Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-16T17:23:07Z No. of bitstreams: 1 2018_JuliaFreitasDaltroVidal.pdf: 3953556 bytes, checksum: c4aece9109c1c4294595a19546bc8714 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-20T20:21:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_JuliaFreitasDaltroVidal.pdf: 3953556 bytes, checksum: c4aece9109c1c4294595a19546bc8714 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-20T20:21:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_JuliaFreitasDaltroVidal.pdf: 3953556 bytes, checksum: c4aece9109c1c4294595a19546bc8714 (MD5) Previous issue date: 2018-07-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / As α2-macroglobulinas (A2M) são proteínas de alto peso molecular que atuam como inibidoras de amplo espectro de proteases. Essa inibição ocorre por meio de um mecanismo que envolve o aprisionamento físico da protease seguido pela formação de uma ligação covalente entre ambas as proteínas. A capacidade de captura das diversas classes de proteases poderia permitir sua utilização na identificação das mesmas em extratos celulares, podendo ser aplicada tanto na descoberta de novas proteases como na detecção de proteases alvo. Esse trabalho tem por objetivo caracterizar biofisicamente a α2-macroglobulina de Salmonella enterica e avaliar sua potencial utilização na identificação de proteases. A proteína foi expressa em E. coli BL21 (DE3) e purificada por cromatografia de afinidade a metal imobilizado (Ni2+), seguido por cromatografia de exclusão molecular. Foram realizados ensaios de dicroísmo circular a fim de verificar seu padrão de estrutura secundária em diferentes pH, bem como sua estabilidade térmica (25-95 ºC). Ensaios de fluorescência foram realizados com o intuito de analisar mudanças estruturais sofridas em uma ampla faixa de pH (3,5-9,0). Experimentos de ultracentrifugação analítica foram realizados a fim de compreender melhor a interação entre a A2M e a tripsina. Tanto a capacidade de ligar-se a proteases, como a habilidade em capturar proteases quando ligada em coluna foram testadas utilizando-se tripsina. Confirmadas tais capacidades, foram realizados testes com os extratos de Escherichia coli, Vigna unguiculata e Pichia pastoris a fim de detectar proteases ali presentes. As proteínas foram submetidas à proteólise e analisadas por espectrometria de massas. Houve mudanças no padrão de estrutura secundária quando a proteína foi submetida a pH ácidos e básicos (4,0 e 9,0) quando comparado ao pH próximo da neutralidade (7,5). Durante sua desnaturação térmica verificou-se que há agregação em temperaturas superiores a ~47ºC em todos os pH testados (4,0, 7,5 e 9,0), demostrando que a proteína não é estável termicamente. Foi observado que a proteína quando ligada à tripsina apresenta um padrão eletroforético e um perfil de eluição em gel filtração que indica a ocorrência de mudança conformacional. Entretanto, não foi obtido o mesmo resultado nos experimentos de ultracentrifugação analítica. A A2M aparenta formar dímeros, principalmente quando na presença da tripsina. Não houve a detecção de proteases nos testes com os extratos celulares testados. Contudo, tais testes devem ser aprimorados para um resultado mais confiável. / α2-macroglobulins (A2M) are high molecular weight proteins that act as broad spectrum peptidase inhibitors. The inhibition occurs by a mechanism that involves the capture of the peptidase followed by the formation of a covalent bond between the two proteins. The capture of all the peptidases classes could allow its utilization in the identification of these proteins in cellular extracts, being possibly applied in the discovery of new peptidases and in the detection of target peptidases. The aim of this work was the biophysical characterization of the α2-macroglobulin from Salmonella enterica and evaluation of its potential use in the identification of proteases. The recombinant A2M protein was expressed in E. coli BL21 (DE3) and purified by immobilized metal ion affinity chromatography followed by size exclusion chromatography. Circular dichroism assays were performed in order to verify the A2M secondary structure in different pH conditions, as well as its thermal stability in a temperature range of 25-95 ºC. Fluorescence spectroscopy assays were performed to analyze structural changes in a wide range of pH (3.5-9.0). The ability of A2M to bind