protease of the serine family and its active site contains a serine residue and a closely-neighboring histidine residue that are both essential for proteolysis. Elimination of enzyme activity by irreversibly blocking the single serine has no effect on leukotaxis, but blocking the histidine abolishes leukotaxis. These results suggest the possibility that part of the proteolytic active site of this enzyme may have evolved to perform more than one, completely different, biologic function - proteolysis as well as nonproteolytically mediated chemotaxis.

No / Streptococcus mutans was shown to produce two extracellular proteases capable of degrading both gelatin and collagen-like substrates. These enzymes have molecular masses of 52 and 50 kDa when analysed by SDS-PAGE. Both enzymes were inhibited by EDTA, but not by a range of other inhibitors with different specificities, indicating that they are metalloproteases. The activity of EDTA-inactivated enzymes could be restored by the addition of manganese and zinc. The identical inhibition and restoration profiles of the two enzymes suggest that one of the proteases may be a degradation product of the other.

O filo Cyanobacteria constitui um grupo filogeneticamente coerente, embora, apresente grande diversidade morfológica, sendo sua sistemática constantemente revisada. Esses micro-organismos são, ainda, alvos de estudos biotecnológicos em razão da produção de toxinas e na busca por substâncias de interesse farmacológico. Dentre as linhagens analisadas neste estudo, sete sequências do gene rRNA 16S foram geradas e avaliadas com sequências previamente obtidas. Ao menos dois grupos podem representar novos gêneros de cianobactérias, sendo que um grupo demonstra ser endêmico de manguezais brasileiros. Os genes de inibidores de proteases, aeuruginosina, cianopeptolina e microviridina, foram detectados e a produção de aeruginosina foi confirmada por LC-MS nos gêneros Cyanobium e Nostoc. Sequências de aminoácidos do precursor de microviridina indicaram a produção de três novas variantes em quinze linhagens de cianobactérias dos gêneros Cyanobium, Synechococcus, Cyanobacterium, Nodosilinea e Nostoc. O potencial genético para produção de cilindrospermopsina (cyrJ) foi confirmado em vinte e seis linhagens. Em cinco linhagens dos gêneros Cyanobium e Nostoc foram encontrados os genes mcyD, mcyE e mcyG, envolvidos na biossíntese de microcistina. A sequência McyG da linhagem Nostoc sp. CENA175 agrupou-se filogeneticamente com outras de linhagens produtoras de microcistina. Os genes sxtA e sxtI, envolvidos na biossíntese de saxitoxina, foram encontrados em nove linhagens dos gêneros Cyanobium, Oxynema, Leptolyngbya, Nodosilinea e Nostoc. A sequência de SxtI da linhagen Leptolyngbya sp. CENA134 apresentou similaridade >= 70 % com proteínas hipotéticas enquanto as de Nostoc sp. CENA159 e Nostoc sp. CENA160 apresentaram similaridade >= 82 % com O-carbamoiltransferase. Na análise filogenética, a sequência de SxtI da linhagem Nostoc sp. 160 agrupou-se com sequências de linhagens produtoras de saxitoxina. Nas análises químicas, a fração 3 do extrato da linhagem Oxynema sp. CENA135 revelou uma substância com características de ácidos graxos poli-insaturados e a fração 2 do extrato da linhagem Nostoc sp. CENA175 apresentou uma estrutura aromática ligada a uma cadeia alifática. Outros três extratos, obtidos das linhagens Cyanobium sp. CENA157, Nodosilinea sp. CENA183 e Nostoc sp. CENA184 mostraram-se promissores quanto à presença de substâncias nitrogenadas. Os ensaios de bioatividade revelaram que 48 % dos extratos metanólicos inibiram o crescimento de ao menos um isolado de bactéria e/ou levedura. Os extratos das linhagens Cyanobium sp. CENA142 e Cyanobacterium sp. CENA169 foram eficientes contra o crescimento de seis bactérias patogênicas. Nos ensaios de inibição de células tumorais, o extrato de DCM da linhagem Cyanobium sp. CENA154 (100 ?gomL-1) inibiu moderadamente culturas de células 