Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Bruno Moreira Carneiro / Banca: Maurício Lacerda Nogueira / Banca: Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Mello / Resumo: A hepatite C é consequência da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) e estima-se que cerca de 150 milhões de pessoas em todo o mundo estejam cronicamente infectadas. Estudos têm demonstrado interações entre proteínas virais e do hospedeiro durante o ciclo de replicação do HCV e estas interações podem ser utilizadas para o desenvolvimento de novas terapias contra a hepatite C. As proteínas de choque térmico (Hsp) são proteínas celulares que interagem com proteínas do HCV e a inibição destas proteínas poderiam reduzir a replicação viral. Neste estudo, as proteínas celulares Hsp90 e Hsp27 foram inibidas por siRNA isoladamente ou em combinação com a inibição das regiões virais 5'UTR, NS3 e NS5A. Foi utilizada uma cultura celular estável Huh7 expressando um replicon subgenomico do HCV e todas as moléculas de siRNA dirigidas ao genoma do vírus mostraram eficiência na redução da replicação viral. A melhor resposta foi obtida pelo siRNA 5'UTR, que apresentou bons resultados também nos estudos à longo prazo. A inibição da proteína celular Hsp27 aumentou os níveis de replicação do vírus, entretanto a supressão de Hsp90 mostrou redução da replicação viral e a utilização desta molécula juntamente com a molécula de siRNA dirigida para 5'UTR mostraram uma diminuição de mais de 90% da replicação viral. Entretanto a inibição prolongada de Hsp90 levou à morte celular, evidenciando o importante papel desta proteína na sobrevivência das células. Portanto o presente trabalho sugere que a terapia combinada de siRNAs pode ser uma alternativa eficiente no combate à hepatite C em pacientes com HCC uma vez que a inibição de Hsp90 atua tanto na supressão tumoral quanto na replicação do HCV / Abstract: Hepatitis C is a consequence of infection by hepatitis C virus (HCV) and it is estimated that approximately 150 million people are chronically infected worldwide. Several studies have demonstrated interactions between viral and host proteins during the HCV replication cycle and these interactions might be used for development of new therapies against hepatitis C. The heat shock proteins (Hsp) are cellular proteins that interact with proteins of HCV and inhibition of these proteins could reduce viral replication. In this study, cellular proteins Hsp90 and Hsp27 were inhibited by siRNA targeting the mRNA of these proteins in combination with siRNA to viral 5'UTR region, NS3 and NS5A. We used a stable cell line expressing HCV subgenomic replicon and all siRNA molecules targeting the viral genome showed effectiveness in reducing viral replication. The best response was achieved by siRNA 5'UTR, which showed good results on long term studies. The inhibition of cellular protein Hsp27 increased virus replication, but knockdown of Hsp90 showed reduced viral replication. Use of this molecule together with the siRNA molecule directed to 5'UTR showed a decrease of more than 90% viral replication. However, the prolonged inhibition of Hsp90 led to cell death, demonstrating the important role of this protein in cell survival. Finally this work suggests that the combination therapy of siRNAs can be an effective alternative to treat hepatitis C in patients with HCC since reduction of Hsp90 expression if effective on tumor suppression and in HCV replication / Mestre

Orientador: Marcos Hikar Toyama / Banca: Alessandra da Silva Augusto / Banca: Patricia M. C. Moraes Valenti / Resumo: O Camarão da Amazônia, Macrobrachium amazonicum, tem um grande potencial para a aquicultura e possui uma ampla distribuição na América do Sul oriental. Seu cultivo envolve a utilização de rações comerciais, mas até o presente momento não existem rações balanceadas para essa espécie devido à falta de informações sobre o metabolismo desses animais. A qualidade das rações, não está associada diretamente a quantidade de proteínas, e lipídeos presentes, mas sim ao balanço de aminoácidos e ácidos graxos que as compõem. Ainda, estudos sugerem que os lipídios, colesterol, e carboidratos complexos sejam nutrientes importantes já que estão relacionados à maturação gonadal, ao desenvolvimento e crescimento desses animais. Alguns estudos indicam que a proteína é um dos principais nutrientes orgânicos para os Penaeus, porém o mesmo não ocorre para camarões dulcícolas. Dessa maneira, o presente estudo tem como objetivo compreender de uma melhor forma o metabolismo energético de M. amazonicum pela avaliação dos níveis de