The major chaperones identified in Escherichia coli that assist in protein folding include trigger factor (TF), DnaK/DnaJ/GrpE and GroEL/GroES systems. The main ATP-dependent proteases are ClpXP, ClpAP, HslUV, Lon, and FtsH. From detailed sequence analysis, we found that tig (gene for TF), clpX, and clpP genes co-localize next to each other in most examined bacteria. We hypothesized that TF and ClpXP are functionally associated. TF is a ribosome-associated folding chaperone whereas ClpXP is a degradation complex. ClpX serves as the regulatory ATPase that recognizes substrates, unfolds and translocates polypeptides into ClpP for degradation. I found that TF physically interacts with ClpX, and that they collaborate to enhance degradation of certain ClpXP substrates. It is estimated that TF enhances the degradation of about 2% of newly synthesized E. coli proteins. One of the ClpXP substrates with degradation enhanced by TF was λO, the λ phage replication protein. Furthermore, TF also enhanced the degradation of ribosome-stalled λO nascent chains. Experiments suggest that TF transfers ribosome-stalled λO to ClpX for degradation by ClpP, demonstrating the existence of co-translational protein degradation in E. coli. To understand ClpXP mechanism, we had previously proposed that the degraded peptides are released from ClpP through transient equatorial side pores. To further understand ClpP dynamics, we determined the structure of ClpP(Ala153Cys) in its oxidized state. The structure shows that each opposing pair of protomers is linked by a disulfide bond. Unexpectedly, this structure resembles the compact structures of Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, and Plasmodium falciparum ClpPs, rather than the extended states seen in previous E. coli ClpP structures. Normal mode analysis of ClpP structures suggested that the iii compact structure is a naturally sampled conformation of WT ClpP. My findings provide insights for understanding ClpP dynamics as well as reveal a novel association between ClpXP protease and TF folding chaperone.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniversitet, 2005. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniversitet, 2004. / Härtill 5 uppsatser.

Undergraduate honors paper--Mount Holyoke College, 2007. Dept. of Biological Sciences. / Includes bibliographical references (leaves 69-70).

Metarhizium anisopliae é um fungo filamentoso entomopatogênico muito versátil que infecta, aproximadamente, 300 espécies de artrópodes, e também é adaptado à vida na rizosfera de plantas, sendo de extrema importância para o controle biológico de pragas na agricultura e pecuária. De acordo com o comportamento promíscuo desse fungo, pesquisadores têm identificado um grande número de genes relacionados à interação com o hospedeiro, e que são regulados de acordo com a sua indução. Em sua maioria, são genes que codificam para enzimas hidrolíticas. O número e a diversidade desses genes podem ser a chave para a habilidade desse patógeno em infectar uma larga variedade de artrópodes, podendo expressar genes diferentemente para cada tipo de hospedeiro. M. anisopliae secreta, entre outros, complexos quitinolítico e proteolítico para a degradação da quitina e proteínas presentes na cutícula do hospedeiro.Desse modo, o estudo da regulação dessas enzimas é de fundamental importância para o entendimento do processo de infecção; sendo assim, através desse trabalho foi observada e analisada a especialização na expressão de proteínas, especialmente de quitinases e proteases, secretadas por uma linhagem selvagem de M. anisopliae, na presença de cutículas de diferentes artrópodes, particularmente, de Dysdercus peruvianus, Boophilus microplus, Anticarsia gemmatalis e de quitina cristalina, através de ensaios de detecção enzimática e eletroforese uni e bidimensional. Em todos os experimentos, variando-se as condições de fonte de carbono e tempo de cultivo, a secreção de proteínas se mostrou altamente diferenciada, demonstrando comportamento diferencial do fungo a vários hospedeiros, o que seria um sinal da versatilidade do entomopatógeno, aqui estudado, para a capacidade de infectar centenas de hospedeiros. / Metarhizium anisopliae is a very versatile entomopathogenic filamentous fungus that infects, approximately, 300 species of arthropods, and is also adapted to the life in the rhizosphere of plants, being of extreme importance for the biological control of pests in agriculture and pecuary. In accordance with this promiscuous behavior of this fungus, researchers have identified a great number of genes related to the interaction with the host, and that they are regulated in accordance with its induction. In their majority, these genes encode for hydrolytic enzymes. The diversity of these genes can be the key for the ability of this pathogen in infect a wide variety of arthropods, being able to differently express genes for each type of host. M. anisopliae secretes chitinolytic and proteolytic complexes for the degradation of the chitin and proteins present in the cuticle of the host. In this way, the study of the regulation of these enzymes is of up fundamental importance for the understanding of the infection process. Through this research, the specialization in the expression of proteins, especially chitinases and proteases, secreted by a wild strain of M. anisopliae, in the presence of cuticles of different arthropods, particularly, of Dysdercus peruvianus, Boophilus microplus, Anticarsia gemmatalis and crystalline chitin, was observed and analyzed through enzymatic assays and one- and two-dimensional electrophoresis. In all the experiments, the conditions of the carbon source and time of culture, the protein secretion showed highly differentiated, demonstrating distinguishing fungus behavior to various hosts, which would be a sign of the versatility of this entomopathogen for the capacity of infecting hundreds of hosts.

