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PERDIGÃO NETO, Lauro Vieira. Aspectos clínicos, epidemiológicos e laboratoriais da criptococose no Estado do Ceará entre os anos de 1985 e 2010, bem como efeitos de antirretrovirais inibidores de protease sobre virulência e crescimento de Cryptococcus neoformans in vitro. 2011. 124 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-06-26T15:13:50Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_lvperdigão neto.pdf: 1531970 bytes, checksum: 9be3744624b4fefb6cfc150fa1399c30 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-07-04T16:13:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_lvperdigão neto.pdf: 1531970 bytes, checksum: 9be3744624b4fefb6cfc150fa1399c30 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-04T16:13:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_lvperdigão neto.pdf: 1531970 bytes, checksum: 9be3744624b4fefb6cfc150fa1399c30 (MD5) Previous issue date: 2011 / A criptococose é a infecção causada a partir da inalação de leveduras do gênero Cryptococcus. A doença costuma acometer mais freqüentemente pacientes com alguma imunodepressão e evoluir de forma subaguda ou crônica. Tem predileção por sistema nervoso central, manifestando-se como meningite, mas também pode apresentar-se como doença pulmonar ou de forma disseminada, com envolvimento de outros órgãos. A atividade proteolítica em leveduras do gênero Cryptococcus tem sido associada a sua patogenicidade. A atividade da enzima fosfolipase também se faz importante para este gênero, uma vez que está relacionada à nutrição e à capacidade invasiva do microrganismo. Outro mecanismo de virulência de maior relevância para a patogenicidade de Cryptococcus spp. é a cápsula polissacarídica presente em sua superfície, responsável principal pelo escape aos mecanismos de defesa do hospedeiro. Esta pesquisa teve como objetivo traçar um perfil clínico, epidemiológico e laboratorial dos pacientes com criptococose entre os anos de 1985 e 2010, bem como investigar os efeitos dos inibidores de protease Saquinavir, Darunavir, Ritonavir e Indinavir sobre o crescimento, espessura da cápsula, atividade de protease e expressão de fosfolipase em cepas de Cryptococcus neoformans isoladas de humanos. A comparação entre grupo soropositivo para o HIV com grupo soronegativo mostrou que o primeiro apresenta maiores médias de idade e maior freqüência de sexo masculino acometido; por outro lado, o grupo soropositivo demonstra menores proteinorraquia e celularidade no líquor, bem como menores valores de leucometria e plaquetometria em sangue periférico. Após a realização do teste de sensibilidade por microdiluição em caldo, os fungos foram expostos a três concentrações distintas dos fármacos e avaliados com relação à expressão das duas enzimas e espessura da cápsula. Os resultados mostraram inibição significativa (p<0,05) da atividade de protease pelo menos na maior concentração testada para todas as drogas, bem como estreitamento da cápsula em algumas combinações de drogas e cepas. Por outro lado, quanto à atividade de fosfolipase, observou-se um aumento na expressão dessa enzima, especialmente nas concentrações mais elevadas das quatro drogas. Conclui-se, portanto, que apesar de estes antirretrovirais não inibirem o crescimento de Cryptococcus neoformans, são capazes de alterar mecanismos de virulência destas leveduras.