peptidases and its capacity to capture peptidases when immobilized to a column were tested using trypsin. Once these abilities were confirmed, tests were carried out with extracts of Escherichia coli, Vigna unguiculata and Pichia pastoris in order to identify its captured peptidases. Proteins were hydrolyzed and analyzed by mass spectrometry. Analytical ultracentrifugation experiments were performed in order to better understand the interaction between A2M and trypsin. There were changes in the secondary structure when the protein was subjected to acid and basic pH (4.0 and 9.0) when compared to neutral pH (7.5). During its thermal denaturation it was found that there is aggregation at temperatures above ~ 47 ° C in all tested pH conditions (4.0, 7.5 and 9.0), showing that the protein is not thermally stable. It was verified that the protein when bound to trypsin has an electrophoretic migration and a gel filtration elution profile that indicates the occurrence of conformational change. However, the same result was not observed with the analytical ultracentrifugation experiments. A2M seems to form dimers, especially in the presence of trypsin. There was no detection of peptidase in the tests with the cell extracts. However, such tests must be improved for a more reliable result.

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é amplamente empregado comercialmente como agente biocontrolador de artrópodes em pragas na agricultura e pecuária, abrangendo vasta gama de hospedeiros. Para que o processo infectivo tenha sucesso, é necessário que o fungo atravesse a cutícula, a primeira e principal defesa do artrópode. A transposição dessa primeira barreira ocorre pela secreção de proteases, lipases e quitinases para degradar seus principais componentes estruturais. Dentre as proteases expressas por M. anisopliae, a família Pr1 de serino-proteases está associada à virulência. Essa família possui 11 isoformas - Pr1A a Pr1K - em M. anisopliae, sendo subdivididas em duas classes. A Classe II compreende 10 isoformas subdivididas em três subfamílias. Essas isoformas agem de forma sinergística entre si e com outros fatores, conferindo maior virulência e permitindo a infecção de diferentes hospedeiros. É suposto que a virulência coevolui por seleção recíproca com o hospedeiro, havendo seleção positiva para a evolução de novas proteases ou isoformas que não sejam inativadas por inibidores do hospedeiro. O presente trabalho busca testar essa hipótese na Classe II da família Pr1, com especial foco em M. anisopliae, utilizando diferentes métodos de inferência filogenética em conjuntos de aminoácidos e nucleotídeos das isoformas individuais, bem como agrupadas por subfamílias, abrangendo homólogos do gênero Metarhizium e fungos relacionados. As árvores obtidas e seus respectivos alinhamentos nucleotídicos foram analisados quanto à substituições sinônimas e não sinônimas para inferência de seleção positiva. Tanto para os conjuntos de dados individuiais quanto para aqueles agrupados por subfamília, as filogenias retratam grupos com alto suporte estatístico condizentes com a taxonomia dos organismos que sintetizam essas proteínas, embora contendo pequenas discrepâncias. Foram identificados sítios sob seleção positiva em seis das nove isoformas avaliadas, em sua maioria localizados no domínio proteolítico. Esses resultados indicam que existe pressão seletiva diferenciada para gerar novas variações de Pr1, com efeito potencial na especificidade por hospedeiros, aumento de virulência, ou adaptação a outros estilos de vida hospedeiro-independente. / The entomopathogenic fungus Metarhizium anisoplie is widely applied as a pest-arthropod biocontrol agent in crops and animal production, encompassing a wide array of hosts. For a successful infection, it is vital that the fungus breaches the host’s cuticle, the first and main defense of artrhopods. Transposing this first barrier requires secreted proteases, lipases and chitinases that degrade the cuticle’s main structural components. Among the expressed proteases of M. anisopliae, the Pr1 family of serine proteases is related to its virulence. In M. anisopliae, this family contains 11 isoforms – Pr1A through Pr1K – divided into two classes. Class II comprises 10 isoforms further divided into three subfamilies. It is believed that these isoforms act synergistically and with other virulence fators, allowing the