FONSECA, Iêda Maria Rocha Lima Vieira da. Avaliação da concentração de proteínas totais na saliva humana frente a diferentes protocolos de tratamento da saliva. 2015. 40 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-11-19T12:39:00Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_imrlvfonseca.pdf: 763869 bytes, checksum: 7ff734931eddb02f3b4465dc7f77d0f5 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-11-19T12:39:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_imrlvfonseca.pdf: 763869 bytes, checksum: 7ff734931eddb02f3b4465dc7f77d0f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-19T12:39:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_imrlvfonseca.pdf: 763869 bytes, checksum: 7ff734931eddb02f3b4465dc7f77d0f5 (MD5) Previous issue date: 2015 / The need to preserve the stability of saliva samples during and/or after collection has been considered a factor that might influence its analytical results, compromising the reliability and reproducibility of these analytical methods. The main challenges related to saliva preservation include the complexity of saliva composition, and its inherent elevated proteolitic activity. Thus, collection and storage of saliva requires specific precautions to preserve its components. The present study aimed to evaluate the protein concentration of saliva samples obtained from 10 healthy adults, aged 23 – 65 years, with a mean age of 31 years, subject to different pre-analytical sample preparation. Following collection, the salivary flow rate was calculated, and saliva samples from each volunteer were fractioned and divided in six different groups, in which each of these groups corresponded to a different type of pre-analytical sample preparation. The groups were as follows: G1- immediate centrifugation, no addition of protease inhibitor, room temperature during 24 hours; G2- immediate centrifugation, no addition of protease inhibitor, -80oC during 30 days; G3- immediate centrifugation, protease inhibitor added during collection, -80oC during 30 days; G4- immediate centrifugation, protease inhibitor added during analysis, -80oC during 30 days; G5- centrifugation 30 days after collection, no addition of protease inhibitor, -80oC during 30 days; G6- centrifugation 30 days after collection, protease inhibitor added during analysis, -80oC during 30 days. Total protein concentration was analyzed in duplicates, through the bicinchoninic acid assay. After analysis, the total protein concentration in each group was statistically correlated through Pearson and Spearman correlation tests and compared using repeated measure ANOVA (p<0.05). The mean total protein concentrations showed a negative correlation with salivary flow rate in G1 (P= 0,020), G4 (P= 0,027) and G5 (P= 0,05). Total protein concentration and age were only statistically correlated in G3 (P= 0,01). The mean total protein concentrations did not significantly differ between groups, F(5,45)= 1,132, P= 0,358. These results were also observed when comparing the mean total protein concentrations normalized by each individual’s salivary flow rate, F(5,45) = 2,068, P= 0,087. In conclusion, the methodological alterations proposed for the preparation of saliva samples before analysis did not generate significant quantitative alterations in total protein concentration within these samples. / A necessidade de preservar a estabilidade da saliva durante e/ou depois da coleta, tem sido considerado um fator que pode influenciar os resultados obtidos na análise desse fluido, comprometendo a confiabilidade e reprodutibilidade de tais métodos analíticos. Os principais desafios relacionados à preservação da saliva referem-se à complexidade da sua composição e da sua elevada atividade proteolítica inerente. Consequentemente, coleta e armazenamento da saliva exigem precauções especiais para preservação de seus componentes. O presente estudo se propôs a avaliar a concentração proteica de amostras de saliva total de dez voluntários adultos, saudáveis, com idades variando de 23 a 65 anos, com média de 31 anos submetidas a alterações metodológicas no preparo