ROCHA, A. J. Análise da expressão gênica de proteinases cisteínicas relacionadas à morte celular programada e à maturação de proteínas de reservas em sementes de pinhão manso (Jatropha curcas L.). 2012. 82 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-10-17T17:51:28Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_ajrocha.pdf: 2494116 bytes, checksum: 8d45cb432b74c4d7ee84ba4bfd88eb80 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-11-11T23:17:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_ajrocha.pdf: 2494116 bytes, checksum: 8d45cb432b74c4d7ee84ba4bfd88eb80 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-11T23:17:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_ajrocha.pdf: 2494116 bytes, checksum: 8d45cb432b74c4d7ee84ba4bfd88eb80 (MD5) Previous issue date: 2012 / Jatropha (Jatropha curcas L) is an oilseed plant with great potential for biofuel production because of the wealth of existing lipids in their seeds. Therefore, it is a potential source of renewable oil that has received considerable attention from the scientific community. The objective of this study was to analyze the gene expression of cysteine ​​proteinases related to programmed cell death (PCD) in developing seeds and during germination of Jatropha in order to better understand the transcriptome of the major genes involved in the MCP and during the deposition of protein reserves during maturation of seeds of Jatropha. To accurately quantify the levels of gene expression by RT-qPCR was necessary to make a selection of reference genes (genes constituting). The constituent genes chosen for this study were: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), polyubiquitin (PUB), alpha-tubulin (TA2), protein phosphatase 2 A (PP2A2), elongation factor-alpha (EF1-α) and actin, all cited in the literature and were chosen for study standardization of genes into plants. Through the program of geNorm was possible to show the more stable reference genes among the six genes of reference. Our results indicate that the most stable reference genes for samples of the developing endosperm and integument were: GAPDH, PP2A2 and EF1-α and TA2. The genes were less stable: the actina11; polyubiquitin (PUB). In germination, the most stable genes were GAPDH, PUB and TA2. However, genes with lower stability values ​​were actin, EF1-α and PP2A2. In our studies, the geNorm program also showed the number of reference genes needed for normalization of data obtained by RT-qPCR. In the analysis of this study, we show that for the developing seeds, the use of four most stable genes were GAPDH, PP2A2 and EF1-α and TA2 needed for normalization of RT-qPCR data. In the data of germinating seeds, was the adoption of more stable three genes (GAPDH, PUB and TA2). However, To validate our findings with reference genes, we used the standard profile of gene expression which expresses oleosina, which showed that the expression pattern of oleosina is provided according to the literature, genes reveals that the reference are efficient to normalize the data obtained by RT-qPCR. With these results, we carried out a study of expression of genes supposedly involved in programmed cell death and maturation of seeds of Jatropha. Our results showed that genes with sequence C-terminal KDEL: JcCB0580861; JcCA0152821; JcCA0047111 and γ-VPE gene JCCB0060111 showed high levels of expression in later stages in tissues of the integument and endosperm of seeds of Jatropha in developing and Based on our analysis, these genes express cysteine ​​proteinases that are possibly involved in the MCP. Nevertheless, genes that express the following VPEs: JcCB0196871; JcCB0244081, and JcCA0012422 according to our studies, are probably involved in the maturation of protein reserves in developing seeds of Jatropha. These data provided important information about the expression pattern of genes that are involved in the transcriptome of developing seed, more specifically involved in the process of MCP. However, the study of standardization and validation of reference genes in tissues of the integument and endosperm Jatropha provided a better understanding as regards the stability of these genes in the studied conditions. / O pinhão manso (Jatropha curcas L) é uma planta oleaginosa com grande potencial para a produção de biocombustível devido à riqueza de lipídios existente em suas sementes. Portanto, é uma fonte potencial de óleo renovável que tem recebido considerável atenção da comunidade científica. O objetivo deste estudo foi fazer uma análise da