colesterol, triglicerídeos, proteínas, lipídios e carboidratos quando alimentados com dois tipos diferentes de rações para camarão Penaeus disponíveis no mercado (P38 e V35) e uma ração alternativa de menos custo usada na criação de tilápias (T32). Machos acima de três gramas do morfotipo Pinça cor-de-canela (CC) de M. amazonicum foram coletados de viveiros, transferidos para aquários e foram submetidos a três tipos de dietas com diferentes rações comerciais P38, V35 e T32 durante nove dias. Foram realizados testes para averiguar as concentrações totais de proteínas e carboidratos solúveis, lipídeos e umidade dos camarões e das rações. Foram verificados também os níveis de colesterol, triglicerídeos, carboidratos, proteínas plasmáticas e os principais lipídeos, triglicerídeos e fosfolipídios presentes... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Amazon Shrimp, Macrobrachium amazonicum has great potential for aquaculture and has a wide distribution in eastern South America. Its farming involves the use of commercial feeds, but to date there are no balanced feeds for this species due to lack of information about these animals metabolism. The quality of the feed is not directly associated with the total amount of protein or lipids, but the amount of each amino acids and fatty acids that compose them. On the other hand, studies suggest the lipids, cholesterol, and carbohydrates as the major nutrients as they are related to gonadal maturation development and growth of these animals. Studies suggest that proteins are the main energy source for Penaeus shrimps however this is not wholly true for praws. Thus, this study aims to understand in a better way the energetic metabolism of M. amazonicum evaluated by the levels of cholesterol, triglycerides, carbohydrates, proteins, while feed with commercial ration, two used in Penaues aqualculture (P38 and V35) and one alternative cheaper feed used in tilapia aquaculture (T32). Cinnamon Claw (CC) males above three grams of M. amazonicum ware colected from farms, transferred to tanks and ware feed with three diets P38, V35 and T32 for nine days. Total soluble carbohydrates, proteins lipids and moisture content tests of the shrimp and rations ware conducted. Also ware checked cholesterol, triglycerides, carbohydrates, proteins levels from hemolymph and major fat acids, triglycerides and phospholipids in the abdominal muscle and hepatopancreas. Diets V35 and T32 showed the best responses to mass gain and metabolic pattern. Despite feed T32 ware formulated for fishes aquaculture the environment they live are similar to those macrobrachiuns lives, which may have resulted in a better carbohydrate and fat acids, as ω-6/ω-3, balance. Proteins ware apparently well absorbed in ration with... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Kleber Tomás de Resende / Coorientador: Izabelle Auxiliadora Molina de Almeida Teixeira / Coorientador: Americo Garcia da Silva Sobrinho / Banca: Jane Maria Bertocco Ezequiel / Banca: Márcia Helena da Rocha Fernandes / Banca: Heraldo César Gonçalves / Banca: Renata Helena Branco Arnandes / Resumo: Este trabalho teve por objetivo determinar a composição corporal e estimar as exigências líquidas de energia, proteína e minerais, para mantença e ganho de peso de caprinos Saanen, machos não castrados, dos 30 aos 45 kg de peso vivo. As exigências foram divididas em mantença e ganho de peso, de acordo com método fatorial. No cálculo das exigências de mantença foram utilizados 18 animais, subdivididos em três níveis nutricionais: alimentados ad libitum, com 30 e 60% de restrição, e no cálculo das exigências de ganho foram utilizados 18 animais, alimentados à vontade e abatidos com 30, 37,5 e 45 kg de peso vivo, e as avaliações foram feitas pelo método direto por meio de abate comparativo. A composição corporal dos animais variou de: 60 a 57% de água, 30 a 42% de matéria seca, 6,79 a 6,74% de matéria mineral, 8,8 a 14,6% de gordura e 24,7 a 27,5% de proteína; para animais de 30 a 45 kg de peso vivo. As exigências líquidas diárias para mantença de caprinos Saanen machos, dos 30 aos 45 kg de peso vivo, foram 0,376 g de PLm/kg PCV0,75 e 48,24 kcal de ELm/kg PCV0,75. Para ganho de peso os valores observados foram de 298 a 333 g PLg/dia/kg ganho de peso de corpo vazio, o que é equivalente a 230,32 a 292,14 g PLg/dia/kg ganho de peso vivo. E exigências de 2,7 a 3,4 Mcal ELg/kg ganho de peso de corpo vazio; o que equivale a 2,1 a 3,0 Mcal de ELg/dia/kg de ganho de peso vivo. Os resultados encontrados mostram que caprinos, machos, na fase final de crescimento requerem menos proteína e energia, que cabritos jovens na fase inicial de crescimento. Para minerais, as exigências líquidas diárias para mantença variaram de: 0,80 a 1,20 g de ferro; 0,05 a 0,07 g de potássio; 0,58 a 0,87 g de cálcio; 0,01 a 0,02 g de magnésio; 0,02 a 0,03 g de cobre; 0,02 a 0,03 g de zinco; e 0,005 a 0,008 g de manganês, para caprinos Saanen... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This experiment aimed to determine body composition and estimate the net requirements of energy, protein and minerals for maintenance and gain of Saanen kid goats, males, on final growth phase, with live weight from 30 to 45 kg. The requirements are divided into maintenance and gain, calculated by the factorial method. In the maintenance requirements were used 18 animals, subdivided into three nutritional levels: ad libitum, 30 and 60% of food restriction, and in the gain requirements were used 18 animals fed ad libitum and slaughtered at 30, 37.5 and 45 kg of live weight, and assessments were made by direct method using comparative slaughters. Animals body composition ranged from 60 to 57% water, 30 to 42% dry matter, 6.79 to 6.74% ash, 8.8 to 14.6% fat and 24.7 to 27.5% protein, for animals from 30 to 45 kg of body weight. Daily net requirements for maintenance were: 0.376 g net protein/kg EBW0.75 and 48.24 kcal net energy/kg EBW0.75, animals from 30 to 45 kg live weight. To body weight gain, values found were of 298 to 333 g daily net protein/kg of EBW gain, which the same of 230.32 and 292.14 g to daily net protein/kg live weight gain. And daily net energy requirements of 2.7 to 3.4 Mcal/kg EBW gain, which the same of 2.1 to 3.0 Mcal/kg live weight. That results showing that animals, male goats, from 30 to 45 kg of body weight needed less protein and energy than young kids. To minerals, the requirements had varied between 0.80 and 1.20 g of iron, 0.05 and 0.07 g of potassium, 0.58 and 0.87 g of calcium, 0.01 and 0.02 g of magnesium, 0.02 and 0.03 g of copper, 0.02 and 0.03 mg of zinc, 0.005 and 0.008 g of manganese, respectively, for goats with 30 and 45 kg of live weight. Gain requirements found, for each kilo live weight gain, were: 4.17 and 3.96 g of iron, 1.60 and 1.64 g... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Banca: Fabiana Ferreira Fonseca / Banca: José Antonio Dell'Aqua Junior / Banca: Arlindo de Alencar Araripe Noronha Moura / Banca: Lucilene Delazari dos Santos / Resumo: O objetivo deste estudo foi investigar os parâmetros seminais, a expressão de proteínas do plasma seminal (PS) e da membrana plasmática (MP) correlacionando-os com a fertilidade de garanhões Quarto de Milha (Experimento I); e caracterizar o proteoma do PS e da MP de espermatozoides por eletroforese 2D e espectrometria de massas (Experimento II). No Experimento I, três ejaculados de 10 garanhões férteis e 9 garanhões subférteis foram avaliados quanto aos parâmetros de cinética, integridade de membrana plasmática e acrossomal e cromatina espermática. Proteínas do PS e extraídas da MP foram submetidas a eletroforese 2D e espectrometria de massas (MALDI-TOF/TOF) e análise shotgun (LC-ESIQTOF). Foi observada associação positiva da fertilidade com a MT, MP, LIN e RAP. Um spot diferencial (28 kDa; pI 5,6) do PS apresentou maior expressão em garanhões subférteis. Não foi observada diferença na expressão proteica na MP entre os garanhões. Na análise shotgun, foram identificadas 53 proteínas únicas no PS de garanhões férteis, como a SPATA21 e 103 nos garanhões subférteis, como a clusterina. Na MP, foram identificadas 269 proteínas em animais com alta fertilidade como a SP-1, SMOK e PLC, e 167 proteínas únicas em garanhões subférteis. No Experimento II, o PS e o extrato de MP apresentaram predominância de polipeptídeos com massa molecular < 35 kDa. Proteínas ribossomais foram detectadas nas duas amostras. A análise shotgun identificou 66 proteínas no PS e 291 no extrato de MP; envolvidas no processo reprodutivo como as kallikrein, SP-1, SP-2, Fn-2 e Fn-3, SPATA. Em conclusão, o estudo de garanhões com distintos índices de concepção permitiu a identificação de proteínas únicas do PS e da MP e de parâmetros de cinética espermática relacionados a fertilidade que podem servir como base para determinação de marcadores de fertilidade em garanhões. Uma série de proteínas da MP podem ser originárias do... / Abstract: The aim of this study was to investigate the seminal parameters, the expression of proteins in seminal plasma (SP) and plasma membrane (PM) correlating them with the fertility of Quarter Horses stallions (Experiment I); and characterize the proteome of SP and PM sperm by 2D electrophoresis and mass spectrometry (Experiment II). In Experiment I, three ejaculates from 10 fertile stallions and nine subfertile stallions were evaluated for kinetic parameters, plasma membrane integrity and acrosome and sperm chromatin. Proteins extracted from the SP and MP were submitted to 2D electrophoresis coupled to mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF) and shotgun analysis (LC-ESIQTOF). Positive association of fertility with MT, MP, LIN and RAP was observed. A differential spot (28 kDa, pI 5.6) of SP showed higher expression in subfertile stallions. No difference in protein expression in PM among stallions was observed. In the shotgun analysis, 53 unique proteins in the SP of fertile stallions, as SPATA21, and 103 in subfertile stallions, as clusterin, were identified. In PM, 269 proteins were identified in animals with high fertility as SP-1, SMOK and PLC, and 167 unique proteins in subfertile stallions. In Experiment II, the SP and the extract of PM showed a predominance of polypeptides with molecular mass < 35 kDa. Ribosomal proteins were detected in both samples. Shotgun analysis identified 66 proteins in SP and 291 in the extract of PM; involved in the reproductive process such as kallikrein, SP-1, SP-2, Fn-2 and Fn-3, SPATA. In conclusion, the study of stallions with distinct conception rates allowed the identification of unique proteins of SP and PM and kinetic parameters related to fertility which may serve as basis for determination of fertility biomarkers in stallions. A number of PM proteins may originate from the SP and be related to sperm functionality and interaction between gametes. Although, the use of modern proteomic approach allowed the ... / Doutor

Orientador: Euclides Braga Malheiros / Coorientador: Áulus Cavalieri Carciofi / Banca: Ricardo Souza Vasconcellos / Banca: Márcia de Oliveira Sampaio Gomes / Banca: Jane Maria Bertocco Ezequiel / Banca: Thaila Cristina Putarov / Resumo: O objetivo do estudo foi avaliar a inclusão de fontes protéicas não convencionais na alimentação de cães e gatos. Para isso foram conduzidos três experimentos. Dois estudos foram realizados avaliando a inclusão de 5% de duas apresentações de levedura de cana-de-açúcar (Levedura 1 - LEV1, Levedura 2 - LEV2) e de glúten de milho 60% (GM) em dieta para cães e gatos à base de farinha de vísceras de frango (FVF). Cada estudo foi conduzido em experimento com 24 cães e gatos distribuídos em blocos casualizados com quatro tratamentos (FVF, GM; LEV1 e LEV2) e seis repetições. Os coeficientes de digestibilidade aparente dos nutrientes (CDA), produtos de fermentação e qualidade das fezes e o balanço de nitrogênio foram determinados por coleta total de fezes e urina. A palatabilidade das rações foi avaliada pelo método de duas vasilhas. O metabolismo de ácido úrico foi avaliado medindo-se sua concentração sérica, urinária e eliminação renal diária e o metabolismo da uréia foi avaliado mensurando sua concentração urinária e eliminação renal diária. No terceiro estudo,foram realizados dois experimentos no primeiro, foram estudados dois concentrados proteicos de soja, um com granulometria reduzida (CPSgr) e outro com granulometria elevada (CPSge) sobre as características de extrusão e macroestrutura dos extrusados. Foram formuladas 8 dietas experimentais: controle, à base de farinha de vísceras de frango (FVF), dieta com inclusão de 45% de glúten de milho 60% (GM), dietas com CPSgr (CPSgr15... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of the study was the inclusion of unconventional sources of protein in the feed dogs and cats. For that they were conducted three experiments. Two studies were conducted to evaluate the inclusion of 5% two presentations of sugarcane yeast (Yeast 1 - LEV1, Yeast 2 - LEV2) and Corn Gluten 60% (GM) in the diet for cats and dogs based of chicken viscera flour (FVF). Each study was conducted in an experiment with 24 dogs and cats distributed in randomized blocks with four treatments (FVF, GM; LEV1 and LEV2) and six repetitions. The apparent digestibility of nutrients (CDA), fermentation products and stool quality and nitrogen balance were determined by total collection of feces and urine. The palatability of the feed was evaluated by two canisters method. Uric acid metabolism was evaluated by measuring serum levels, urinary and daily renal elimination and metabolism of urea was evaluated by measuring its urinary concentration and daily renal elimination. In the third study, two experiments were conducted in the first, they were studied two concentrated soy protein, with reduced particle size (CPSgr) and the other with high grain size (CPSge) on the extrusion characteristics and macro-structure of the extrudates. 