La progression des cellules dans le cycle cellulaire est gouvernée par une famille de complexes à activité protéine kinase : les complexes CDK/cycline. L'activité de ces complexes est régulée notamment par la déphosphorylation activatrice de résidus tyrosine et thréonine par les phosphatases à double spécificité CDC25. Trois phosphatases CDC25 ont été identifiées dans les cellules de mammifères, et lors de notre travail, nous avons étudié la phosphatase CDC25B. Dans les cellules d'adénocarcinome humain (HeLa), nous avons montré que CDC25B présente une localisation nucléaire ou cytoplasmique stricte ou pan cellulaire, suggérant un trafic nucléo-cytoplasmique actif. Par des approches de mutagenèse dirigée et d'expression transitoire de la protéine sauvage ou mutante, nous avons identifié un signal de localisation nucléaire (NLS) et d'export nucléaire (NES) fonctionnels, et montré que la rétention cytoplasmique de CDC25B nécessite son interaction avec les protéines 14-3-3. Afin de caractériser les mécanismes régulant la fonction de CDC25B in vivo, nous avons entrepris la recherche de nouveaux partenaires de cette phosphatase. Partant d'observations biochimiques : la phosphorylation in vitro de CDC25B par la protéine kinase Eg3, nous avons établi que ces deux protéines interagissent in vivo, dans une lignée surexprimant de manière conditionnelle CDC25B. Une collection de protéines mutantes de CDC25B, nous a permis d'identifier (i) le site d'interaction avec la protéine kinase Eg3, (ii) un site de phosphorylation. Aucune modification de l'activité phosphatase de CDC25B, phosphorylée par Eg3 n'est observée in vitro. Cependant, nous avons montré in vivo, par une analyse en cytométrie de flux, que l'expression de CDC25B est capable d'annuler l'accumulation des cellules en phase G2 induite par la surexpression de Eg3. Ces derniers résultats suggèrent fortement une interaction fonctionnelle entre CDC25B et Eg3, dont les mécanismes in vivo restent à préciser. L'isolement de nouveaux partenaires protéiques de CDC25B a été entrepris par leur co-purification grâce à l'utilisation de lignées U2OS exprimant HA-CDC25B de manière conditionnelle, ou de protéines recombinantes MBP-CDC25B. Certains problèmes techniques ne nous ont pas encore permis d'isoler des partenaires, mais les derniers résultats sont prometteurs.

L’incidence du cancer du rein et sa mortalité associée se sont accrues au cours des dernières années. Le type de cancer rénal le plus fréquent est celui nommé Cancer Rénal à Cellules Claires (CRCC) où le plus souvent, le gène suppresseur de tumeur Von Hippel Lindau (VHL) est inactivé. Malgré une détection plus précoce, l’évolution de la pathologie demeure incertaine, en particulier quand les patients développent des métastases ou acquièrent une résistance au traitement (25-30% des patients). De nouvelles thérapies ciblant des kinases (Sunitinib, Sorafenib ou Temsirolimus) bien que très prometteuses conduisent très souvent à l’acquisition de résistance. Dans ce contexte, il est urgent de développer de nouveaux modèles prédictifs de la réponse des patients aux traitements et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.Ma thèse de science visait trois objectifs complémentaires : 1) Identifier par criblage chimio-génomique des kinases comme cibles thérapeutiques combinées. 2) Etablir deux modèles de culture 3D de cancer du rein qui intègrent le microenvironnement d’une tumeur: les sphéroïdes et la culture organotypique de coupe de tissus. 3) Etudier la chimio-sensibilité de ces modèles à une combinaison de molécules identifiées dans le criblage.Un criblage cellulaire a été réalisé sur la plateforme de Criblage de Molécules BioActives (CEA- Grenoble). Il a consisté à tester 80 molécules inhibitrices de protéine-kinases en combinaison avec l’extinction génique par interférence ARN (shRNAs lentiviraux) de 36 cibles potentielles connues pour leur implication dans divers cancers. La lignée cellulaire choisie (786-O) est dérivée d’une tumeur rénale à cellules claires radio et chimio-résistante et dépourvue de VHL. Parmi les touches qui compromettent la viabilité des cellules 786-O, la combinaison choisie pour son efficacité cible deux kinases importantes dans le contrôle de la survie cellulaire et de la réparation de l’ADN CK2 et ATM. Le statut VHL des cellules module de façon dramatique leur sensibilité à cette combinaison, l’association de ces deux inhibiteurs étant plus efficace sur les cellules 786-O (VHL -) que sur les mêmes cellules dans lesquelles VHL a été réintroduit (VHL+). Au sein d’une tumeur, les différents niveaux d’oxygénation constituent une variation environnementale supplémentaire créant des susceptibilités ou des résistances aux traitements thérapeutiques. Pour déterminer l’impact de nos molécules dans ce contexte, nous avons testé la viabilité des cellules 786-O VHL+ et VHL- dans des conditions normoxiques (21% O2) ou hypoxiques (1,5% O2), en présence des molécules seules ou en combinaison. En normoxie, une diminution synergique de la viabilité des cellules 786-O VHL- est observée en présence de la combinaison, alors que cet effet n’a pas lieu sur les cellules 786-O VHL+. Cette synergie est potentialisée en condition hypoxique. Au niveau mécanistique, les voies de signalisation de stress cellulaires sont d’avantage activées dans les cellules VHL- en présence de la combinaison de molécules comparé au traitement avec chacune des molécules seules. Dans les sphéroïdes tumoraux multicellulaires reproduisant l’organisation d’une micro-tumeur, nos résultats montrent que notre combinaison de molécules induit d’avantage l’apoptose des cellules VHL- que les molécules seules, alors que les cellules VHL+ ne sont sensibles à aucun des traitements.Ces résultats montrent que l’action de nos molécules combinées est clairement plus efficace dans un modèle 3-D. Ils démontrent également qu’il est possible d’objectiver une pharmaco-modulation de la viabilité de cultures organotypiques de tumeur du rein par des combinaisons d’inhibiteurs chimiques de protéine-kinases. Les perspectives de ce travail sont la validation de cette combinaison sur des tumeurs humaines et l’exploitation des cultures organotypiques comme test personnalisé de réponse aux traitements. / Renal cell carcinoma accounts for 3% of all malignant diseases in adults making it the 10th most common cancer in France. The most frequent type of Kidney cancer is Clear Cell Renal Cell Carcinoma (CCRCC). Almost all CCRCC show an inactivation of the Von