expressão gênica de proteinases cisteínicas relacionadas à morte celular programada (MCP) em sementes em desenvolvimento e durante a germinação de pinhão manso, no intuito de conhecer melhor o transcriptoma dos principais genes envolvidos no processo de MCP e durante a deposição de proteínas de reservas durante a maturação das sementes de pinhão manso. Para quantificar com acurácia os níveis de expressão gênica por RT-qPCR foi necessário realizar uma seleção de genes de referência (genes constitutivos). Os genes constitutivos escolhidos para esse estudo foram: Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), Poliubiquitina (PUB), alfa-tubulina (TA2), proteína fosfatase 2-A (PP2A2), fator de alongação-alfa (EF1-α) e actina, todos eles citados e escolhidos na literatura para estudo de normalização de genes em plantas. Através do programa geNorm de foi possível mostrar os genes de referência mais estáveis dentre os seis genes de referência. Nossos resultados apontaram que os genes de referência mais estáveis ​​para as amostras de endosperma e integumento em desenvolvimento foram: GAPDH, PP2A2 e EF1-α e TA2. Os genes de menor estabilidade foram: a actina11; poliubiquitina (PUB). Na germinação, os genes mais estáveis foram GAPDH, PUB e TA2. Entretanto, os genes com menores valores de estabilidade foram a actina, EF1-α e PP2A2. Em nossos estudos, o programa geNorm também mostrou o número de genes de referência necessários para a normalização dos dados obtidos por RT-qPCR. Na análise desse estudo, nos mostramos que para as sementes em desenvolvimento, a adoção de quatro genes mais estáveis foram GAPDH, PP2A2 e EF1-α e TA2 necessários para normalização dos dados de RT-qPCR. Nos dados de sementes em germinação, mostrou-se a adoção de três genes mais estáveis ​​(GAPDH, PUB e TA2). Contudo, Para validar nossos resultados com genes de referência, foi usado o perfil padrão da expressão do gene que expressa a oleosina, na qual mostrou que o padrão de expressão da oleosina está de acordo com os fornecidos pela literatura, revelando que os genes de referência são eficientes para normalizar os dados obtidos pela RT-qPCR. De posse desses resultados, realizou-se um estudo de expressão de genes supostamente envolvidos na morte celular programada e na maturação de sementes de pinhão manso. Nossos resultados mostraram que os genes com seqüência C-terminal KDEL: JcCB0580861; JcCA0152821; JcCA0047111 e o gene γ-VPE JCCB0060111 mostraram um altos níveis de expressão nos estágios mais avançados em tecidos do integumento e endosperma em sementes de pinhão manso em desenvolvimento, e com base em nossas análises, esses genes expressam proteinases cisteínicas que estão possivelmente envolvidos no processo de MCP. Não obstante, os genes que expressam as seguintes VPEs: JcCB0196871; JcCB0244081; e JcCA0012422 de acordo com nossos estudos, provavelmente estão envolvidas na maturação das proteínas de reservas de sementes em desenvolvimento de pinhão manso. Esses dados forneceram importantes informações a cerca do padrão de expressão de genes que estão envolvidos no transcriptoma de sementes em desenvolvimento, mais precisamente envolvidos no processo de MCP. Não obstante, o estudo de normalização e validação de genes de referência nos tecidos de integumento e endosperma do pinhão manso propiciaram um melhor entendimento no que diz respeito à estabilidade desses genes nas condições estudadas.

VIANA, C. A. Caracterização bioquímica da atividade pró-coagulante de proteases de fluidos laticíferos. 2011. 103 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-05T18:51:49Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_caviana.pdf: 8725116 bytes, checksum: 767aa06f3d14be0e807d03f424c5c370 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-11-11T21:27:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_caviana.pdf: 8725116 bytes, checksum: 767aa06f3d14be0e807d03f424c5c370 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-11T21:27:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_caviana.pdf: 8725116 bytes, checksum: 767aa06f3d14be0e807d03f424c5c370 (MD5) Previous issue date: 2011 / Latex proteases have grown in attention because of their ability to exhibit both thrombin and plasmin-like effects. In this study, the plant latex proteins Calotropis procera (CpLP), Cryptostegia grandiflora (CgLP) and Plumeria rubra (PrLP) were investigated in terms of these activities. For both samples were investigated for their fibrinogenolytic and fibrinolytic activity in human plasma and by incubation with human fibrinogen