infection of different hosts. Presumably, virulence coevolves through reciprocal selection with the host, where positive selection occurs for the evolution of new proteases or isoforms that are not inactivated by the host’s inhibitors. The current work tests this hypothesis in Class II of the Pr1 family, with a special focus in M. anisopliae, employing different methods for phylogenetic inference in aminoacid and nucleotide datasets alike for each isoform individually as well as grouped by subfamily, encompassing homologs for the Metarhizium genus and related fungi. The inferred trees and their respective alignments were analyzed regarding synonymous and non-synonymous substitutions to detect positive selection. For each individual dataset, as well as for their subfamily groups, phylogenies depict groups that match the taxonomy of their respective organisms with high statistical support, albeit with minor discrepancies. Positively selected sites were identified in six out of nine Pr1 isoforms, most of them located within the proteolytic domain. These results imply that there exists a differential selective pressure for the evolution of novel Pr1 variations, potentially affecting host specificity, increasing virulence or adapting the fungus to different host-independent lifestyles.

The aim of this project was to examine the Streptococcal IgA1 proteases, with particular interest on the Streptococcus pneumoniae enzyme. IgA1 protease of S. pneumoniae was identified and characterised. A non-reducing polyacrylamide gel system was employed to screen clinical isolates for IgA1 protease activity. Of 187 isolates tested 18% were found to be IgA1 protease negative, there was no correlation with the site of isolation of the organism and its ability to produce the enzyme. Attempts were made to clone the pneumococcal IgA1 protease gene using the cosmid pEMBLcos4, the plasmid vector pLG339 and the ? replacement vector ?EMB4. Libraries were screened for pneumolysin and IgA1 protease activity. Clones that expressed pneumolysin were identified by overlaying with sheep red blood cells. One haemolytic clone was not inhibited in the presence of cholesterol. Screening for IgA1 protease activity identified clones with IgA1 protease-ike activity but this activity was not stably expressed. Closer analysis of the libraries suggested that pneumococcal DNA was highly unstable when cloned into E. coil plasmid and cosmid vectors.

HIV/AIDS is a global health problem of immense magnitude, with 33 million people living with HIV and 2 million AIDS-related deaths per year. As the development of drug resistance undermines treatment efficacy, the long-term success of anti-retroviral therapy depends upon the introduction of novel drugs aimed at additional targets essential for the viral life cycle. With a critical role in many viral diseases including the proteolytic maturation of the HIV-1 envelope glycoprotein gp160, the secretory pathway proprotein convertases (PCs) represent a potential anti-viral target. Our laboratory has reported the identification of Spn4A, a potent naturally occurring secretory pathway serine protease inhibitor directed at the prototype PC member, furin. Because of the requirement for the PCs in the production of infectious HIV-1, we hypothesized that strategic manipulation of PC activity by Spn4A and Spn4A-engineered variants would provide a means of effectively limiting HIV-1 infection. This thesis details the investigation of the anti-proteolytic activities and anti-HIV-1 properties of recombinant adenoviruses expressing Spn4A and Spn4A bio-engineered variants, including a secreted recombinant Spn4A (Spn4A S). Our data shows that the expression of Spn4A S in MAGI-CCR5 cells and furin-deficient LoVo cells inhibited the PC-dependent processing of the HIV-1 envelope precursor gp160. Furthermore, inhibition of processing resulted in a nearly complete reduction of productive HIV-1 infection as determined by HIV-1 Tat-driven β-galactosidase activity and multinuclear activation of a galactosidase indicator (MAGI) assays. Complementing the previously described anti-furin activity of Spn4A, our studies indicate that Spn4A S inhibits additional PCs involved in gp160 maturation, and that PC inhibition can serve as an effective means of limiting HIV-1 infection. With the central role of the PCs in the replication and pathogenesis of numerous infectious agents, the identification of Spn4A S as an efficacious HIV inhibitor establishes Spn4A as a prospective broad-based agent for the inhibition of PC-related diseases. / Science, Faculty of / Microbiology and Immunology, Department of / Graduate