Hippel Lindau tumour suppressor gene (VHL). Between 25-30% of the patients will develop metastatic renal cell carcinoma (mRCC) by the time they are diagnose or become unresponsive to all treatments and in these cases, the disease has a rapid progression. Over the past years, kinase-targeted therapies (Sunitinib, Sorafenib, Temsirolimus) have become the mainstay of treatment for mRCC, however, most, if not all, patients acquire resistance to these approaches over time.In this context my PhD had 3 goals: a) to find a new combinatory targeted therapy through a High Throughput Screening; b) to establish 3D models mimicking the real environment of the tumours (spheroids, Tissue Slice Culture); c) to validate the Hits through different molecular and cellular biology studies.We conducted a synthetic lethal screen on the CMBA platform (CEA-Grenoble), choosing 36 potential genes targets and 80 kinases inhibitors drugs. Each of the target gene was silenced by a transduction with shRNA Lentivirus into the 786-O cell line derived from ccRCC that lacks the tumour suppressor VHL, is radio- and chemo-therapy resistant, has increased mobility and is highly metastatic. Among the hit combinations that affect cell viability, one of them was chosen because it targets two important kinases involved in cell survival and DNA repair: CK2 and ATM. Moreover, this combination is specifically more active in the 786-O VHL- cells than in 786-O VHL+ cell line. We evaluated the effect of our drugs on the viability of our 786-O VHL+ and VHL- cells in normoxic (21% O2) or hypoxic (1.5% O2) conditions that reflect different environments that are present in a tumour. Surprisingly, in normoxia, we found a synergetic effect of the drug mix only on the 786-O VHL- cells but not on 786-O VHL+ cells. Furthermore, this effect was even stronger in conditions of Hypoxia (up to 20% of synergism).Mechanistically, an up-regulation of the stress pathways was much stronger in the VHL- cells in the presence of the combination than with the drugs alone. No apoptosis was detected in this 2D models. In Multi-Cellular Tumour Spheroid (MCTS) where the organization of a micro-tumour is reproduced, our drugs are even more effective in inducing cell apoptosis than in 2D monolayers of 786-O VHL- cells. These results also demonstrate that pharmaco-modulation of viability of renal tumour organotypic culture by chemical combination targeting protein kinases can be studied. Perspectives of this work are the validation of this drug combination on human renal tumours and the use of organotypic culture as a test for personalized treatment response.

Les récepteurs nucléaires de l’acide rétinoïque (AR) appelés RAR, se comportent comme des facteurs de transcription inductibles par le ligand. La transcription des gènes cibles induite par l’AR, nécessite la fixation des RAR au niveau de séquences spécifiques des promoteurs et met en jeu des changements conformationnels des récepteurs qui contrôlent l’association/dissociation de toute une panoplie de corégulateurs. Cependant, en plus de ce modèle génomique et nucléaire bien établi, l’équipe du Dr Cécile Rochette-Egly a montré récemment que l’AR a aussi des effets non-génomiques et induit rapidement la voie de signalisation p38MAPK/MSK1 qui ensuite cible les RAR pour des cascades de phosphorylations et module la transcription des gènes cibles. Pendant mon travail de thèse, j’ai mis en exergue trois nouveaux concepts originaux du mécanisme d’action du sous-type RARα. J’ai montré qu’une sous-population de RARα est présente dans des microdomaines membranaires, les radeaux lipiques ou “lipid rafts”où elle interagit avec les protéines Gαq. Cette interaction est le signal des effets non génomiques de l’AR, l’activation de la voie de la p38MAPK. Ces effets ont été corrélés à l’activité des gènes cibles de l’AR, prouvant ainsi leur nécessité. J’ai identifié un nouveau partenaire de RARα, la profiline IIA. J’ai analysé le mécanisme moléculaire de l’interaction et démontré qu’elle a lieu dans le noyau. La profiline IIA s’est révélée être un régulateur des effects génomiques de RARα et est recrutée avec RARα au niveau des promoteurs des gènes cibles. Finalement j’ai mis en évidence une nouvelle fonction de RARα dans le contrôle de l’adhésion et de l’étalement des cellules. D’où l’hypothèse de nouveaux effets génomiques de RARα avec la profiline IIA dans le contrôle de l‘expression des protéines d’adhésion. Cependant, de manière inattendue, j ‘ai identifié une nouvelle population de RARα dans le cytoplasme de ces cellules. D’où l’hypothèse de nouveaux effets non génomiques dans le cytoplasme, via l’interaction de RARα avec des protéines d’adhésion. / Nuclear retinoic acid (RA) receptors (RARs) are ligand-dependent regulators of transcription. Their transcriptional activity relies mainly on their recruitment to specific DNA response elements and on their interactions with several coregulators at the ligand-binding domain. In addition to these classical genomic effects, the team of C. Rochette-Egly demonstrated that RA also induces the rapid activation of the p38MAPK/MSK1 pathway with characteristic downstream consequences on thephosphorylation of RARs and the expression of their target genes. Here I highlighted three novel paradigms in the field of the RARα subtype. I found that a fraction of the cellular RARα pool is present in membrane lipid rafts, where it interacts with G protein alpha Q in response to RA. This interaction is the signal for nongenomic effects, i.e. the activation of p38MAPK and of the downstream kinase MSK1. These effects have been correlated to the activation of RA-target genes, highlighting its physiological relevance. I identified a new binding partner of RARα, profilin IIA. I deciphered the mechanism of the interaction and found that it occurs in nuclei. Remarkably, profilin IIA modulates positively the genomic effects of RARα and is recruited with RARα to target genes promoters. Finally, in an attempt to decipher the relevance of the RARα interaction with profilin IIA, I found that RARα controls cell adhesion and spreading. This might suggest a novel genomic functionof RARα and profiling in the control of the expression of genes involved in adhesion. However, preliminary experiments indicate that a pool of RARα is present in the cytosol, suggesting also novel nongenomic effects. Whether RARα controls adhesion via its interaction in the cytosol proteins involved in adhesion will require further investigations.