by measuring the clotting time, electrophoretic or spectrophotometric assays and diffusion in agarose gel. In vivo effect of CpLP on clot formation of plasma of healthy and septic mice that have been experimentally infected with Salmonella enterica serovar Typhimurium was also studied. Groups of five mice were treated with CpLP (30 mg/Kg), S. enterica (107 CFU/mL) or CpLP 24 h prior bacteria. After sacrificing animals, blood samples were examined for coagulation time, platelet content and protein profile. The protein fractions of C. procera exhibiting proteolytic activity were capable to hydrolyze fibrinogen similar to thrombin, while the protein fractions of Cr. grandiflora exhibiting proteolytic activity were capable to hydrolyze fibrinogen similar to plasmin. The samples exhibited fibrinogenolytic activity in a dose and time manner, but were not able to dissolve the fibrin clot. Procoagulant activity was eliminated by inhibition of latex proteases with cysteine proteinase inhibitor E-64. Pepstatin, PMSF and EDTA were not inhibitory. Time of clot formation of plasma in septic mice and platelet content were consistently reduced as compared to healthy animals. CpLP exhibited antagonistic effects. It statistically reversed the effects of sepsis on clot-time formation associated to preservation on platelet content. However, CpLP exhibited opposite effect on non-septic mice, inducing faster clot formation, compared to healthy animals but without changing platelet content. Results reported in this work confirm fibrinogenolytic activity associated to cysteine proteases of latex and show a very intriguing in vivo protective activity of CpLP on platelet content on septic animals with apparent benefit effect against disseminated vascular coagulation, a pivotal event associated to lethal sepsis. This effect was however not observed when CpLP was given to healthy animals. / As proteases de látex têm atraído atenção devido à habilidade de exibir atividades semelhantes à trombina e à plasmina. Neste estudo, as proteínas do látex das plantas Calotropis procera (CpPL), Cryptostegia grandiflora (CgPL) e Plumeria rubra (PrPL) foram avaliadas em termos destas atividades. Para tanto, as amostras foram investigadas quanto as suas atividades fibrinogenolíticas e fibrinolíticas, em plasma humano e por incubação com fibrinogênio humano através da medida do tempo de coagulação, ensaios eletroforéticos, espectrofotométricos, ou de difusão em gel de agarose. O efeito de CpPL in vivo, sobre o tempo de coagulação no plasma de camundongos saudáveis ou sépticos, que foram experimentalmente infectados com a bactéria Salmonella enterica sorotipo Typhimurium, também foi estudado. Grupos de cinco camundongos foram tratados com CpPL (30 mg/Kg), S. enterica (107 UFC/mL) ou CpPL 24 h antes da inoculação bacteriana. Depois do sacrifício dos animais, as amostras de sangue foram examinadas quanto ao tempo de coagulação, conteúdo de plaquetas e perfil protéico. As frações protéicas de C. procera exibindo atividade proteolítica foram capazes de hidrolisar o fibrinogênio de forma similar à trombina, enquanto que as frações protéicas de Cr. grandiflora exibindo atividade proteolítica foram capazes de hidrolisar o fibrinogênio de forma similar à plasmina. As amostras exibiram atividade fibrinogenolítica de forma dose e tempo dependente, mas não foram capazes de dissolver totalmente o coágulo de fibrina. As atividades fibrinogenolíticas foram eliminadas pela inibição das proteases dos látices com E-64, um inibidor de protease cisteínica. Pepstatina, PMSF e EDTA não se mostraram inibitórios. O tempo de formação do coágulo no plasma de camundongos sépticos e o conteúdo de plaquetas foram consistentemente reduzidos quando comparados aos animais saudáveis. CpPL exibiu efeitos antagonistas. Foi capaz de reverter, estatisticamente, o efeito da sepse no tempo de formação do coágulo associado à preservação do conteúdo de plaquetas. Contudo, CpPL exibiu efeito oposto em camundongos não sépticos, induzindo rápida formação do coágulo, comparado aos animais saudáveis, porém sem alterar o conteúdo de plaquetas. Os resultados relatados neste trabalho confirmam a atividade fibrinogenolítica associada a proteases cisteínicas de látex e mostram uma efeito protetor in vivo muito intrigante de CpPL no conteúdo de plaquetas em animais sépticos, com aparentes efeitos benéficos contra a coagulação intravascular disseminada, um evento crucial associado à sepse letal. Este efeito, porém, não foi observado quando CpPL foi dado aos animais saudáveis.