A Austrália é um país cuja fauna é um repositório de potenciais novos biofármacos, pois se encontram no continente os animais mais mortais do planeta, dentre eles, as serpentes. A serpente Pseudechis australis (Mulga snake) é a maior serpente venenosa da Austrália e tem ampla distribuição geográfica. Os venenos de serpentes são complexas misturas com proteínas e peptídeos que apresentam uma variedade de atividades biológicas. Devido à riqueza de seus componentes, várias moléculas encontradas no veneno vêm sendo utilizadas com fins terapêuticos, como agentes anticoagulantes ou analgésicos. Apesar dessas informações, existem poucos dados disponíveis sobre os componentes específicos deste veneno. O presente trabalho tem como objetivo isolar e caracterizar as proteases desse veneno, ainda não descritas, um primeiro passo para compreender o papel destas enzimas no processo de envenenamento, assim como seus inibidores endógenos. Estes desempenham uma função protetora da glândula de veneno, inibindo a ação das enzimas in loco, prevenindo assim a degradação do tecido glandular por estas toxinas. O interesse nestes inibidores está relacionado ao seu potencial uso na terapia de diversas doenças como distúrbios da coagulação, hipertensão e câncer. / Australia is a natural repository of some of the deadliest venomous animals on the planet and, as such, a potential source for new toxin-derived drugs. Venomous snakes are among the many potential sources of new promising compounds. Snake venoms are complex mixtures of proteins and peptides that exhibit a variety of biological activities which all are directed towards subduing the prey and/or aggressor. These toxins act disturbing homeostasis, affecting neural transmission, hemostasis, tissue integrity as well as other body functions. Such a a wide array of specific activities has turned snake toxins into successful drugs used for therapeutic purposes, as anticoagulants or analgesic agents. Unlike snake venoms from other parts of the world, there are few records on the venom composition of Australian snakes, turning these into potential sources of new bioactive molecules for drug design. This study aims to isolate and characterize the yet undescribed proteases of the venom of P. australis as well as their endogenous inhibitors, as a first step in understanding the role of these enzymes in the envenoming process.

A leptospirose é uma zoonose, amplamente difundida pelo mundo, causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, que colonizam os túbulos renais de animais silvestres e domésticos. A transmissão ocorre, principalmente, pelo contato direto com água e solo contaminados com a urina de animais infectados que podem ser clinicamente assintomáticos. As leptospiras patogênicas invadem os tecidos do hospedeiro através da penetração da pele lesada ou mucosas da boca, narina e olhos. Logo após ultrapassar as superfícies de contato, as bactérias chegam rapidamente à corrente sanguínea e espalham-se para todos os órgãos causando lesões, principalmente, no fígado e rins onde produzem hemorragia e necrose tecidual. Após a entrada no hospedeiro, a progressão da infecção envolve a adesão das bactérias às células eucarióticas e às proteínas de matriz extracelular seguida pela invasão aos tecidos. Estudos recentes demonstraram que as leptospiras são capazes de se translocarem através das monocamadas celulares, o que poderia ser um mecanismo de evasão do sistema imune e também facilitaria a entrada e saída da corrente sanguínea para infectar órgãos-alvo. O mecanismo envolvido na invasão do patógeno através das barreiras extracelulares não está bem elucidado. Enzimas capazes de degradar proteínas da matriz extracelular poderiam contribuir com a motilidade e quimiotaxia das bactérias durante a invasão. Bactérias patogênicas sintetizam e secretam diferentes tipos de proteases, que atuam degradando colágeno e glicoproteínas entre outras proteínas do hospedeiro. Recentemente, um estudo, utilizando gelatina e caseína como substratos e lisado bacteriano, mostrou haver uma variedade de proteases em Leptospira spp. Análises do genoma indicam a presença de vários genes