pré-analítico da amostra. Após coletadas, os fluxos salivares foram calculados e as amostras de saliva de cada indivíduo foram fracionadas e divididas em seis diferentes grupos, onde cada um desses grupos correspondeu a um tipo diferente de preparo pré-analítico da amostra. Os grupos foram conforme segue: G1- centrifugação imediata, inibidor ausente, temperatura ambiente por 24 horas; G2- centrifugação imediata, inibidor ausente, -80oC por 30 dias; G3- centrifugação imediata, inibidor no ato da coleta, -80oC por 30 dias; G4- centrifugação imediata, inibidor no ato da análise, -80oC por 30 dias; G5- centrifugação após 30 dias, inibidor ausente, -80oC por 30 dias; G6- centrifugação após 30 dias, inibidor no ato da análise, -80oC por 30 dias. As concentrações de proteínas totais foram avaliadas pelo método do ácido bicinconínico, em duplicatas. Após análise a concentração de proteínas totais em cada grupo foi estatisticamente correlacionada pelos testes de Pearson e Spearman, e comparações feitas realizadas por meio do teste ANOVA para medidas repetidas (p<0.05). As concentrações médias de proteínas totais demonstraram uma correlação negativa significativa com o fluxo salivar em G1 (P= 0,020), G4 (P= 0,027) e G5 (P= 0,05). Proteínas totais e idade só demonstraram correlação significativa em G3 (P= 0,01). As concentrações de proteínas totais médias não diferiram de forma significante entre os grupos, F(5,45)= 1,132, P= 0,358. Esses resultados foram, também, observados ao se comparar as médias de proteínas totais com base no fluxo salivar dos voluntários, F(5,45) = 2,068, P= 0,087. Em conclusão, as alterações metodológicas ora propostas no tratamento das amostras de saliva não redundaram em alterações quantitativas significantes nas concentrações de proteínas totais presentes nesse fluido.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-19T12:02:55Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1276596 bytes, checksum: e320e36eac8ecfc4d887e0c9f618329e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-19T12:02:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1276596 bytes, checksum: e320e36eac8ecfc4d887e0c9f618329e (MD5) Previous issue date: 2005-04-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Por meio de um mecanismo denominado quorum sensing, diversas bactérias podem comunicar-se umas com as outras e coordenar a expressão gênica de acordo com a densidade populacional de forma semelhante aos organismos multicelulares. Este trabalho teve como objetivo investigar a produção de moléculas sinalizadoras de quorum, conhecidas como homoserinas lactonas aciladas (AHLs), por bactérias psicrotróficas proteolíticas isoladas de leite cru refrigerado. Verificou-se também se a atividade proteolítica de Pseudomonas fluorescens 07A é dependente da densidade populacional. Foram avaliados 53 isolados psicrotróficos proteolíticos e sete estirpes ATCC quanto à produção de AHL em meio sólido utilizando as bactérias Agrobacterium tumefaciens A136, Chromobacterium violaceum CV026 e Escherichia coli pSB403 como sistemas monitores ou sensores da presença de AHL. A produção de moléculas sinalizadoras foi freqüente entre os isolados psicrotróficos proteolíticos, constatando-se que, aproximadamente, 89 % das estirpes avaliadas foram produtoras de AHL. A extração de moléculas autoindutoras foi realizada em dois isolados, Serratia liquefaciens 016 e P. fluorescens 07A e, a presença de AHL nos extratos foi confirmada pelas estirpes monitoras C. violaceum CV026 e A. tumefaciens KYC55, respectivamente. A produção de AHL pelo isolado P. fluorescens 07A foi determinada em meio de cultivo à base de triptona suplementado com 0,25 % de cálcio (TYEP + CaCl 2 0,25 %) e em meio de constituição mínima (MMS), utilizando a estirpe monitora A. tumefaciens KYC55. Em meio TYEP + CaCl 2 0,25 % a produção de AHL(s) alcançou o máximo ao final da fase logarítmica, quando a população de P. fluorescens 07A foi da ordem de 10 9 UFC mL -1 . Esta mesma população resultou em uma concentração de AHL(s) cerca de três vezes menor no MMS. Os resultados indicaram que a produção de AHL pode