Na indústria coureira há uma grande preocupação com o meio ambiente, já que a maioria das etapas para o processamento do couro são realizadas através de processos químicos. Estes processos devem ser controlados para um baixo impacto ambiental e menor custo de tratamento de resíduos. Este trabalho visa desenvolver um extrato enzimático completamente biodegradável, constituído por lipases de microrganismos, para diminuir o uso de tensoativos nos curtumes. Para tal foi necessário o uso de microrganismos que produzem lipases de maneira eficiente para substratos específicos com a variação no espectro de temperatura e pH utilizados nos processos de processamento do couro. Portanto, foi realizado o isolamento de diversos microrganismos em um curtume e estes foram submetidos à análise da produção de lipases induzida por gordura animal. A partir destes isolados foram selecionados e identificados os melhores produtores de lipases: Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Pichia pastoris e Proteus sp. Dentre estes microrganismos, o mais promissor, foi a levedura P. pastoris. A produção de lipases é afetada por diferentes fatores ambientais, assim foram testados, em escala piloto, a influência do tempo de cultivo, pH, temperatura de cultivo e agitação. Além disso, também foram testados o uso de goma arábica e três diferentes surfactantes no cultivo para o possível aumento da produção da enzima. As melhores condições de crescimento para uma maior produção de lipase por P. pastoris foram otimizadas em 72 h, 28ºC, pH 8,0 e 200 rpm. A adição de Triton X-100 ao final do cultivo também aumentou a atividade de lipase. A partir destes resultados a levedura foi submetida ao cultivo em reator de 10 L e determinados o melhor tempo de cultivo, o consumo de glicose e a densidade óptica a 600 nm. O melhor tempo de cultivo manteve-se em 72 h. Ao final deste cultivo, o extrato bruto foi utilizado para determinar a estabilidade da enzima à formulação empregada nos processos de curtimento, já que as condições destes processos podem afetar a atividade de algumas enzimas. A enzima não se mostrou estável aos químicos utilizados no processamento de couros. Por isto, para testar a eficácia da enzima em relação aos produtos encontrados no mercado algumas etapas foram reformuladas para que a enzima pudesse manter a sua atividade original. Os resultados destes experimentos mostraram-se satisfatórios, provando que a produção e utilização desta enzima no mercado é promissora. / The tanning industry has a great concern with the environment, since the majority of stages for leather processing is carried out using chemicals. These processes must be controlled for a low ambient impact and lesser cost of residues treatment. This work aims to develop a completely biodegrading enzymatic extract consisting of microbial lipases, to diminish the use of surfactants in the tanneries. For this product production is necessary the use of efficient microorganisms producing lipases for specific substrates with the variation in the specter of temperature and pH used in the tannery. Therefore, the screening of diverse microorganisms in a tannery was carried out and these had been submitted to the analysis of the induced lipases production with animal fat. It had been selected and identified the best lipases producers: Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Pichia pastoris and Proteus sp. Among these microorganisms, the most promising was P. pastoris. The lipase production is affected by different ambiental factors, thus it was tested, in scale pilot, the influence of the growth time, pH, growth temperature and agitation. Moreover, also the use of arabic gum and three different surfactants in the culture for the possible increase of the enzyme production was tested. The best growth conditions for the best lipase production of P. pastoris are 72 h, 28ºC, pH 8.0 and 200 rpm. The addition of Triton X-100 in the cultivation end also increases the lipase activity. Through these results the yeast was grown in 10 L culture reactor. During this cultivation the best growth time, the glucose consumption and the optical density at 600 nm were determined. The best growth time remained in 72 h. This culture crude extract was used to determine the enzyme stability to the formulation used in the tanning processes, since the conditions of these processes may affect enzyme activity. The enzyme was not stable in the presence of these chemicals. To compare the enzyme effectiveness with the chemicals and commercial enzymes, some processing stages were improved, so that the enzyme could keep its original activity. These results were satisfactory, suggesting that this enzyme production and its commercial use are promising.