8 experimental diets were formulated: control, flour-based chicken viscera (FVF), dietary inclusion of 45% to 60% corn gluten (GM), diets CPSgr (CPSgr15, CPSgr30, CPSgr45), with levels of inclusion of 15, 30 and 45% and diets CPSge (CPSge15, CPSge30, CPSge45)... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Maria Célia Portella / Coorientador: Rodrigo Takata / Banca: Rosangela Kiyoko Jomori Bonichelli / Banca: Natália de Jesus Leitão / Banca: Débora Machado Fracalossi / Banca: Wilson Massamitu Furuya / Resumo: Esta tese está dividida em três capítulos, sendo o primeiro uma revisão sobre os temas estudados e, os seguintes, os resultados da pesquisa, descritos na forma de artigos para publicação. Foram realizados dois experimentos para determinar a exigência proteica de larvas (ca. 70 mg de peso inicial) e juvenis pós-metamórficos (ca. 250 mg de peso inicial) de tambaqui Colossoma macropomum, e um experimento para determinar o nível máximo de subsituição da fração proteica das dietas semi-purificadas por uma mistura de aminoácidos cristalinos. Para o primeiro estudo de exigência proteica de tambaquis na primeira fase de desenvolvimento, seis dietas semi-purificadas com quantidades crescentes de proteína foram ofertadas (D36,4; D42,1; D47,5; D53,2; D62,0; D68,5), e para a segunda fase de desenvolvimento foram ofertadas sete dietas com quantidades crescentes de proteína (D19,9; D26,2; D31,9; D36,4; D42,1; D47,5; D53,2). Os níveis de 49,46 % e 31,9 % de proteína foram suficientes para atender às exigências em proteína bruta de larvas de tambaqui e juvenis pós-metamorfose, respectivamente. Os níveis de proteína afetaram o desenvolvimento das fibras musculares das larvas (P<0,05), enquanto os juvenis demonstraram diferenças de crescimento muscular entre os tratamentos somente para uma classe de diâmetro de fibra (P>0,05). No segundo estudo, foram utilizados juvenis de tambaqui com peso médio inicial de 200 mg e testadas cinco dietas com níveis crescentes de substituição do perfil de amin... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This thesis is divided into three chapters, the first one presents an overview of the state-of-art of the subject, and the others describe the results, written as articles for publication. Two experiments were conducted to determine the protein requirement of larvae (ca. 70 mg initial weight) and postmetamorphosis juveniles (ca. 250 mg initial weight) of tambaqui Colossoma macropomum, and another experiment was carried out to determine the maximum level of the protein fraction that could be replaced by a mixture of synthetic amino acids in semi purified diets. For the study of protein requirement of tambaqui in first stage of development, six semi purified diets with increasing levels of protein were offered (D36.4; D42.1; D47.5; D53.2; D62.0; D68.5). In second stage of development, seven semi purified diets with increasing levels of protein were offered to tambaqui juveniles (D19.9; D26.2; D31.9; D36.4; D42.1; D47.5; D53.2). The levels of 46.89 % and 30.65 % of crude protein were enough to meet the protein requirement of tambaqui larvae and postmetamorphic juveniles, respectively. Protein levels affect the development of muscle fibers in tambaqui larvae (P<0.05), and only one diameter muscle fiber class in the juveniles (P>0.05). In the second study, tambaqui juveniles with initial weight of 0.2 g were fed with five semi purified diets with increasing levels of protein (casein and gelatin) replacement by crystalline amino acids mixture at levels of 0, 25, 50, 75 and 90 %. Th... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Deilson Elgui de Oliveira / Coorientador: Ramon Kaneno / Banca: Flávia Karina Delella / Banca: Bryan Eric Strauss / Resumo: O vírus de Epstein-Barr (Epstein-Barr virus - EBV) infecta latentemente mais de 90% da população humana. A infecção viral está associada ao desenvolvimento de alguns cânceres, incluindo o carcinoma de nasofaringe. Alguns estudos sugerem a contribuição na evasão imune e progressão dos cânceres causados pelo EBV. Diferentes variantes da proteína latente de membrana 1 (LMP1), principal produto do EBV, são discriminadas, principalmente, por variações nos domínios transmembrana e carboxi-terminais da proteína. O domínio C-terminal de LMP1 é capaz de ativar vias de sinalização intracelular que regulam os fenômenos de migração e invasão celular. Adicionalmente, induz síntese de produtos que degradam a matriz extracelular e favorecem a angiogênese. Até o momento, não se sabe se diferentes variantes de