que codificam prováveis proteases. A comprovação experimental da existência e a caracterização funcional destas proteínas poderão contribuir no entendimento da patogenia da leptospirose. Neste sentido, este trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e caracterização funcional de uma provável colagenase (ColA) de L.interrogans sorovar Copenhageni. As sequências codificantes do domínio de colagenase 1 (D1), do domínio de colagenase 2 (D2) e de ambos os domínios (Full) da ColA foram amplificadas por PCR a partir de DNA genômico de Leptospira e clonadas no vetor de expressão pAE. Os fragmentos D1, D2 e Full da ColA foram expressos em E. coli BL21 - SI e purificados a partir das frações insolúveis por cromatografia de afinidade a níquel. Os fragmentos recombinantes purificados foram utilizados na obtenção dos antissoros policlonais, e as atividades enzimáticas de cada um foram avaliadas. Os antissoros policlonais produzidos em coelho apresentaram elevados níveis de anticorpos detectados por ELISA. Experimentos de Western - blotting demonstraram a presença de proteína ColA em diferentes sorovares patogênicos de Leptospira spp. As proteínas Full e D2 apresentaram atividade catalítica sobre o colágeno desnaturado e sobre peptídeo sintético e atividade hemorrágica em camundongos. Estes resultados indicam que ColA é provavelmente uma proteína de leptospira envolvidas na invasão de tecidos do hospedeiro. / Leptospirosis is a zoonosis widespread throughout the world, caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira, which colonize the renal tubules of wild and domestic animals. Transmission occurs mainly through direct contact with water and soil contaminated with urine of infected animals that may be clinically asymptomatic. Pathogenic leptospires invade host tissues by penetrating damaged skin or the mucous membranes of the mouth, nostrils and eyes. Soon after passing the contact surfaces, leptospires come quickly into the bloodstream and spread to all organs causing damage mainly in the liver and kidneys where they produce hemorrhage and tissue necrosis after entering the host, the progression of the infection involves the adhesion of bacteria to eukaryotic cells and extracellular matrix proteins followed by invasion of tissues. Recent studies have shown that leptospires are able to translocate across cell monolayers, which could be a mechanism for evasion of the immune system and also facilitate the entry and exit from the bloodstream to infect target organs. The mechanism involved in pathogen invasion through extracellular barriers is not well elucidated. Enzymes capable of degrading extracellular matrix proteins could contribute to motility and chemotaxis of bacteria during the invasion. Pathogenic bacteria synthesize and secrete different types of proteases that degrade collagen and glycoproteins among other host proteins. Recently, a study using gelatin and casein as substrates and bacterial lysate showed a variety of proteases in Leptospira spp. Analysis of the genome indicate the presence of several genes encoding probable protease. The experimental proof of the existence and functional characterization of these proteins may contribute to the understanding of the pathogenesis of leptospirosis. In this sense, this work aimed the cloning, expression and functional characterization of a probable collagenase (ColA) from L.interrogans serovar Copenhageni. Coding sequences of the collagenase domain 1 (D1), collagenase domain 2 (D2), and both domains (Full) of the ColA gene were amplified by PCR from genomic Leptospira DNA and cloned into the pAE expression vector. The D1, D2 and Full fragments of ColA protein were expressed in E. coli BL21-SI and purified from the insoluble fractions by nickel affinity chromatography. The purified fragments were used to obtain the polyclonal antiserum, and their enzymatic activities were evaluated by zymography. Rabbit polyclonal antiserum against the recombinant protein fragments were produced with a high antibody level detected by ELISA. Western-blotting experiments demonstrated the presence of ColA protein in different pathogenic serovars of Leptospira. The Full and D2 proteins showed catalytic activity on denatured collagen and synthetic peptide and hemorrhagic activity in mice. These results indicated that ColA is probably a leptospiral protein involved in invasion of host tissues.