A família das serino proteases inclui diversas proteínas envolvidas em uma variedade de processos fisiológicos, como digestão protéica, regulação da pressão arterial e da coagulação sanguínea, entre outros. Quando disfuncionais, relacionam-se à condições patológicas graves como trombose vascular, embolismo pulmonar, infarto agudo do miocárdio, isquemia cerebral, bem como com o quadro da hemofilia B, ocasionada pela deficiência de fator IX. A investigação dos mecanismos de ação e a compreensão do funcionamento de serino proteases e de seus inibidores, as serpinas, é essencial para desvendar mecanismos de doenças e para a modelagem de fármacos mais específicos e eficientes. A pesquisa de fármacos anti-trombóticos busca desenvolver produtos capazes de interferir no processo hemostático que pode resultar no grave quadro trombo-embólico. A nitroforina-2 (NP-2), produzida na secreção salivar do inseto barbeiro Rhodnius prolixus, é uma proteína dotada de potente ação anti-hemostática, atuando como um inibidor específico do complexo tenase intrínseco (TF/FVIIa/FIX). Em trabalho anterior, nosso grupo identificou que o fragmento correspondente ao segmento 90-110 de NP-2 possui atividade anticoagulante. Um modelo do complexo fator IXa (fIXa)-NP-2 foi gerado a partir do “docking” do peptídeo de NP-2 na provável região de ligação com fIXa. Este complexo foi usado como ponto de partida para a simulação por dinâmica molecular e refinamento da estrutura. Novos peptídeos foram propostos como o objetivo de gerar estruturas com maior afinidade por fIXa. Identificamos o hexapeptídeo LKEADE como apresentando melhor afinidade por fIXa, o qual sugerimos como “template” para o planejamento racional de fármacos com ação anticoagulante e anti-trombótica. Numa outra vertente de nosso trabalho, estudamos a superfamília de proteínas denominada serpinas (serpins, ou “SERine Protease INhibitors”) que engloba um grande conjunto de proteínas dotadas de estruturas similares e provenientes de vários e distintos organismos. A função inicialmente identificada para as serpinas foi de inibição de serino proteases da coagulação sangüínea; entretanto, muitas serpinas perderam esta função.Nestes estudos foram usados modelos ocultos de Markov para criar modelos e descrições possibilitando classificar as serpinas em relação à sua função biológica. Foram criadas assinaturas para cada grupo: seqüências consenso e padrões de aminoácidos distintos para cada modelo/função correspondente. Um modelo específico para serpinas da coagulação sangüínea foi criado. Para este modelo, foi gerada a expressão regular [IVTLM]-[FLVA]- F-S-P-[VLWYF]-[SG]-[IV] que descreve tal função. Além disso, ela codifica a seqüência de uma importante região envolvida na mudança conformacional e no funcionamento da serpina. Tanto esta seqüência quanto a estrutura secundária correspondente podem ser melhor investigadas, por sugerirem um alvo para inibição ou ativação. / The protein family of serine proteases comprises molecules involved in a wide range of physiological processes, such as regulation of blood pressure and coagulation. Dysfunctional serine proteases are related to pathological conditions such as embolism, heart failure, cerebral ischemia and also hemophilia B (the latter being a consequence of factor IX deficiency). The understanding of serine proteases mechanism of action, as well as of their inhibitors is a key step to the discover and develop new drugs. In the study of homeostasis, the search for anti-thrombotic drugs seek to avoid thrombosis and related conditions. The protein nitrophorin-2 (NP-2), found in the salivary glands of the hematophagous insect Rodnius prolixus, is a specific inhibitor of the intrinsic tenase complex (TF/fVIIa/fIX). In previous studies, we identified the NP-2 fragment (amino acid sequence 90-110) showing anticoagulant activity. Models of the complex factor IXa (fIXa) – NP-2 were created. This complex was used as a starting point for the molecular dynamic simulations and structure refinement. New NP-2 peptides were suggested, in order to achieve higher affinity complexes. We identified the hexapeptide LKEADE as showing higher affinity for fIXa, which we suggest to be used on rational drug design studies for anticoagulant drugs. The superfamily of proteins known as serpins (“Serine Protease Inhibitors”) involve a number of similar structures, found in a wide variety of organisms. Its function was initially identified as an inhibitor of blood clotting serine proteases. However, many serpins have lost that function in the course of natural evolution. Hidden Markov models were then used to create profiles classifying those proteins due to their biological function. We created signatures for each group of functional serpins in the form of consensus sequences and distinct amino acid patterns. A blood clotting-specific model was generated, which has yielded the regular expression [IVTLM]-[FLVA]-F-S-P-[VLWYF]-[SG]-[IV]. Such pattern also codes for a region of the structure involved in an extensive conformational change. The change is related to the activation of the serpin, and, therefore, both pattern and sequence should be investigated. Combined, these information suggest a powerful target for blood clotting inhibition.