Les protéines intrinsèquement désordonnées sont caractérisées par un manque de structure 3D stable et sont biologiquements actives dans cet état. La spectroscopie RMN est la méthode de choix pour leurs études à une résolution atomiques, car la cristallographie aux rayons X ne permet pas leur étude en raison de leur caractère hautement dynamique.Cependant, l'étude par spectroscopie RMN de ces protéines est difficiles à cause du grand nombre de recouvrement entre les signaux dans le spectre résultant de l'absence d'un réseau de liaison hydrogène qui pourrait stabiliser la structure et permettre d'obtenir une dispersion des signaux plus élevé. Un autre problème est la sensibilité expérimentale car souvent le temps de mesure est limité en raison de leur prédisposition à la dégradation protéolytique. Dans la première partie de cette thèse les protéines intrinsèquement désordonnées sont introduites. La deuxième partie porte sur la spectroscopie RMN des protéines intrinsèquement désordonnées, des expériences RMN de type BEST-TROSY sont présentées et sont montrées comme étant bien adapté pour l'étude de protéines intrinsèquement désordonnées, en particulier pour celle avec une grande étendue de structure résiduelle. Des expériences 3D BEST-TROSY sont présentées pour leur attribution, une version proline-éditée permet d'aider à l'identification de ce type d'acide aminé et enfin l'expérience HETex-BEST-TROSY qui permet une mesure rapide des taux de change de solvants. Dans la troisième partie de cette thèse ces expériences RMN sont appliquées pour l'étude de la région intrinsèquement désordonnés (domaines 2 et 3) de la protéine NS5A du virus de l'hépatite C (VHC). La structure secondaire résiduel présente dans le fragment de la protéine est analysée. La comparaison des données RMN sur trois constructions de la protéine de différentes longueurs ainsi que les données de SAXS permettent l'identification des interactions transitoires à longue portée entre les différentes régions de cette protéine. En outre, les modes de liaison de ce fragment de protéine à Bin1 domaine SH3 sont analysés. Enfin, les résultats préliminaires obtenus sur l'étude de la phosphorylation de NS5A du VHC par certaines kinases, qui ont été montrées comme biologiquement pertinents, sont présentés. / Intrinsically disordered proteins are characterized by a lack of a stable, 3D structure and fulfill their biological role as such. NMR spectroscopy is the method of choice for their atomic resolution studies, as X-ray crystallography is not amenable to them due to their highly dynamic character.However, NMR spectroscopic studies of these proteins are challenging, because of the high extent of signal overlap in the spectra, resulting from the absence of a hydrogen-bonding network that would lead to structuring and higher signal dispersion. A further problem is experimental sensitivity as often measurement time is limited due to their predisposition for proteolytic degradation. In the fist part of this thesis intrinsically disordered proteins are introduced. The second part focuses on NMR spectroscopy of IDPs, BEST-TROSY-type NMR methods are presented and are shown to be well suited for large IDPs, especially for those with high extent of residual structure. 3D BEST-TROSY experiments are presented for assignment, a proline-edited version for aiding amino acid-type identification, and the HETex-BEST-TROSY experiment that allows rapid measurement of solvent exchange rates. In the third part of this thesis NMR methods are applied for study of the entire intrinsically disordered region (domains 2 and 3) of NS5A protein of hepatitis C virus. The residual secondary structure in this protein fragment is analyzed. Comparison of NMR data on three protein constructs of different lengths together with SAXS data allows identification of transient long range interactions between different regions of this protein. Furthermore, the binding modes of this protein fragment to Bin1 SH3 domain are analyzed. Finally, the preliminary results obtained on investigation of phosphorylation of NS5A of HCV by certain kinases, reported to be biologically relevant, are presented

Les probiotiques sont des « microorganismes vivants qui, lorsqu’ils sont ingérés en quantité suffisante, exercent un effet positif sur la santé de l’hôte ». Ils agissent en modulant le système immunitaire, en empêchant l’adhésion et/ou la croissance des bactéries pathogènes, en renforçant la barrière intestinale et en stabilisant sa microflore. Cependant, les mécanismes d’action de ces bactéries restent encore peu connus.Ce travail de thèse propose d’élucider les modes d’action de deux souches de Bacillus probiotiques humains : Bacillus clausii O/C et de Bacillus subtilis CU1.L’adhésion des probiotiques aux surfaces intestinales est un facteur important pour leur persistance dans l’organisme, l’immunomodulation et la compétition envers les agents pathogènes. B. clausii et B. subtilis présentent de fortes capacités d’adhésion sous forme de spores grâce à leurs protéines de surface préférentiellement impliquées dans les interactions avec l’hôte. En effet, celles-ci jouent un rôle prépondérant dans la stimulation de l’expression des gènes codant les cytokines dans les cellules Caco-2 et la production de cytokines par les cellules immunitaires, induite par les souches probiotiques, via la liaison avec des récepteurs de l’hôte. Des protéines S-layers, protéines ribosomales et protéases ont été identifiées à la surface de ces souches, ainsi qu’une grande quantité de flagelline à la surface de B. subtilis.Par ailleurs, les composés sécrétés par les