estar sob controle de autoindução. O crescimento e a atividade proteolítica do isolado 07A foram avaliados em seis meios de cultivo. Não foi observada diferença no crescimento do isolado nos diferentes meios, exceto no MMS, onde a estirpe cresceu de forma mais lenta. Entretanto, a produção de proteases foi maior em meio TYEP + CaCl 2 0,25 % e em leite desnatado reconstituído (LDR 12 %). A detecção da atividade proteolítica só foi possível quando a cultura atingiu concentração populacional elevada em todos os meios avaliados, excetuando-se no meio MMS, quando a atividade proteolítica foi detectada em uma densidade populacional 10 vezes menor. Nos meios a base de triptona o pH aumentou para valores próximos a 8,5. Meios contendo íons Ca +2 apresentaram grande fluorescência ao final do período de incubação, indicando maior produção do sideróforo pioverdina. A adição de duas AHLs sintéticas não afetou o crescimento e a atividade proteolítica da estirpe P. fluorescens 07A em meio TYEP + CaCl 2 0,25 %. Quando comparada ao controle, a atividade proteolítica específica de P. fluorescens 07A não foi afetada significativamente, ao nível de 5% de probabilidade, pela suplementação do meio TYEP + CaCl 2 0,25 % com extrato de AHL obtido da própria estirpe. O quorum sensing pode não estar regulando a atividade proteolítica em P. fluorescens 07A. / In a process called quorum sensing, a range of bacterial cells communicate and coordinate the expression of multiple phenotypes according to cell density. This work aimed to evaluate the production of signaling molecules known as N-acyl homoserine lactone (AHL) by psychrotrophic proteolytic bacteria isolated from raw milk as well as to verify if the proteolytic activity of Pseudomonas fluorescens 07A is under the control of quorum sensing. Fifty three psychrotrophic isolates and seven ATCC cultures were screened for the production of AHL in agar systems using the monitor strains Agrobacterium tumefaciens A136, Chromobacterium violaceum CV026 and Escherichia coli pSB403. It was verified that almost 89 % of the psychrotrophic isolates tested elicited a positive response in at least one of the monitor strains of AHL. Signaling molecules were extracted from Serratia liquefaciens 016 and P. fluorescens 07A and the presence of AHL was detected with the monitor strains C. violaceum CV026 and A. tumefaciens KYC55, respectively. The production of AHL by the strain 07A was evaluated in a complex medium (TYEP + CaCl 2 0,25 %) and a defined medium (MMS). A. tumefaciens KYC55 was used to quantify AHL in this assay. In TYEP + CaCl 2 0,25 % the AHL concentration reached a maximum value at the end of xvthe stationary phase, when the population of P. fluorescens 07A was 10 9 CFU mL -1 . When MMS medium was used, a similar cell population was achieved, but the AHL concentration was three fold lower. The results indicated that AHL production by P. fluorescens 07A could be regulated by autoinduction. The growth and proteolytic activity of the P. fluorescens 07A were monitored in six different media. It was not observed difference in the specific growth rate of the strain in the media tested, except in MMS, where it grew slower. On the other hand, the protease activity was higher in the complex medium (TYEP + CaCl 2 0,25 %) and reconstituted skimmed milk (LDR 12 %). Proteolytic activity was only detected when the culture reached high population densities (10 8 UFC mL -1 ) in all media evaluated. In MMS, proteolytic activity was detected at lower population densities (10 7 UFC ml -1 ). An increase in pH values was observed during cultivation in media containing tryptone. The emission of fluorescence was intensified in media containing calcium. The addition of two synthetic AHLs did not affect the growth rates and the proteolytic activity of the strain 07A in TYEP + CaCl 2 0,25 %. Furthermore, the addition of AHL extracted from the culture did not increase the specific proteolytic activity in TYEP + CaCl 2 0,25 %. These results indicate that quorum sensing may not have a direct role in the regulation of protease production in P. fluorescens 07A.