LMP1 apresentam propriedades distintas no que se refere a esses fenômenos do escape imune e progressão tumoral. Assim sendo, no presente estudo avaliamos a influência das variantes de LMP1 sobre a capacidade de migração e invasão celular in vitro e a imunomodulação de HLA-ABC e HLA-DR, CD80, CD83, CD54, CD40 e PD-L1 nas linhagens celulares HEK293T e NP69. Observamos que as variantes Alaskan, Med+, China 1 e China 2 induziram a migração celular da linhagem NP69 de maneira distinta quando comparadas entre si e com a célula sem LMP1. Observamos, também, maior capacidade de invasão celular das células HEK293T-China 2 em comparação à HEK293T. Com relação à expressão de moléculas envolvidas na modulação da resposta imune, observamos que a transfecção de LMP1 aumentou a expressão de CD80 e CD83 apenas nas células NP69-Alaskan, e de CD54 e PD-L1 de maneira similar nas células NP69-LMP1. Conclui-se, portanto, que LMP1 promove migração distinta das células NP69-LMP1 e invasão de células HEK293T-China 2, e modula a expressão de moléculas envolvidas no escape imunológico / Abstract: The Epstein-Barr virus (EBV) latently infects more than 90% of human adults. Viral infection is associated to the development of some cancers, including nasopharyngeal carcinoma. Oncogenic potential of the virus is usually studied in terms of its capacity to transform the infected cells nevertheless some studies suggest that the EBV infection may also contribute to immune evasion, and cancer progression. Several latent membrane protein 1 (LMP1) variants are described, discriminated mainly by variations in its C-terminal and the transmembrane domains of the protein. LMP1 C-terminal domain activate intracellular signaling pathways that regulated cell migration; moreover, LMP1 upregulate the expression of cell proteins with roles in extracellular matrix remodeling and angiogenesis. Currently it is unknown whether different LMP1 variants possess distinct properties regarding biological phenomena relevant to immune evasion, and cancer progression. Thus, in the present study we evaluated the in vitro migration and invasiveness, and immunomodulation of HLA-ABC, HLA-DR, CD80, CD83, CD54, CD40, and PD-L1 of HEK293T cells, and NP69 cells. We observed that Alaskan, Med+, China 1, and China 2 stimulates distinctly migration of NP69 when compared to cell without LMP1. We also saw that HEK293T-China 2 had a pronounced cellular invasion when compared to HEK293T. In regard of expression of molecules involved in immune response modulation, we observed that LMP1 enhanced expression of CD80, and CD83 in NP69-Alaskan cells; and CD54, and PD-L1 in a similar level in NP69-LMP1 cells. In summary, LMP1 promote distinct cellular migration in NP69LMP1 cells, and HEK293T-China 2 invasion, and is capable of modulate molecules involved in immune evasion / Mestre

Orientador: Francisco Eduardo Martinez / Coorientador: Marcelo Martinez / Banca: Luiz Fernando Takase / Banca: Daniela Carvalho dos Santos / Banca: Bruno César Schimming / Banca: Cilmery Suemi Kurokaw / Resumo: Introdução: O cerebelo é suscetível aos efeitos lesivos do etanol em exposições agudas ou crônicas, em diferentes idades, podendo ocasionar alterações motoras, de aprendizado, cognitivas e favorecer a morte celular apoptótica. Nosso objetivo foi avaliar a apoptose nos neurônios de Golgi, Purkinje e células granulares do cerebelo de ratos adultos da variedade UChA. Metodologia: Os ratos foram divididos em dois grupos experimentais (20 ratos por grupo): um grupo controle, composto de animais UChA abstinentes e o grupo experimental, formado por ratos UChA, consumidores voluntários de etanol a 10% (˂ 2g etanol/Kg peso corpóreo/dia). Dos 65 dias aos 120 dias de idade, os animais receberam solução de etanol a 10%. Aos 120 dias, os animais foram anestesiados e preparados para eutanásia. O cerebelo foi então analisado por microscopia eletrônica de transmissão (MET), imunoistoquímica para apoptose, caspase-3 (próapoptótica), XIAP (antiapoptótica) e IGF-1R nos neurônios de Golgi, Purkinje e granulares. Avaliou-se também por RT-PCR os genes reguladores da caspase-3, XIAP e IGF-1R no córtex cerebelar dos grupos estudados. Resultados: Os animais UChA mostraram acúmulo de gotas lipídicas, presença de núcleos eletrodensos nos neurônios granulares e de Purkinje, desorganização do corpo medular do cerebelo com alterações na bainha de mielina no córtex cerebelar. Identificou-se também aumento significativo na imunomarcação de caspase-3 e XIAP nos neurônios de Purkinje e granulares. A fragmentação do DNA foi significativa nas células de Purkinje. O IGF-1R não apresentou