3LL. Os extratos etanólicos de Oxynema sp. CENA135 (20 ?gomL-1) e Cyanobium sp. CENA154 (100 ?gomL-1) inibiram as células CT-26. Em ensaios conduzidos com linhagens de células de glioma (U251), câncer de mama (MCF-7) e câncer de pulmão (NCI-H460), o extrato de DCM da linhagem Cyanobium sp. CENA136 inibiu 50 % do crescimento das respectivas células tumorais nas concentrações 7,8; 27,1 e 14,0 ?gomL-1. Desta forma, além de filogeneticamente diversas, as cianobactérias isoladas de ambiente marinho do Estado de São Paulo constituem fonte promissora de inibidores de proteases, cianotoxinas e substância bioativas com ação antibacteriana, antifúngica e antitumoral. / The phylum Cyanobacteria is a phylogenetically coherent group, although presenting great diversity, and its systematic have been constantly reviewed. These microorganisms are also targets of biotechnological studies due to the production of toxins and the search for novel substances of pharmacological interest. Among the strains analyzed in this study, sequences of the 16S rRNA gene were generated for seven and, than, analyzed with sequences previously obtained. At least two groups may represent new cyanobacterial genera, while a group of Cyanobium proves to be endemic of Brazilian mangroves. Genes of the proteases inhibitors, aeuruginosin, cyanopeptolin and microviridin, were detected and the production of aeruginosin was confirmed by LC-MS for Nostoc and Cyanobium. The amino acid sequences of microviridin precursor indicated the production of three new variants in fifteen cyanobacterial strains of the genera Cyanobium, Synechococcus, Cyanobacterium, Nostoc and Nodosilinea. The genetic potential for production of cylindrospermopsin (cyrJ) was confirmed in twenty-six strains. In five strains of the genera Nostoc and Cyanobium the mcyD, mcyE and mcyG genes, which are involved in the microcystin biosynthesis, were found. The McyG sequence of Nostoc sp. CENA175 was phylogenetically grouped with sequences of microcystin-producing strains. The sxtA and sxtI genes, from saxitoxin biosynthesis, were found in nine strains of the genera Cyanobium, Oxynema, Leptolyngbya, Nodosilinea and Nostoc. The SxtI sequence of Leptolyngbya sp. CENA134 showed similarity >= 70 % with hypothetical proteins, while the sequences of Nostoc sp. CENA159 and Nostoc sp. CENA160 showed similarity >= 82% with O-carbamoyltransferase. In the phylogenetic analysis, the SxtI sequence of Nostoc sp. CENA160 grouped with sequences of strains that produce saxitoxin. In chemical analysis, the fraction 3 of the Oxynema sp. CENA135 extract revealed a substance with poly-unsaturated fatty acids characteristics and the fraction 2 of Nostoc sp. CENA175 extract indicated an aromatic structure, attached to an aliphatic chain. Other three extracts obtained from Cyanobium sp. CENA157, Nodosilinea sp. CENA183 and Nostoc sp. CENA184 were promising for the presence of nitrogenous substances. Bioactivity assays revealed that 48 % of the methanolic extracts inhibited the growth of at least one isolate of bacteria and/or yeast. The extracts of Cyanobium sp. CENA142 and Cyanobacterium sp. CENA169 were efficient against six pathogenic bacteria. In the inhibition assays of tumor cells, the DCM extract of Cyanobium sp. CENA154 (100 mgomL-1) moderately inhibited the growth of 3LL cells. Ethanol extracts of Oxynema sp. CENA135 (20 mgomL-1) and Cyanobium sp. CENA154 (100 mgomL-1) were able to inhibit cultures of CT- 26 cells. In tests conducted with glioma cell lines (U251), breast cancer (MCF-7) and lung cancer (NCI-H460), the DCM extract of Cyanobium sp. CENA136 caused 50 % of growth inhibition, respectively, when used at concentrations of 7.8, 27.1 and 14.0 mgomL-1. Thus, besides their phylogenetically diversity, the cyanobacteria strains from marine environment of the São Paulo state are a promising source of protease inhibitors, cyanotoxins and bioactive compounds with antibacterial, antifungal and antitumor activities.