souches stimulent également la production de cytokines chimiotactiques et anti-inflammatoires. B. clausii sécrète une protéase capable de neutraliser plusieurs types de toxines dont celles sécrétées par C. difficile et B. cereus. B. subtilis n’a montré aucune propension pour l’inhibition de l’adhésion des agents pathogènes testés, mais un essai clinique a démontré sa capacité à moduler le système immunitaire et la composition du microbiote intestinal. / Probiotic are ”live microorganisms, which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host”. They act by modulating the immune system, preventing the adhesion and / or growth of pathogenic bacteria, reinforcing the intestinal barrier and stabilizing the microbiota.However, the mechanisms of action of these bacteria are still poorly understood.This thesis proposes to elucidate the mode of action of two human probiotic strains of Bacillus : Bacillus clausii O / C and Bacillus subtilis CU1.The adhesion of probiotics to intestinal surfaces is an important factor for their persistence in the host, immunomodulation and competition with pathogens. B. clausii and B. subtilis have strong abilities to adhere as spores, through their surface-associated proteins which are preferentially involved in interactions with the host. Indeed, they play a key role in the up-regulation of gene expression encoding cytokines in Caco-2 cells and in the stimulation of cytokine production by immune cells, induced by probiotic strains, through binding with host receptors. Some S-layers proteins, ribosomal proteins and proteases have been identified on the surface of these strains, and a large quantity of flagellin on the surface of B. subtilis.In addition, secreted compounds of these probiotics also stimulate the production of chemotactic and anti-inflammatory cytokines. B. clausii secretes a protease able to neutralize several types of toxins, including those secreted by C. difficile and B. cereus. B. subtilis has not predisposition to compete with the adhesion of pathogens tested, but a clinical trial has demonstrated its ability to modulate the immune system and the composition of the intestinal microbiota.

Les spondyloarthrites (SpA) sont des maladies inflammatoires chroniques articulaires qui se caractérisent par des atteintes de la colonne vertébrale et des articulations périphériques, en particulier des enthèses, souvent associées à des manifestations extra-articulaires telles que le psoriasis, l’uvéite, ou l’inflammation intestinale. Ces maladies complexes possèdent une forte composante génétique dominée par l'antigène HLA-B27 du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH-I), présent chez plus de 80% des patients atteints de SpA. Découverte il y a 45 ans, l'association entre HLA-B27 et le développement des SpA reste inexpliquée. Plusieurs hypothèses ont été proposées pour expliquer cette association au niveau moléculaire. Cependant, la plupart se heurtent à des incohérences expérimentales qui semblent les invalider. Pour élucider les mécanismes moléculaires pathogènes liés au HLA-B27, nous avons utilisé une nouvelle approche. Drosophila melanogaster est un puissant modèle génétique qui a permis des avancées considérables dans la compréhension de nombreuses fonctions des cellules de métazoaires, ainsi que dans la description des processus cellulaires et moléculaires de nombreuses pathologies humaines. Nous avons établi plusieurs lignées de drosophiles transgéniques pour des formes d’HLA-B associées aux SpA ou pour une forme non associée à la maladie, ainsi que pour la chaîne invariante du CMH-I, la β2m humaine (hβ2m). L'expression des formes associées à la maladie, exclusivement en présence de la hβ2m, dans l'aile et dans l'œil de la drosophile conduit à l'apparition de deux phénotypes spécifiques. Mes résultats ont permis de mettre en évidence que le phénotype de perte des veines transversales de l’aile était associé à une perturbation de la signalisation par la voie des Bone Morphogenetic Protein (BMP). Cette perturbation est associée à une co-localisation de HLA-B27 avec le récepteur BMP de type I, Sax. Nos résultats préliminaires obtenus dans les cellules de patients atteints de SpA suggèrent l’existence d’une co-localisation analogue d’HLA-B27 avec le récepteur ALK2, orthologue de Sax. L'ensemble de nos résultats plaide en faveur d’un rôle pathogène de HLA-B27 passant par une dérégulation de la voie BMP à l’intersection des voies de l’ossification et de l’inflammation et pourrait donc s’appliquer à la physiopathologie des SpA. / Spondyloarthritis (SpA) is a chronic inflammatory rheumatic disorder characterized by joint manifestations affecting the spine, peripheral joints and entheses, as well as extra-articular manifestations such as psoriasis, uveitis, or intestinal inflammation. This complex disorder has a strong genetic component dominated by the HLA-B27 antigen of the major histocompatibility complex class I (MHC-I), which is present in more than 80% of SpA patients. Discovered 45 years ago, the association between HLA-B27 and SpA development remains unexplained. Several hypotheses have been proposed to explain this association at the molecular level, but all face experimental inconsistencies that seem to invalidate them. Therefore, it appeared to us essential to elaborate new and yet unexplored approaches in order to better understand the molecular role of HLA-B27 in SpA development. Drosophila melanogaster is a powerful genetic model that has led to considerable advances in understanding numerous functions of metazoan cells, as well as in describing the cellular and molecular processes