alterações. Não houve diferenças significativas na expressão dos genes de caspase-3, XIAP, e o IGF-1R. Conclusão: O etanol induz apoptose nas células de Purkinje e granulares do cerebelo de ratos adultos UChA / Abstract: Introduction: The cerebellum is susceptible to the harmful effects of ethanol in acute or chronic exposures at different ages, which may cause motor, learning and cognitive disorders and promote apoptotic cell death (PCD) as well. Our objective was to evaluate apoptosis in Golgi and Purkinje neurons and in granular cell disease of the cerebellum of adult rats of the type UChA. Methodology: The rats were divided in two experimental groups (20 rats per group): a control group, consisting of abstinent UChA animals and the experimental group, formed by UChA rats, volunteers consumers of 10% ethanol (˂ 2g ethanol / kg weight body / day). From 65 day-age to the 120 day-age, the animals received 10% ethanol solution. After 120 days, the rats were anesthetized and prepared for euthanasia. The cerebellum was then analyzed by transmission electron microscopy (TEM), immunohistochemistry to apoptosis, caspase-3 (pro-apoptotic), XIAP (anti-apoptotic) and IGF-1R in Golgi, Purkinje neurons and granular as well. It was also evaluated by RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) the regulatory genes caspase-3, XIAP and IGF-1R in the cerebellar cortex of groups. Results: The UChA animals showed accumulation of lipid droplets, presence of electron-nuclei in granule neurons and Purkinje, disorganization of the medullary body of the cerebellum with some changes in the myelin sheath of the cortex. It was also identified significant increase in the Immunostaining caspase-3 and XIAP in Purkinje neurons and granular. The DNA fragmentation was significant in Purkinje cells. The IGF-1R didn't have any change though. There were no significant differences in the formulation of caspase-3 genes, XIAP and IGF-1R. Conclusion: Ethanol induces apoptosis in granular and Purkinje cells of the cerebellum of adult UChA rats / Doutor

Orientador: Ramon Kaneno / Coorientador: Graziela Gorete Romagnoli / Banca: Maria Teresinha Serrão Peraçoli / Banca: Orlando Garcia Ribeiro Filho / Resumo: Estudos prévios têm demonstrado que baixas concentrações de agentes antineoplásicos como ciclofosfamida e paclitaxel (PAC) modulam positivamente a resposta imune, estimulando linfócitos T e células dendríticas (DCs). Além disso, são capazes de aumentar a imunogenicidade de células de câncer colorretal humano HCT-116, e de induzir a transcrição de genes de proteínas de choque térmico (HSPs). No presente trabalho, tivemos como objetivo avaliar a expressão das HSPs 40, 70 e 90 e comparar o efeito da concentração efetiva mínima (CEM) com a concentração não-tóxica (CNT) de PAC sobre a imunogenicidade das células HCT-116. Células HCT-116 foram tratadas com a CEM ou com a CNT de PAC. Lisados tumorais foram analisados quanto à expressão das HSPs e utilizados para sensibilizar DCs derivadas de monócitos de sangue periférico de indivíduos normais. As DCs foram avaliadas quanto ao seu fenótipo e foram co-cultivadas com linfócitos T alogênicos para a avaliação da capacidade de estimulação desses linfócitos. O tratamento das células tumorais com ambas as concentrações da droga induziu o aumento da expressão de HSP40, enquanto a produção de HSP70 e HSP90 foram aumentadas apenas pela CEM e pela CNT, respectivamente. Observou-se ligeiro, mas não significante aumento da capacidade de indução da resposta alogênica. Houve também uma tendência ao aumento da expressão de CD40 nos grupos HCT, CEM e CNT. É possível que a expressão das HSPs contribua para o aumento de imunogenicidade induzido pelo PAC. A CEM é menos eficiente que a CNT em aumentar a imunogenicidade das células tumorais, mas não prejudica a capacidade das DCs de induzir a resposta alogênica nem seus marcadores fenotípicos de ativação / Abstract: Colorectal cancer (CRC) is one of the main causes of death worldwide and its conventional treatment is based on surgery, cytotoxic chemotherapy and radiotherapy, or a combination of these therapeutic modalities. The main chemotherapeutic agents for fighting CRC are metrotexate, 5-aza-2-deoxycitidine, taxans and 5-fluorouracil. Usually, their administration is based on maximum tolerable doses, but it has been shown that low concentrations of most of these drugs upregulate the immune system, both enhancing the immune responsiveness and increasing the immunogenicity of tumor cells. These features are associated with translational changes of a couple of genes, among them, there is an increased expression of heat-shock proteins (HSPs). Although the expression of HSPs may represent an adaptive response of tumor cells to the drug-induced damages, there is evidence that some of these proteins are fundamental for antigen processing and presentation by antigen-presenting cells. Then, in the present review we aimed to show that increased expression of HSPs by drug-treated tumor cells may be favorable for the development of an effective immune response, and that this phenomenon should enhance the combinatory schedules of chemotherapy and immunotherapy / Mestre