SERPA, R. Biofilmes de Trichosporon asahii e Trichosporon inkin: aspectos morfofisiológicos, sensibilidade a antifúngicos e inibição mediada por ritonavir. 2016. 118 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-10-27T13:21:57Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_rserpa.pdf: 3087326 bytes, checksum: 35f76a6918f208a69d52ecd06bf86142 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-10-27T13:30:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_rserpa.pdf: 3087326 bytes, checksum: 35f76a6918f208a69d52ecd06bf86142 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-27T13:30:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_rserpa.pdf: 3087326 bytes, checksum: 35f76a6918f208a69d52ecd06bf86142 (MD5) Previous issue date: 2016-07-27 / In recent years, several studies have considered Trichosporon genus as emerging opportunistic pathogens in immunocompromised patients. Although the dynamics are not well understood, it is known that events associated with biofilm formation on these fungi play an important role in the infectious process. Thus, the present study analyzed morphophysiological aspects of biofilms produced by Trichosporon spp., as well as the role of a protease inhibitor on T. asahii and T. inkin cells and biofilms. In the first part of the study, we investigated the biofilm formation of T. inkin (n=7) in RPMI broth, CLED broth and Sabouraud broth at pH 5.5 and pH 7.0, with initial inoculum of 1x104, 1x105 and 1x106 cells/ml, incubated at 28°C and 35°C in static or shaking at 80 rpm. Biofilms were evaluated for their biomass and metabolic viability, viable cell counts, quantification of nucleic acids and proteinase activity. It was also investigated the sensitivity of the biofilm front of amphotericin B, caspofungin, fluconazole, itraconazole and voriconazole. To evaluate the inhibitory activity of ritonavir on the structure and functioning of T. asahii and T. inkin biofilms, biofilms were formed in the presence of ritonavir and evaluated for cell adhesion, structural development and proteinase activity. Additionally, ritonavir was assessed on mature biofilms, matrix composition and structural changes. Planktonic cells of T. asahii and T. inkin (n=2 each) were also investigated for sensitivity to ritonavir alone and in combination with antifungals. Finally, planktonic cells were pre-exposed to ritonavir and evaluated for biofilm formation capacity, susceptibility to antifungal agents, and changes in their surface hydrophobicity. Maximum biofilms growth in RPMI pH 7.0 for inoculation of 1x106 cells/ml and incubation at 35°C under stirring. Biofilms produced under these conditions are formed by dynamic communities associated with an extracellular matrix, and show increased viability and biomass over time, reaching stability after 48 hours of cultivation. During the development of biofilms occurs release of viable cells and nucleic acids into the surrounding environment. T. inkin biofilms produce more proteases and tolerate higher concentrations of antifungals that planktonic cells related. Due to the presence of proteases in the development of T. inkin biofilm, it was hypothesized that these enzymes could be considered important targets in controlling biofilms. The results showed that ritonavir decreased cell adhesion and formation of mature biofilms, and reduce protease activity and change the structure of biofilms. Ritonavir did not affect the viability of mature biofilms, but changed the composition of the extracellular matrix of biofilms, which showed different protein spectra compared to the control group. Ritonavir was able to inhibit planktonic growth of T. asahii and T. inkin approximately 50%. However, there was no synergism between ritonavir and tested antifungals. In planktonic cells, pre-exposure to ritonavir significantly reduced values of minimum inhibitory concentration of Amphotericin B in T. asahii and T. inkin, although not change the response to azoles. Preincubation with ritonavir reduced cell adhesion, but not the formation of mature biofilms, in addition to changing the hydrophobicity of the cell surface. The article detailed characteristics of T. inkin biofilms and showed the potential use of a protease inhibitor in controlling these biofilms. / Nos últimos anos, diversos estudos têm considerado os fungos do gênero Trichosporon como patógenos oportunistas emergentes em pacientes imunocomprometidos. Embora a dinâmica não seja bem compreendida, sabe-se que eventos associados à formação de biofilme nestes fungos têm papel importante no processo infeccioso. Desta forma, o presente estudo analisou aspectos morfofisiológicos dos biofilmes produzidos por T. inkin, bem como o papel de um inibidor de proteases sobre as células e biofilmes de T. asahii e T. inkin. Na primeira parte da pesquisa, foi investigada a formação de biofilmes de T. inkin (n=7) nos meios RPMI, Caldo CLED e Caldo Sabouraud, em pH 5,5 e pH 7,0, com inóculos iniciais de 1x104, 1x105 e 1x106 células/mL, incubados a 28°C e 35°C, de forma estática ou agitação a 80 rpm, por 48h. Os