Na indústria coureira há uma grande preocupação com o meio ambiente, já que a maioria das etapas para o processamento do couro são realizadas através de processos químicos. Estes processos devem ser controlados para um baixo impacto ambiental e menor custo de tratamento de resíduos. Este trabalho visa desenvolver um extrato enzimático completamente biodegradável, constituído por lipases de microrganismos, para diminuir o uso de tensoativos nos curtumes. Para tal foi necessário o uso de microrganismos que produzem lipases de maneira eficiente para substratos específicos com a variação no espectro de temperatura e pH utilizados nos processos de processamento do couro. Portanto, foi realizado o isolamento de diversos microrganismos em um curtume e estes foram submetidos à análise da produção de lipases induzida por gordura animal. A partir destes isolados foram selecionados e identificados os melhores produtores de lipases: Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Pichia pastoris e Proteus sp. Dentre estes microrganismos, o mais promissor, foi a levedura P. pastoris. A produção de lipases é afetada por diferentes fatores ambientais, assim foram testados, em escala piloto, a influência do tempo de cultivo, pH, temperatura de cultivo e agitação. Além disso, também foram testados o uso de goma arábica e três diferentes surfactantes no cultivo para o possível aumento da produção da enzima. As melhores condições de crescimento para uma maior produção de lipase por P. pastoris foram otimizadas em 72 h, 28ºC, pH 8,0 e 200 rpm. A adição de Triton X-100 ao final do cultivo também aumentou a atividade de lipase. A partir destes resultados a levedura foi submetida ao cultivo em reator de 10 L e determinados o melhor tempo de cultivo, o consumo de glicose e a densidade óptica a 600 nm. O melhor tempo de cultivo manteve-se em 72 h. Ao final deste cultivo, o extrato bruto foi utilizado para determinar a estabilidade da enzima à formulação empregada nos processos de curtimento, já que as condições destes processos podem afetar a atividade de algumas enzimas. A enzima não se mostrou estável aos químicos utilizados no processamento de couros. Por isto, para testar a eficácia da enzima em relação aos produtos encontrados no mercado algumas etapas foram reformuladas para que a enzima pudesse manter a sua atividade original. Os resultados destes experimentos mostraram-se satisfatórios, provando que a produção e utilização desta enzima no mercado é promissora. / The tanning industry has a great concern with the environment, since the majority of stages for leather processing is carried out using chemicals. These processes must be controlled for a low ambient impact and lesser cost of residues treatment. This work aims to develop a completely biodegrading enzymatic extract consisting of microbial lipases, to diminish the use of surfactants in the tanneries. For this product production is necessary the use of efficient microorganisms producing lipases for specific substrates with the variation in the specter of temperature and pH used in the tannery. Therefore, the screening of diverse microorganisms in a tannery was carried out and these had been submitted to the analysis of the induced lipases production with animal fat. It had been selected and identified the best lipases producers: Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Pichia pastoris and Proteus sp. Among these microorganisms, the most promising was P. pastoris. The lipase production is affected by different ambiental factors, thus it was tested, in scale pilot, the influence of the growth time, pH, growth temperature and agitation. Moreover, also the use of arabic gum and three different surfactants in the culture for the possible increase of the enzyme production was tested. The best growth conditions for the best lipase production of P. pastoris are 72 h, 28ºC, pH 8.0 and 200 rpm. The addition of Triton X-100 in the cultivation end also increases the lipase activity. Through these results the yeast was grown in 10 L culture reactor. During this cultivation the best growth time, the glucose consumption and the optical density at 600 nm were determined. The best growth time remained in 72 h. This culture crude extract was used to determine the enzyme stability to the formulation used in the tanning processes, since the conditions of these processes may affect enzyme activity. The enzyme was not stable in the presence of these chemicals. To compare the enzyme effectiveness with the chemicals and commercial enzymes, some processing stages were improved, so that the enzyme could keep its original activity. These results were satisfactory, suggesting that this enzyme production and its commercial use are promising.