of many human pathologies. To elucidate the molecular pathogenic mechanisms associated with HLA-B27, we have established several transgenic Drosophila lines for SpA-associated and non-associated of HLA-B alleles, as well as for the MHC-I invariant chain, the human 2-microglobulin (hβ2m). Expression of the HLA-B27 alleles, in the presence of hβ2m, in the Drosophila wing and eye led to two specific phenotypes. The crossveinless wing phenotype is due to a disturbance in the Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling pathway. Interestingly, this misregulation is associated with a co-localization of HLA-B27 and the BMP type I receptor named Sax. Our preliminary results obtained in SpA patient cells suggest that HLA-B27 also colocalizes with ALK2 receptor, which is ortholog to Sax. Altogether, our results suggest that the pathogenic role of HLA-B27 in SpA may depend on a BMP signaling misregulation at the crosstalk between ossification and inflammation.

La fusion des myoblastes est une étape cruciale pour une bonne formation musculaire pendant l'embryogenèse et après une blessure à l'âge adulte. Le système génétique simpliste des mouches a été largement utilisé dans le passé pour identifier les acteurs essentiels impliqués dans la fusion des myoblastes. Chez la drosophile, la protéine d'échafaudage Antisocial (Ants)/Rols7 joue un rôle essentiel dans la fusion des myoblastes en connectant les protéines de surface d'adhésion cellulaire au cytosquelette. Même si la plupart des voies moléculaires régissant la fusion des myoblastes sont évolutives conservées entre les mammifères et les mouches, les contributions relatives de Tanc1 et Tanc2, les orthologues mammifères de Ants/Rols7, dans la fusion de myoblastes n'ont pas été établies. Le premier objectif de la thèse était d'évaluer les contributions potentielles de Tanc1 et Tanc2 dans la fusion de myoblastes en utilisant la lignée cellulaire de myoblastes murins C2C12 comme modèle de différenciation et de fusion de myoblastes. Nous avons constaté que l'expression de Tanc1 et Tanc2 n'est pas modulée lors de la différenciation C2C12, mais que les deux échafaudages sont enrichis au niveau du cortex lors de la prolifération des myoblastes. De plus, le knockdown de Tanc1 ou Tanc2 a altéré la fusion des myoblastes sans affecter la différenciation des myoblastes. Notamment, l'expression du défaut de fusion humain entièrement restauré Tanc1 ou Tanc2 observé dans les cellules C2C12 épuisées pour Tanc1 ou Tanc2 suggérant qu'un niveau seuil de leur expression est critique pour une fusion efficace des myoblastes. De plus, ni Tanc1 ni Tanc2 n'ont pu se substituer à Ants/Rols7 lors de la fusion des myoblastes chez la drosophile, ce qui suggère que différents acteurs pourraient être impliqués dans la régulation de la fusion des myoblastes chez les mammifères. Le deuxième objectif de la thèse était de caractériser davantage le rôle de Tanc1 et Tanc2 dans la fusion de myoblastes en utilisant des modèles murins de souris. À cette fin, des souris knock-out Tanc1 totales (Tanc1 KO) et des souris knock-out Tanc2 conditionnelles (Tanc2 cKO) ont été générées. Bien que les souris Tanc2 KO aient été précédemment signalées comme étant mortelles sur le plan embryonnaire, nous rapportons ici que ces souris sont viables contrairement à ce qui a été rapporté. L'expression de Tanc1 et Tanc2 a été détectée dans les somites ainsi que dans les fibres musculaires primaires. L'analyse du phénotype musculaire au stade embryonnaire a révélé une différenciation normale des somites et la formation de fibres musculaires chez les souris Tanc1 KO et Tanc2 cKO. De plus, lors de l'analyse au stade adulte, aucune différence dans la section transversale des fibres musculaires entre les souris de type sauvage et les souris mutantes n'a été détectée. Cela pourrait-il impliquer une redondance potentielle entre Tanc1 et Tanc2 dans la régulation de la myogenèse ? Pour répondre à cette question, des souris double knockout Tanc1 et Tanc2 sont actuellement en cours de génération. En conclusion, nous avons identifié dans cette étude un nouveau rôle pour les protéines d'échafaudage Tanc1 et Tanc2 dans la fusion de myoblastes chez les mammifères. L'identification de nouveaux acteurs essentiels dans la fusion des myoblastes nous rapproche de sa compréhension et de son ciblage thérapeutique à long terme. / Myoblast fusion is a crucial step for proper muscle formation during embryogenesis and after in injury during adulthood. The simplistic genetic system of flies has been extensively used in the past to identify essential players involved in myoblast fusion. In Drosophila, the scaffold protein Antisocial (Ants)/Rols7 plays an essential role in myoblast fusion by connecting the cell adhesion surface proteins to the cytoskeleton. Even though most molecular pathways governing myoblast fusion are evolutionary conserved between mammals and flies, the relative contributions of Tanc1 and Tanc2, the mammalian orthologs of Ants/Rols7, in myoblast fusion have not been established. The first aim of the thesis was to assess the potential contributions of Tanc1 and Tanc2 in myoblast fusion by using the murine myoblast C2C12 cell line as a model for myoblasts differentiation and fusion. We found that Tanc1 and Tanc2 expression is not modulated during C2C12 differentiation, but that both scaffolds are enriched at the cortex during myoblast proliferation. Furthermore, the knockdown of either Tanc1 or Tanc2 impaired myoblast fusion without affecting myoblast differentiation. Notably, the expression of human Tanc1 or Tanc2 fully restored fusion defect observed in C2C12 