biofilmes formados foram avaliados quanto à biomassa e atividade metabólica, contagem de células viáveis, quantificação de ácidos nucléicos e atividade proteásica. Investigou-se ainda a sensibilidade dos biofilmes frente à anfotericina B, caspofungina, fluconazol, itraconazol e voriconazol. Para avaliação da atividade inibitória do ritonavir sobre a estrutura e o funcionamento dos biofilmes de T. asahii e T. inkin, biofilmes foram formados na presença de ritonavir e avaliados quanto à adesão celular, desenvolvimento estrutural e atividade proteásica. Adicionalmente, o ritonavir foi avaliado sobre biofilmes maduros, composição de matriz e alterações estruturais. Células planctônicas de T. asahii e T. inkin (n=2 cada) também foram investigadas quanto à sensibilidade ao ritonavir isolado e em combinação com antifúngicos. Por fim, células planctônicas foram pré-expostas ao ritonavir e avaliadas quanto à capacidade de formação de biofilmes, sensibilidade a antifúngicos e alteração na hidrofobicidade de suas superfícies. A produção de biofilmes foi máxima em RPMI pH 7,0, em inóculo de 1x106 células/mL, e incubação a 35°C, sob agitação. Os biofilmes produzidos nessas condições são formados por comunidades dinâmicas, associadas a uma matriz extracelular, e mostram aumento da atividade metabólica e biomassa ao longo do tempo, atingindo estabilidade após 48 h de cultivo. Durante o desenvolvimento dos biofilmes, ocorre liberação de células viáveis e ácidos nucléicos para o ambiente circundante. Os biofilmes de T. inkin produzem mais proteases e toleram maiores concentrações de antifúngicos que as células planctônicas relacionadas. Dada à presença de proteases durante o desenvolvimento do biofilme de T. inkin, foi hipotetizado que essas enzimas poderiam ser consideradas alvos importantes no controle dos biofilmes. Os resultados mostraram que o ritonavir diminuiu a adesão celular e formação de biofilmes maduros, além de reduzir a atividade proteásica e alterar a estrutura dos biofilmes. O ritonavir não interferiu na atividade metabólica de biofilmes maduros, mas alterou a composição da matriz extracelular dos biofilmes, as quais apresentaram diferentes espectros protéicos em comparação com o grupo controle. O ritonavir inibiu o crescimento planctônico de T. asahii e T. inkin a 100 μg/mL. Entretanto, não foi observado sinergismo entre o ritonavir e os antifúngicos testados. Em células planctônicas, a pré-exposição ao ritonavir reduziu significativamente os valores de concentração inibitória mínima da anfotericina B em T. asahii e T. inkin, embora não tenha alterado a resposta aos azólicos. A pré-incubação com ritonavir reduziu a adesão das células, mas não a formação de biofilmes maduros, além de alterar a hidrofobicidade da superfície celular. O presente artigo detalhou características dos biofilmes de T. inkin e mostrou o potencial do uso de um inibidor de proteases no controle dos biofilmes de T. asahii e T. inkin.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-10-03T18:44:25Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 536763 bytes, checksum: 235d2306a5e02f6ed9b9b2dfcdbe7b9f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-03T18:44:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 536763 bytes, checksum: 235d2306a5e02f6ed9b9b2dfcdbe7b9f (MD5) Previous issue date: 2003-03-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A soja é uma leguminosa de alta qualidade protéica, porém o elevado conteúdo de fatores antinutricionais no grão, sobretudo os inibidores de proteases KTI e BBI, reduz seu valor nutricional. Contudo com o avanço das pesquisas, linhagens de soja têm sido desenvolvidas de maneira a apresentar atividade reduzida e/ ou completa ausência dos inibidores de proteases e lipoxigenase. No presente estudo quatro variedades de soja, com ausência e/ou presença de KTI e LOX sendo derivadas em farinhas integrais foram submetidas às análises da composição centesimal, determinação da atividade inibitória de tripsina e quimiotripisina quando in natura e quando processada à temperatura de 120 oC por 9, 12, 15, e 18 minutos e determinação da qualidade protéica através de ensaios in vivo e in vitro. Estas análises tiveram como objetivo avaliar se o melhoramento genético afeta a qualidade nutricional das farinhas de soja. Os resultados obtidos quanto à análise bromatológica para as quatro linhagens foram os seguintes: cinzas variaram de 5,86 a 5,95%, proteínas de 42,49% a 44,07%, lipídeos de 23,53% a 25,30% e carboidratos de 14,65% a 17,33%. Para os minerais, os teores obtidos em mg/100 g de amostra foram: Fe variou de 4,41mg a 5,21mg, Zn de 4,43mg a 4,88mg, Mn de 1,99mg a 2,29mg, Mg de 223,46mg a 235,01mg, Ca de 168,01mg a 211,29mg e K de 2146,63mg a 2280,61mg. Demonstrando que as linhagens de soja modificadas geneticamente possuem em sua constituição nutrientes equivalentes em proporção ao grão de soja convencional, sem, contudo, apresentar os efeitos negativos da presença do KTI e LOX. A atividade inibitória de tripsina, em mg/g de proteína, obtida para as linhagens in natura foram