Activity and transcription profiles of two classes of cysteine proteases, papain- and legumain-like cysteine proteases, as well as their potential inhibitors, cysteine protease inhibitors (cystatins), were investigated in soybean nodules during nodule development and after drought inducing premature senescence. During nodule development total protease activity increased with major activity bands detected protease zymography in older nodules. Expressed cysteine proteases during nodule development were detected by tagging proteases with the cysteine protease inhibitor DCG-04 with major DCG-04 tagged bands found in both young and old nodules. Increase in protease activity was associated with a significant decrease in nitrogenase activity of nodules measured as acetylene reduction. Semi-quantitative RT-PCR for cysteine protease and cystatin transcription profiling showed a decrease in transcription during development and also after drought treatment of several papain-like cysteine proteases (Glyma04g04400, Glyma17g05670, Glyma10g35100, and Glyma04g03090). In contrast, transcription of three legumain-like cysteine proteases (Glyma17g14680, Glyma05g04230 and Glyma14g10620) increased during nodule development and also after drought treatment. Transcription of two cystatins (Glyma13g27980 and Glyma05g28250) increased during nodule development with Glyma13g27980 strongly up-regulated after drought treatment and Glyma05g28250 constitutively strongly expressed in both well-watered and drought treated nodules. Overall, the study has contributed in establishing an expression profile of cysteine proteases and cystatins in soybean nodules. This knowledge provides a basis which can be used to determine the importance of the individual components of the cysteine protease – cystatin system, during soybean nodule development and during stress-induced premature nodule senescence. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2013. / gm2014 / Plant Science / unrestricted

Virulence determinants of M. tuberculosis remain largely unknown. Of key interest has been the ability of the bacterium to survive intracellularly within its host cell, the macrophage, and its ability to cause extensive tissue necrosis. Exported proteases are commonly associated with virulence in bacterial pathogens, yet their role in Mycobacterium tuberculosis has virtually not been studied. Preliminary experiments showed M. tuberculosis culture filtrates contained a proteolytic activity inhibited by mixed serine/cysteine protease inhibitors and activated by Ca²⁺, features typical of some serine proteases, notably subtilisins, and possibly metalloproteases. Purification attempts were unsuccessful. A family of five genes that encode putative, secreted, serine proteases has recently been described in M. tuberculosis. These proteases share 36-47% sequence identity and are all encoded with putative signal peptides, suggesting that they are translocated across the cytoplasmic membrane. One member, mycP1, was selected for further study. The gene product, mycosin-1, was 30-35% identical to bacterial subtilisin-like serine proteases and contained the classic catalytic triad and oxyanion hole. Mycosin-1 also contained a typical signal peptide, a likely propeptide, and a Cterminal hydrophobic sequence with a high transmembrane potential. Topology analyses predicted mycosin-1 to be a type I ectoprotein. Consistent with this, expression of mycosin-1 in M. tuberculosis and in Mycobacterium smegmatis transformed with mycP1 (M. smegmatis-P1) was limited strictly to the cell envelope, as seen by Western blotting, and immunogold electron microscopy. Only full-length, 50-kDa mycosin-1 was observed by Western blotting in broth-grown M. tuberculosis and M. smegmatis-P1 lysates, whereas a 40-kDa species was detected in 6-week M. tuberculosis culture filtrates. A similar 40-kDa immunoreactive band was also observed in lysates of macrophages infected with M. tuberculosis, consistent with robust transcription of the mycP 1 gene during growth in macrophages. Since putative mature mycosin-1 has a molecular weight of 38.6 kDa, the 40-kDa protein may represent activated mycosin-1 after propeptide cleavage. In conclusion, mycosin-1 is an exported, cell envelopeassociated subtilisin homolog that is expressed during growth of M. tuberculosis in vitro and in macrophages.

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