Importantes estudos voltados para a análise das secreções de anfíbios fundamentam-se na grande quantidade de componentes biologicamente ativos presentes nas mesmas, tais como aminas biogênicas, esteróides, aminopolissacarídeos, glicosídeos, inibidores de proteases e diversos outros compostos, responsáveis pela complexa sintomatologia observada no envenenamento. O gênero Bufo apresenta diversas moléculas em suas excreções que podem ser divididas em categorias como aminas biogênicas, bufadienolídeos (bufogeninas), esteróides (bufotoxinas), alcalóides, peptídeos e proteínas. Marongio (2006) verificou que o veneno do sapo Bufo paracnemis, hoje classificado como Rhinella schneideri, apresenta componente ativo sobre a via clássica do sistema complemento (SC), necessitando de melhores estudos e caracterização. Os objetivos deste trabalho foram, portanto, o isolamento e caracterização química do componente do veneno de Rhinella schneideri responsável pelos efeitos observados sobre o sistema complemento. Para a purificação, o veneno foi inicialmente submetido a uma cromatografia catiônica (CM-Celulose-52), obtendo-se 7 frações denominadas C1, C2, C3, C4, C5, C6 e C7. A fração C1 foi cromatografada em resina aniônica (DEAE-SepharoseTM), resultando em 4 subfrações denominadas D1, D2, D3, e D4. A subfração D3 apresentou atividade sobre o sistema complemento e foi submetida a uma Gel Filtração (SephacrylTMS-200), fornecendo 5 subfrações denominadas S1, S2, S3, S4, e S5. As subfrações S2 e S5 induziram redução da atividade hemolítica das vias clássica/lectinas. Ambas apresentaram resultados positivos nos ensaios de migração de neutrófilos e imunoeletroforese bidimensional. No ensaio de capacidade geradora de SC5b-9, a subfração S2 apresentou maior significância frente as demais subfrações utilizadas. Visando esclarecer o mecanismo de ação das subfrações ativas sobre o sistema complemento, testes de determinação da atividade proteolítica ou inibitória de proteases (tripsina, quimotripsina e elastase) foram realizados. No entanto, nas concentrações utilizadas, as amostras não mostraram atividade proteolítica ou inibitória de protease. Os compostos isolados foram também submetidos ao sequenciamento amino-terminal inicial. Foi possível a identificação dos primeiros 15 aminoácidos da banda protéica majoritária do gel de poliacrilamida e 10 e 5 aminoácidos das subfrações S2 e S5, respectivamente. No entanto, os resultados de sequenciamento N-terminal apresentaram baixa confiabilidade, devido à baixa quantidade de material utilizada. Neste trabalho foram isolados e caracterizados dois compostos capazes de induzir a ativação do sistema complemento. Esta ação foi evidenciada, após exposição do soro humano normal às subfrações, por induzirem à formação do complexo SC5b-9 e aumentarem a migração de neutrófilos, provavelmente por induzirem a formação de fatores quimiotáticos. Este estudo permitiu avaliar melhor alguns componentes presentes na complexa mistura que é o veneno de Rhinella schneideri, que, no futuro, poderão se tornar ferramentas farmacológicas importantes para o estudo de diversas patologias relacionadas ao sistema complemento. / Important studies focused on amphibians secretions analysis are based on large amount of biologically active components present in them, such as biogenic amines, steroids, polysaccharide amine, glycosides, protease inhibitors and several other compounds, responsible for complex symptomatology observed in the envenomation by Bufo paracnemis. The genus Bufo presents several molecules in their excretions that can be divided into categories such as biogenic amines, bufadienolides (Bufogenin), steroids (Bufotoxins), alkaloids, peptides and proteins. Marongio (2006) found in one of his studies the toad poison of Bufo paracnemis, now classified as Rhinella schneideri, has an active component of the classical pathway of the complement system (SC), which needs further studies and characterization. The purification process of this study was accomplished through cation chromatography (CM-Cellulose-52), and seven fractions were obtained, called C1, C2, C3, C4, C5, C6 e C7. The fraction C1 was chromatographed on anion-exchange resin (DEAE- SepharoseTM) resulting in 4 subfractions referred to as D1, D2, D3, and D4. The subfraction D3 showed activity on complement system and was subjected to gel filtration (SephacrylTMS-200) giving 5 subfractions termed S1, S2, S3, S4, and S5. The subfractions S2 and S5 induced reduction of the hemolytic activity of the classical/lectin pathway. Both showed positive results in the assays of migration of neutrophils and bidimensional immunoelectrophoresis. In the assay of generating capacity of SC5b-9, the subfraction S2 presented greater significance when compared to the other used subfractions. Aiming to clarify the action mechanism of the active subfractions on the complement system, tests of determination of the proteolytic or inhibitory activity of proteases (trypsin, chymotrypsin and elastase) had been done. However, in the used concentrations, the samples had not shown proteolytic or inhibitory activity of protease. The isolated compounds also had been submitted to the initial amino-terminal sequence. The identification of the first 15 aminoacids of the major proteinic band of the polyacrylamide gel and 10 and 5 aminoacids of the subfractions S2 and S5 was possible, respectively. However, the sequence of N-terminal results had presented low trustworthiness, due to the low amount of used material. In this work, were isolated and characterized two capable compounds to induce the activation of the complement system. This action was evidenced, after exposition of the normal human serum to the subfractions, for inducing to the formation of the SC5b-9 complex and will increase the migration of neutrophils, probably because they can induce the formation of chemotactic factors. This study allowed a better evaluation of some components present in the complex mixture which is the poison of Rhinella schneideri, that, in the future, important pharmacological tools for the study of diverse pathologies related the complement system.