bastante elevadas variando de 900 a 1300. Contudo, as farinhas de soja isentas de KTI foram as que apresentaram menor atividade inibitória. Com o processamento térmico a 120oC a atividade inibitória de tripsina reduziu bruscamente sendo que o tempo de 9 minutos foi suficiente para a completa inativação dos inibidores nas variedades isentas de KTI. Porém para as linhagens com KTI, a completa inativação dos inibidores só foi conseguida com o tempo de 18 minutos de autoclave. Em relação à qualidade protéica verifica-se, através de ensaio biológico com ratos, valores de PER variando de 1,83 a 2,75, NPR de 3,036 a 4,08 e a digestibilidade verdadeira de 79,02 a 83,17 para farinhas de soja processadas, sendo que não foi verificada diferença estatística entre as farinhas com KTI processadas por 18 minutos daquelas processadas por 12 minutos. Isto sugere, que a farinha de soja isenta em KTI necessita de um tempo menor de exposição ao calor, o que é bastante favorável em termos de qualidade nutricional. Quanto a digestibilidade in vitro os valores encontrados variaram de 5,28 a 36,43%, não tendo boa correlação com a digestibilidade in vivo. / Soybean is a leguminosae of high proteic quality but the high contents of anti-nutritional factors in the grain, especially the inhibitors of proteases KTI and BBI, reduces its nutritional value. With the advance of researchs, soy lineages have been developed in a way to show reduced activity and / or complete absense of proteasis inhibitors and lipoxigenases. In this study, four different varieties of soy, with absense and or presence of KTI and LOX, being derived from whole flours were taken to analyse the centesimal composition, determination of the inhibitor activity of trypsin and chymotrypsin when in natura and when processed under the temperature of 120°C for 9, 12, 15, and 18 minutes and the proteic quality through tests in vivo and in vitro. These analisis had as their objective evaluate if the genetic improvement affects the nutritional quality of the soy flours. The obtained results for the bromatologic analisis for the four lineages were the following: gray varied from 5,86 to 5,95%, proteins from 42,49% a 44,07% lipids from 23,53 to 25,30% and carbohydrates from 14,65% a 17,33%. To the minerals, the obtained contents in mg/100g of sample were: Fe varied from 4,41mg to 5,21 mg, Zn from 4,43 mg to 4,88 mg, Mn from 1,99 mg to 2,29 mg, Mg from 223,46 mg to 235,01 mg, Ca from 168,01 mg to 211,29 mg and K from 2146,63 mg to 2280,61 mg. Showing that the geneticaly modified soy lineages have in their constitution nutrients equivalent in proportion to the conventional soy grains, without showing negative effects of the KTI and LOX presence. The trypsin inhibitor activity, in mg/g of protein, obtained for the in natura lineages were highly elevated, varying from 900 to 1300. However, the soy flours free from KTI were the ones that showed a minor inhibitor activity. With the thermal processing at 120°C, the trypsin inhibitor activity reduced roughly, the time of 9 minutes was enough for the complete inativation of the inhibitors in the varieties free from KTI. However, for the lineages with KTI, the complete inativation of the inhibitors was only taken with the time of 18 minutes of autoclave. In relation to the proteic quality, it is found through the biologic test with rats, values of PER virying from 1,83 to 2,75, NPR from 3,036 to 4,08 and a true digestibility of 79,02 to 83,17 to the processed soy flours, but it wasn’t verified the statistical difference among the flours with KTI processed for 18 minutes from the ones processed for 12 minutes. It suggests that the soy flour free from KTI needs a shorter time of exposition to heat, what is highly favourable in terms of nutritional quality. About the digestibility in vitro, the obtained values varied from 5,28 to 36,43%, not having a good co-relaction with the digestibility in vivo. / Não foi localizado o cpf do autor. O autor não apresentou título em inglês.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-06T11:28:08Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 361797 bytes, checksum: 068a0abf2d9967881532d1d538a5fdbc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-06T11:28:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 361797 bytes, checksum: 068a0abf2d9967881532d1d538a5fdbc (MD5) Previous issue date: 2004-02-11 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Dos seres vivos existentes, 72% são insetos, sendo que 50% destes são fitófagos. Na coevolução entre plantas e insetos, as plantas desenvolveram mecanismos de defesa contra o ataque de insetos. Dentre estes mecanismos destaca-se a produção de inibidores de protease. É postulado que, quando uma planta é atacada ou ferida, ela propicia um aumento nos níveis de inibidores de proteases na região ferida (resposta local) e ou por toda a planta (resposta sistêmica). Nesta interação inseto-planta, os insetos podem desenvolver mecanismos de defesa contra os inibidores de proteases produzidos pela planta. Esta possibilidade demanda um conhecimento