A Austrália é um país cuja fauna é um repositório de potenciais novos biofármacos, pois se encontram no continente os animais mais mortais do planeta, dentre eles, as serpentes. A serpente Pseudechis australis (Mulga snake) é a maior serpente venenosa da Austrália e tem ampla distribuição geográfica. Os venenos de serpentes são complexas misturas com proteínas e peptídeos que apresentam uma variedade de atividades biológicas. Devido à riqueza de seus componentes, várias moléculas encontradas no veneno vêm sendo utilizadas com fins terapêuticos, como agentes anticoagulantes ou analgésicos. Apesar dessas informações, existem poucos dados disponíveis sobre os componentes específicos deste veneno. O presente trabalho tem como objetivo isolar e caracterizar as proteases desse veneno, ainda não descritas, um primeiro passo para compreender o papel destas enzimas no processo de envenenamento, assim como seus inibidores endógenos. Estes desempenham uma função protetora da glândula de veneno, inibindo a ação das enzimas in loco, prevenindo assim a degradação do tecido glandular por estas toxinas. O interesse nestes inibidores está relacionado ao seu potencial uso na terapia de diversas doenças como distúrbios da coagulação, hipertensão e câncer. / Australia is a natural repository of some of the deadliest venomous animals on the planet and, as such, a potential source for new toxin-derived drugs. Venomous snakes are among the many potential sources of new promising compounds. Snake venoms are complex mixtures of proteins and peptides that exhibit a variety of biological activities which all are directed towards subduing the prey and/or aggressor. These toxins act disturbing homeostasis, affecting neural transmission, hemostasis, tissue integrity as well as other body functions. Such a a wide array of specific activities has turned snake toxins into successful drugs used for therapeutic purposes, as anticoagulants or analgesic agents. Unlike snake venoms from other parts of the world, there are few records on the venom composition of Australian snakes, turning these into potential sources of new bioactive molecules for drug design. This study aims to isolate and characterize the yet undescribed proteases of the venom of P. australis as well as their endogenous inhibitors, as a first step in understanding the role of these enzymes in the envenoming process.

Algumas enzimas são encontradas facilmente em diferentes microrganismos do ambiente e requerem um destaque especial devido a seu grande valor econômico. As proteases apresentam grande diversidade bioquímica, sendo facilmente manipuláveis, favorecendo dessa maneira suas aplicações biotecnológicas. Três linhagens bacterianas de Bacillus sp. foram isoladas com o objetivo de produzir protease e determinar as condições ótimas de temperatura, pH, e efeito de substratos e substâncias químicas sobre a atividade da enzima, assim como verificar a atividade depilatória e a utilização como agentes de modificação de proteína. As linhagens de Bacillus sp. apresentaram halos de atividade proteolítica em placas de Ágar Leite em diferentes pHs. O padrão proteolítico das enzimas em extrato bruto utilizando inibidores de protease indica que são serina-proteases, com alta especificidade pelo substrato azocaseína, pH e temperatura ótimos de 9,0 e 37ºC, respectivamente. As enzimas mantiveram-se estáveis à 37ºC por 30 minutos, entretanto quando submetidas a uma temperatura de 55ºC, perderam 50% da atividade inicial nos primeiros 20 minutos. A atividade enzimática foi parcialmente inibida por PMSF e benzamidina e totalmente por HgCl2. A adição de detergentes como o SDS ou o Triton X100 ocasionou um leve aumento na atividade das enzimas. Os sobrenadantes das linhagens de Bacillus sp. apresentaram enzimas com a capacidade de promover depilação de peles bovinas. Exames histológicos demonstraram que o tratamento com as enzimas não acarretou danos ao colágeno. Esses resultados indicam que as proteases produzidas pelos isolados apresentaram potencial para aplicação em processos envolvendo hidrólise de queratina, além da utilização como agente de modificação de proteínas. / Some enzymes are easily found in different microorganisms of the environment and they require a special prominence due its great economic value. Proteases present great biochemistry diversity, being easily manipulated allowing in this way, their biotechnological applications. Three Bacillus sp. strains were isolated intending to produce protease and determine optimal conditions of temperature, pH, and effect