Orientador: Mario Sergio Palma / Banca: Emer Suavinho Ferro / Banca: Norberto Peporinel Lopes / Banca: José César Rosa / Banca: Solange Maria de Toledo Serrano / Resumo: As aranhas construtoras de teia aérea orbital tornaram-se eficientes produtoras de diferentes tipos de sedas. Essas sedas são caracterizadas pela notável diversidade em sua composição química, estrutura e função, que vai desde a construção da teia orbital até o casulo. A seda produzida pelas aranhas são filamentos proteicos, constituindo uma interessante relação de estrutura-função e propriedades mecânicas, sendo produzida por um conjunto de glândulas abdominais. As fibras produzidas pela glândula ampulada maior são um dos tipos mais importantes de fibras, sendo um material nanoestruturado predominantemente composto por duas proteínas estruturais, espidroína-1 e espidroína-2. Enquanto que as fibras produzidas pela glândula flageliforme são compostas somente por uma proteína, a proteína da seda flageliforme. Apesar do grande interesse pelas propriedades mecânicas da seda das aranhas, visando o seu uso em aplicações biomédicas e biotecnológicas devido as suas propriedades de resistência, elasticidade e biocompatibilidade, pouco se conhece sobre os detalhes das glândulas produtoras de seda e o processo de fiação que ocorre para a produção das fibras. A seda da teia de aranha tem sido extensivamente estudada através de dados oriundos da engenharia genética e da tecnologia do DNA recombinante. No entanto, informações químicas como as modificações pós-traducionais (PTMs) podem ser perdidas, o que pode inviabilizar a manutenção das propriedades mecânicas e fisico-químicas tão características da seda de aranha. Sendo assim, tanto as espidroínas naturais quanto as suas formas recombinantes foram até então, bioquimica e fisicamente, caracterizados como se apresentassem as mesmas (ou similares) propriedades físico-químicas, sem qualquer consideração sobre a existência de PTMs em suas sequências. Por tanto, no presente estudo adotamos a abordagem proteômica bottom-up com a utilização e... / Abstract: The orb-web spiders became efficient producers of different types of silks. These silks are characterized by diversity in their chemical composition, structure and function, ranging from the construction of the orb-web to the cocoon. Spider web silk proteins (spidroins) have interesting relationships between their 3-D structures and mechanical properties of these protein fibers, which are secreted by specialized abdominal glands. The major ampullate silk fibers, produced by major ampullate gland, are one of the most important types of fibers spun produced by the orb-web spiders of genus Nephila, and are nanostructured composite materials predominantly composed of two structural proteins, designated spidroin-1 and -2. While the fibers produced by the flagelliform gland consist of only a single protein, the flagelliform silk protein. Despite the great interest in the spider silk mechanical properties, targeting its use in biomedical and biotechnological applications due to its properties of strength, elasticity and biocompatibility, the knowledge about the details of the silk-producing glands and the spinning process that occurs for fiber production are limited. The spider silk has been extensively studied using data from genetic engineering and recombinant DNA technology. However, chemical information such as post-translational modifications (PTMs) may be lost, making difficult to explain the mechanical and physico-chemical properties of the spider silks. Thus, both the natural protein and the recombinant spidroins have been biochemically and physically characterized as they would have the same (or similar) physico-chemical properties, without any consideration about the existence of PTMs in their sequences. Therefore, in this study we used a bottom-up proteomic approach combining 2-DE with in-gel protein digestion by different proteolytic enzymes, followed by mass spectrometry analysis (NanoLC-ESI-CID/ETD-MSn) to identify the protein... / Doutor