mais elaborado do comportamento das enzimas proteolíticas do intestino médio dos insetos, a partir da ingestão crônica de inibidores de protease no momento do ataque à planta. Plantas de soja atacadas por larvas de Anticarsia gemmatalis (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) induzem, através da via das lipoxigenases, o aumento na síntese de inibidores de proteases, como uma forma de defesa ao ataque do inseto (FORTUNATO, 2001). Este inseto apresenta proteases tripsinas-like como enzimas digestivas (XAVIER, 2002). Tomando conhecimento destas informações e por ser a soja uma importante cultura para a economia brasileira, buscamos realizar a caracterização bioquímica e fisiológica do efeito do inibidor de tripsina benzamidina na digestibilidade protéica, crescimento e desenvolvimento de Anticarsia gemmatalis. Neste sentido, o presente trabalho baseou-se na determinação da digestibilidade e os efeitos no crescimento e desenvolvimento de larvas de A. gemmatalis, assim como a avaliação da atividade das proteases digestivas presentes no intestino médio da lagarta, quando alimentadas com o inibidor de tripsina benzamidina nas concentrações 0; 0,25; 0,50 e 0,75 (% p/p de dieta artificial). Verificamos, através do teste de Tukey (p < 0,05), que a adição de benzamidina alterou significativamente a digestibilidade do alimento proteico. Tal alteração está correlacionada com impactos negativos ocasionados na fase larval desse inseto, tais como aumento do ciclo larval, diminuição de ganho de peso e aumento da mortalidade. Verificamos que tanto a atividade proteolítica quanto a atividade amidásica apresentaram maiores índices em lagartas de 5o instar. Observamos também que a presença do inibidor alterou os perfis de atividades, sugerindo que os insetos, após a ingestão alta de inibidores de proteases, podem apresentar respostas de defesa através da hiperprodução de proteases sensíveis à benzamidina e/ou síntese de proteases insensíveis ao inibidor. Portanto, estes dados sugerem que a utilização de inibidores de protease possa ser uma estratégia promissora no controle de Anticarsia gemmatalis na cultura da soja. / From the existent beings living creatures, 72% are insects, and 50% of these are phytophagous. In the co-evolution between plants and insects, the plants developed defense mechanisms against the attack of insects. Among these mechanisms stand out the production of protease inhibitors. It is postulated that, when a plant is attacked or wounded, it propitiates an increase in the levels of proteases inhibitors in the wounded area (local answer) and or for the whole plant (systemic answer ). In this interaction insect-plant, the insects can develop defense mechanisms against the proteases inhibitors produced by the plant. This possibility demands an elaborated knowledge of the behavior of the proteolytic enzymes of the medium intestine of the insects, starting from the chronic ingestion of protease inhibitors in the moment of the attack to the plant. Soy plants attacked by larvas of Anticarsia gemmatalis (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) they induce, through the lipoxigenases way, the increase in the synthesis of proteases inhibitors, as a defense form to the attack of the insect (FORTUNATO, 2001). This insect presents proteases trypsin-like as digestive enzymes (XAVIER, 2002). Becoming aware of these informations and for being the soy an important culture for the Brazilian economy, we tried to accomplish the biochemical and physiologic characterization of the effect of the inhibitor of trypsin benzamidine in the proteic digestibility, growth and development of Anticarsia gemmatalis. In this way, the present work based on the determination of the digestibility and the effects in the growth and development of larvas of Anticarsia gemmatalis, as well as the evaluation of the activity of the present digestive proteases in the medium intestine of the caterpillar, when fed with the inhibitor of trypsin benzamidine in the concentrations 0; 0,25; 0,50 and 0,75 (% p/p of artificial diet). It was verified, through the test of Tukey (p <0,05), that the benzamidine addition altered the digestibility of the proteic food significantly. Such alteration is correlated with negative impacts caused in the larval phase of that insect, such as increase of the larval cycle, decrease of weight gain and increase of the mortality. It was verified that not only the proteolytic activity but also the starch activity presented larger indexes in caterpillars of 5th urge. It was also observed that the presence of the inhibitor altered the profiles of activities, suggesting that the insects, after the high ingestion of proteases inhibitors, they can present defense answers through the hyper-production of sensitive proteases to the benzamidine and/or synthesis of insensitive proteases to the inhibitor. Therefore, these data suggest that the use of protease inhibitors can be a promising strategy in the control of Anticarsia gemmatalis in the culture of the soy. / Dissertação importada do Alexandria