of chemical substances on the activity of the enzyme, as well as to verify the depilatory activity and utilization as agents protein modification. Bacillus sp. strains showed proteoyitic activity in milk plates in different pH.The proteolytic characteristic of enzymes in crude extract using protease inhibitors indicates that they are serine-proteases, with high specificity to azocasein, with optimal pH and temperature at 9,0 and 37oC, respectively. The enzymes have been kept stable at 37oC for 30 minutes. Nevertheless, when they were subjected to 55oC they lost 50% of their initial activity in the first 20 minutes. The enzymatic activity was partially inhibited by PMSF and benzamidine and totally by HgCl2. The addition of detergents, as SDS and Triton X100, caused a light increase on enzymes activity. The supernatants of Bacillus sp. strains showed enzymes with capacity to depilate bovine skin. Histological evaluation showed that the treatment with enzymes do not promote damage to collagen. These results indicate that proteases produced by isolated present a powerful application in processes involving keratin hydrolysis, as well as the use as an agent that modifies proteins.

Algumas enzimas são encontradas facilmente em diferentes microrganismos do ambiente e requerem um destaque especial devido a seu grande valor econômico. As proteases apresentam grande diversidade bioquímica, sendo facilmente manipuláveis, favorecendo dessa maneira suas aplicações biotecnológicas. Três linhagens bacterianas de Bacillus sp. foram isoladas com o objetivo de produzir protease e determinar as condições ótimas de temperatura, pH, e efeito de substratos e substâncias químicas sobre a atividade da enzima, assim como verificar a atividade depilatória e a utilização como agentes de modificação de proteína. As linhagens de Bacillus sp. apresentaram halos de atividade proteolítica em placas de Ágar Leite em diferentes pHs. O padrão proteolítico das enzimas em extrato bruto utilizando inibidores de protease indica que são serina-proteases, com alta especificidade pelo substrato azocaseína, pH e temperatura ótimos de 9,0 e 37ºC, respectivamente. As enzimas mantiveram-se estáveis à 37ºC por 30 minutos, entretanto quando submetidas a uma temperatura de 55ºC, perderam 50% da atividade inicial nos primeiros 20 minutos. A atividade enzimática foi parcialmente inibida por PMSF e benzamidina e totalmente por HgCl2. A adição de detergentes como o SDS ou o Triton X100 ocasionou um leve aumento na atividade das enzimas. Os sobrenadantes das linhagens de Bacillus sp. apresentaram enzimas com a capacidade de promover depilação de peles bovinas. Exames histológicos demonstraram que o tratamento com as enzimas não acarretou danos ao colágeno. Esses resultados indicam que as proteases produzidas pelos isolados apresentaram potencial para aplicação em processos envolvendo hidrólise de queratina, além da utilização como agente de modificação de proteínas. / Some enzymes are easily found in different microorganisms of the environment and they require a special prominence due its great economic value. Proteases present great biochemistry diversity, being easily manipulated allowing in this way, their biotechnological applications. Three Bacillus sp. strains were isolated intending to produce protease and determine optimal conditions of temperature, pH, and effect of chemical substances on the activity of the enzyme, as well as to verify the depilatory activity and utilization as agents protein modification. Bacillus sp. strains showed proteoyitic activity in milk plates in different pH.The proteolytic characteristic of enzymes in crude extract using protease inhibitors indicates that they are serine-proteases, with high specificity to azocasein, with optimal pH and temperature at 9,0 and 37oC, respectively. The enzymes have been kept stable at 37oC for 30 minutes. Nevertheless, when they were subjected to 55oC they lost 50% of their initial activity in the first 20 minutes. The enzymatic activity was partially inhibited by PMSF and benzamidine and totally by HgCl2. The addition of detergents, as SDS and Triton X100, caused a light increase on enzymes activity. The supernatants of Bacillus sp. strains showed enzymes with capacity to depilate bovine skin. Histological evaluation showed that the treatment with enzymes do not promote damage to collagen. These results indicate that proteases produced by isolated present a powerful application in processes involving keratin hydrolysis, as well as the use as an agent that modifies proteins.