cells depleted for Tanc1 or Tanc2 suggesting that a threshold level of their expression is critical for efficient myoblast fusion. Furthermore, neither Tanc1 nor Tanc2 could substitute for Ants/Rols7 during Drosophila myoblast fusion suggesting that different players might be involved in regulating myoblast fusion in mammals. The second aim of the thesis was to further characterize the role of Tanc1 and Tanc2 in myoblast fusion by using murine mice models. For this purpose, total Tanc1 knockout mice (Tanc1 KO) and conditional Tanc2 knockout mice (Tanc2 cKO) were generated. Although Tanc2 KO mice were previously reported to be embryonically lethal, we report here that those mice are viable contrary to what has been reported. Tanc1 and Tanc2 expression was detected in the somites as well as in the primary muscle fibers. Analysis of the muscle phenotype at the embryonic stage revealed normal somites differentiation and muscle fiber formation in both Tanc1 KO and Tanc2 cKO mice. Furthermore, when analyzed at the adult stage, no difference in the cross-sectional area of the muscle fibers between wild-type mice and mutant mice was detected. Could this imply a potential redundancy between Tanc1 and Tanc2 in regulating myogenesis? To answer this question, Tanc1 and Tanc2 double knockout mice are currently being generated. In conclusion, we identified in this study a novel role for the scaffold proteins Tanc1 and Tanc2 in myoblast fusion in mammals. Identifying new and essential players in myoblast fusion brings us a step closer to understanding it and on the long run target it therapeutically.

[ES] En respuesta a estreses de tipo biótico y abiótico, las plantas sintetizan proteínas de defensa y compuestos químicos de diversa naturaleza. Estos compuestos pueden actuar de manera directa, a través de propiedades antioxidantes, antifúngicas o antibacterianas, o actuar como metabolitos defensivos indirectos. Dentro de este último grupo de compuestos defensivos, cabe destacar a los compuestos fenólicos y los compuestos orgánicos volátiles (VOCs). En nuestro grupo de investigación se ha profundizado en el estudio de estos metabolitos secundarios implicados en la respuesta defensiva de las plantas. Por una parte, se identificó el ácido gentísico (GA) como una molécula señal que actúa de manera complementaria al ácido salicílico (SA) en infecciones de tipo sistémico. Además, se ha tratado de profundizar en el estudio de la biosíntesis del GA a través de la enzima salicilato 5-hidroxilasa (S5H), encargada de la conversión de SA a GA. Para ello, se ha llevado a cabo la caracterización fenotípica, molecular y química de plantas transgénicas de tomate que tienen silenciado el gen S5H mediante la técnica de RNA de interferencia (RNAi_S5H) frente a infecciones de tipo bacteriano y viroidal. Las plantas de tomate RNAi_S5H presentaron un aumento de resistencia frente a Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) y el viroide de la exocortis de los cítricos (CEVd). Del mismo modo, se llevaron a cabo análisis metabolómicos de estas plantas transgénicas RNAi_S5H tras ambas infecciones, observándose diferencias relacionadas con el metabolismo del SA, que parecen indicar que la homeostasis del SA es específica para cada interacción tomate-patógeno. Por otra parte, se identificaron algunos ésteres de (Z)-3-hexenol que eran emitidos de manera diferencial tras la infección bacteriana con la cepa avirulenta de Pst DC3000 en plantas de tomate cv. Rio Grande. Concretamente, tratamientos exógenos con el compuesto volátil butanoato de (Z)-3-hexenilo (HB) fueron capaces de inducir de manera significativa el cierre de estomas, la activación de genes defensivos y un aumento en la resistencia frente a la infección bacteriana. La eficacia de este compuesto como inductor de cierre estomático fue comprobada en diferentes cultivos agronómicos, como Arabidopsis, Medicago, Zea, Citrus y Nicotiana, confirmando su papel como un inductor de cierre estomático universal. Dado el potencial de este compuesto en agricultura, se emplearon aproximaciones genéticas, bioquímicas y farmacológicas para descifrar el mecanismo de señalización del cierre estomático mediado por HB. Una vez el volátil es percibido por los receptores de la planta, se activan diferentes componentes de la cascada de señalización defensiva, como canales permeables de Ca2+ o la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Asimismo, el HB es capaz de desencadenar la activación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos MPK3 y MPK6, induciendo el cierre estomático de una manera independiente a la síntesis y señalización mediada por ácido abscísico (ABA). Por último, la eficacia del HB fue evaluada en condiciones de campo frente a estreses tanto de tipo biótico como abiótico y en procesos de desarrollo como la maduración, proponiendo un uso del HB como un nuevo compuesto fitoprotector natural para el control de estreses de forma sostenible en agricultura. / [CA] En resposta a estressos de tipus biòtic i abiòtic, les plantes sintetitzen proteïnes de defensa i compostos químics de diversa naturalesa. Aquests compostos poden actuar de manera directa, a través de propietats antioxidants, antifúngiques o antibacterianes, o actuar com a metabòlits defensius indirectes. Dins d'aquest últim grup de compostos defensius, cal destacar als compostos fenòlics i els compostos orgànics volàtils (VOCs). En el nostre grup d'investigació s'ha aprofundit en l'estudi d'aquests metabòlits secundaris implicats en la resposta defensiva de les plantes. D'una banda, es va identificar l'àcid gentísic GA) com una molècula senyal que actua de manera complementària a l'àcid salicílic (SA) en infeccions de tipus sistèmic. A més, s'ha tractat d'aprofundir en l'estudi de la biosíntesi del GA a través d l'enzim salicilato 5-hidroxilasa (S5H), encarregada de la conversió de SA a GA. Per a això, s'ha dut a terme la caracterització fenotípica, molecular i química de plantes de transgèniques de tomaca que tenen silenciat el gen S5H mitjançant la tècnica d'RNA d'interferència (RNAi_S5H) enfront d'infeccions de tipus bacterià i viroidal. Les plantes de tomaca RNAi_S5H van presentar un augment de resistència enfront de Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) i el viroide de la exocortis dels cítrics (CEVd). De la mateixa manera, es van dur a terme anàlisi metabolómics d'aquestes plantes transgèniques RNAi_S5H després de totes dues infeccions, observant-se diferències relacionades amb el metabolisme del SA, que sembla indicar que l'homeòstasi del SA és específica per a cada interacció tomaca-patògena. D'altra banda, es van identificar alguns èsters de (Z)-3-hexenol que eren emesos de manera diferencial després de la infecció bacteriana amb el cep avirulent de Pst DC3000 en plantes de tomaca cv. Rio Gran. Concretament, tractaments exògens amb el compost volàtil butanoato de (Z)-3-hexenilo (HB) van ser capaces d'induir de manera significativa el tancament d'estomes, l'activació de gens defensius i un augment en la resistència enfront de la infecció bacteriana. L'eficàcia d'aquest compost com a inductor de tancament estomàtic va ser comprovada en diferents cultius agronòmics, com Arabidopsis, Medicago, Zea, Citrus i Nicotiana, confirmant el seu paper com un inductor de tancament estomàtic universal. Donat el potencial d'aquest compost en agricultura, es van emprar aproximacions genètiques, bioquímiques i farmacològiques per a desxifrar el mecanisme de senyalització del tancament estomàtic mediat per HB. Una vegada el volàtil és percebut pels receptors de la planta, s'activen diferents components de la cascada de senyalització defensiva, com a canals permeables de Ca2+ o la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS). Així mateix, el HB és capaç de desencadenar l'activació de les proteïnes cinases activades per mitógens MPK3 i MPK6, induint el tancament estomàtic d'una manera independent a la síntesi i senyalització mediada per l'àcid abscísic (ABA). Finalment, l'eficàcia del HB va ser avaluada en condicions de camp enfront d'estressos tant de tipus biòtic com abiòtic, i en processos de desenvolupament com la maduració, proposant un l'ús del HB com a nou compost fitoprotector natural per al control d'estressos de manera sostenible en agricultura. / [EN] In response to biotic and abiotic stress, plants synthesize defence proteins and chemical compounds from diverse nature. These compounds can act directly, trough antioxidant, antifungal or antibacterial properties, or indirectly as defensive metabolites. Among these group of defensive metabolites, phenolic compounds and volatile organic compounds (VOCs) present a major role. Our research group have a strong background in studying the role of plant secondary metabolites in plant defence mechanisms. On one hand, gentisic acid (GA) was first described as a signal molecule that acts complementary to salicylic acid (SA) in systemic infections. Furthermore, SA conversion to GA trough the salicylate 5-hydroxylase enzyme (S5H) has received much attention. For this purpose, S5H-silenced transgenic tomato plants (RNAi_S5H) have been phenotypically, molecularly, and chemically characterized against both, bacterial and viroidal inoculations. RNAi_S5H tomato plants resulted in enhanced resistance to both Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) and Citrus Exocortis Viroid (CEVd). Moreover, metabolomics analysis of these transgenic plants upon bacterial and viroid infections revealed differences related to SA metabolism, suggesting that SA homeostasis is specific for each tomato-pathogen interaction. On the other hand, some esters of (Z)-3-hexenol were identified to be differentially emitted by tomato cv. Rio Grande plants upon infection with the avirulent strain of the bacterium Pst DC3000. Particularly, treatments with the volatile (Z)-3-hexenyl butyrate (HB) resulted in significant stomatal closure, defence genes induction and enhanced resistance to the bacteria. Moreover, the efficacy of this compound as a stomata closer was tested in different agronomic crop as Arabidopsis, Medicago, Zea, Citrus y Nicotiana plants, postulating HB as a new universal stomata closer. Due to its potent properties, the signalling pathway of the HB-mediated stomata closure has been deciphered by using different genetic, biochemical, and pharmacological approaches. The perception of this volatile by plant receptors appeared to initiate different defence signalling events, including the activation of Ca2+ permeable channels or reactive oxygen species (ROS) burst. Moreover, HB triggered the activation of the mitogen-activated protein kinases MPK3 and MPK6, inducing stomatal closure independently of abscisic acid (ABA) biosynthesis and signalling. Additionally, HB efficacy has been also tested in field conditions and against both biotic and abiotic stresses, and also during ripening, proposing HB as a new natural phytoprotector for the sustainable control of stresses in agriculture. / This work was funded by Grant AICO/2017/048 from the Generalitat Valenciana and by Grant INNVAL10/18/005 from the Agència Valenciana de la Innovació (Spain). / Payá Montes, C. (2023). Secondary Metabolites in Plant Defence Mechanisms [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/193041