Algumas enzimas são encontradas facilmente em diferentes microrganismos do ambiente e requerem um destaque especial devido a seu grande valor econômico. As proteases apresentam grande diversidade bioquímica, sendo facilmente manipuláveis, favorecendo dessa maneira suas aplicações biotecnológicas. Três linhagens bacterianas de Bacillus sp. foram isoladas com o objetivo de produzir protease e determinar as condições ótimas de temperatura, pH, e efeito de substratos e substâncias químicas sobre a atividade da enzima, assim como verificar a atividade depilatória e a utilização como agentes de modificação de proteína. As linhagens de Bacillus sp. apresentaram halos de atividade proteolítica em placas de Ágar Leite em diferentes pHs. O padrão proteolítico das enzimas em extrato bruto utilizando inibidores de protease indica que são serina-proteases, com alta especificidade pelo substrato azocaseína, pH e temperatura ótimos de 9,0 e 37ºC, respectivamente. As enzimas mantiveram-se estáveis à 37ºC por 30 minutos, entretanto quando submetidas a uma temperatura de 55ºC, perderam 50% da atividade inicial nos primeiros 20 minutos. A atividade enzimática foi parcialmente inibida por PMSF e benzamidina e totalmente por HgCl2. A adição de detergentes como o SDS ou o Triton X100 ocasionou um leve aumento na atividade das enzimas. Os sobrenadantes das linhagens de Bacillus sp. apresentaram enzimas com a capacidade de promover depilação de peles bovinas. Exames histológicos demonstraram que o tratamento com as enzimas não acarretou danos ao colágeno. Esses resultados indicam que as proteases produzidas pelos isolados apresentaram potencial para aplicação em processos envolvendo hidrólise de queratina, além da utilização como agente de modificação de proteínas. / Some enzymes are easily found in different microorganisms of the environment and they require a special prominence due its great economic value. Proteases present great biochemistry diversity, being easily manipulated allowing in this way, their biotechnological applications. Three Bacillus sp. strains were isolated intending to produce protease and determine optimal conditions of temperature, pH, and effect of chemical substances on the activity of the enzyme, as well as to verify the depilatory activity and utilization as agents protein modification. Bacillus sp. strains showed proteoyitic activity in milk plates in different pH.The proteolytic characteristic of enzymes in crude extract using protease inhibitors indicates that they are serine-proteases, with high specificity to azocasein, with optimal pH and temperature at 9,0 and 37oC, respectively. The enzymes have been kept stable at 37oC for 30 minutes. Nevertheless, when they were subjected to 55oC they lost 50% of their initial activity in the first 20 minutes. The enzymatic activity was partially inhibited by PMSF and benzamidine and totally by HgCl2. The addition of detergents, as SDS and Triton X100, caused a light increase on enzymes activity. The supernatants of Bacillus sp. strains showed enzymes with capacity to depilate bovine skin. Histological evaluation showed that the treatment with enzymes do not promote damage to collagen. These results indicate that proteases produced by isolated present a powerful application in processes involving keratin hydrolysis, as well as the use as an agent that modifies proteins.