Ma thèse s'inscrit dans l'étude des modifications du globule rouge humain induites par P. falciparum. Ces modifications qui représentent une remarquable adaptation du parasite à un environnement plus complexe qu'il n'y paraît au premier abord et expliquent sa persistance chez l'Homme sont détaillées dans une revue et un chapitre de livre dont je suis co-auteur. Mes travaux de recherche ont porté sur la caractérisation fonctionnelle des structures de Maurer, un compartiment membranaire exporté par le parasite dans le globule rouge parasitaire et directement lié à la physiopathologie du paludisme grave. J'ai contribué à la caractérisation fonctionnelle de nouvelles protéines de ces structures, codées par trois familles multigéniques sub-télomériques en cluster avec la famille Pfmc-2tm, et présentant de façon étonnante un fort degré de conservation (article 1). La diminution d'expression de ces gènes, obtenue par titration d'un facteur transcriptionnel, entraine un défaut de libération des mérozoïtes. Mon deuxième projet porte sur l'identification des modalités d'export de la protéine transmembranaire résidente des structures de Maurer PfSBP1. Mes travaux montrent que PfSBP1 est exportée sous forme soluble dans le cytoplasme érythrocytaire, en interaction avec le complexe chaperon parasitaire PfTCP1 (article 2). / Plasmodium falciparum causes the most severe forms of human malaria, a pathology associated with the erythrocytic asexual stages of the parasite. My work focused on the remodeling of the infected erythrocytes induced by P. falciparum and detailed in a review and a book chapter that I co-authored. These modifications illustrate a remarkable adaptation of P. falciparum resulting in its persistence in humans. My PhD thesis was dedicated to the functional characterization of Maurer's clefts, a membrane compartment transposed by the parasite in the cytoplasm of its host cell, and central to the export of virulence factors to the host cell surface. I have conducted two projects and contributed first to the functional characterization of novel exported protein encoded by three highly conserved multigene sub-telomeric families in cluster with the Pfmc-2tm family. Down regulation of these gene families by promoter titration impacted the release of infectious merozoites from the host cell (annex 1). My second project was dedicated to the identification of the modality of export of the resident and Maurer's clefts transmembrane protein PfSBP1. I have shown that PfSBP1 is exported as a soluble protein in the host cell cytoplasm in interaction with the parasite Thermosome complex protein 1 (PfTCP1) chaperone complex (annex 2).

Les voies de transduction du signal cellulaire permettent aux cellules de répondre aux signaux de l'environnement et de les traiter. Les voies de transduction de kinases MAP (MAPK) sont bien conservées dans toutes les cellules eucaryotes et sont impliquées dans la régulation de nombreux processus cellulaires importants. Les régions intrinsèquement désordonnées (RID), présentes dans de nombreuses MAPK, n'étaient pas encore structurellement caractérisées. Les RID de MAPK sont particulièrement importantes car elles contiennent des motifs de liaison qui contrôlent les interactions entre les protéines MAPK elles-mêmes et aussi entre les protéines MAPK et d'autres protéines contenant les mêmes motifs. La résonance magnétique nucléaire (RMN) en combinaison avec d'autres techniques biophysiques a été utilisée pour étudier les RID de kinase des voies de transduction du signal MAPK. La spectroscopie RMN est bien adaptée pour l'étude des protéines intrinsèquement désordonnées à l'échelle atomique. Les déplacements chimiques et couplages dipolaires résiduels peuvent être utilisés conjointement avec des méthodes de sélection d'ensemble pour étudier la structure résiduelle dans les RID. La relaxation de spin nucléaire nous renseigne sur les mouvements rapides. Des titrations par RMN et des techniques de spectroscopie d'échange peuvent être utilisées pour surveiller la cinétique d'interactions protéine-protéine. Cette étude contribuera à la compréhension du rôle des RID dans les voies de transduction du signal cellulaire. / Protein signal transduction pathways allow cells respond to and process signals from the environment. A group of such pathways, called mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal transduction pathways, is well conserved in all eukaryotic cells and is involved in regulating many important cell processes. Long intrinsically disordered region (IDRs), present in many MAPKs, have remained structurally uncharacterised. The IDRs of MAPKs are especially important as they contain docking-site motifs which control the interactions between MAPK proteins themselves and also between MAPKs and other interacting proteins containing the same motifs. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy in combination with other biophysical techniques was used to study IDRs of MAPKs. NMR spectroscopy is well suited for studying intrinsically disordered proteins (IDPs) at atomic-level resolution. NMR observables, such as for example chemical shifts and residual dipolar couplings, can be used together with ensemble selection methods to study residual structure in IDRs. Nuclear spin relaxation informs us about fast pico-nanosecond motions. NMR titrations and exchange spectroscopy techniques can be used to monitor kinetics of protein-protein interactions. The mechanistic insight into function of IDRs and motifs will contribute to understanding of how signal transduction pathways work.