A Tropomiosina (Tm) está diretamente envolvida no processo de regulação da contração muscular, que é controlado por um mecanismo alostérico que envolve Ca2+, troponina (Tn), actina (Ac) e miosina. A Tm é uma proteína flexível, de estrutura \"coiled-coil\", constituída de duas α-hélices com 284 aminoácidos cada uma. A molécula de Tm faz interações do tipo \"cabeça-cauda\" com outra molécula de Tm através da sobreposição de aproximadamente 8 a 15 resíduos da extremidade N- terminal de uma molécula com 8 a 15 resíduos da extremidade e-terminal da outra molécula de Tm. Desta maneira, em baixas forças iônicas, formam-se filamentos lineares através de um processo de polimerização. A estabilidade de regiões específicas da Tm pode ser importante para a sua função no controle da regulação da contração muscular. Além disso, a Tm pode ser usada como um modelo relativamente simples e de ocorrência natural para entendermos as interações intra- e intermoleculares que governam a estabilidade das \"coiled-coils\". Assim sendo, nós produzimos oito fragmentos recombinantes de Tm (Tm143-284(50HW), Tm189-284(50Hw), Tm189-284, Tm220-284(50HW), Tm220-284, Tm143-235, Tm167-260 e Tm143-260) e um peptídeo sintético (Ac-Tm215-235) com a finalidade de investigar as estabilidades conformacionais relativas das diferentes regiões derivadas da metade C-terminal da proteína, a qual é conhecida por sua interação com o complexo troponina. Experimentos de ultracentrifugação analítica mostram que os fragmentos que incluem os últimos 24 resíduos da molécula (Tm143-284(50HW), Tm189-284(50HW), Tm220-284(50HW), Tm220-284) estão completamente dimerizados a 10 µM (concentração do dímero em 50 mM de tampão fosfato, pH 7,0; 100 mM de NaCI; 0,5 mM de DTT e 0,5 mM de EDTA, 10°C), enquanto que fragmentos que não possuem o e-terminal nativo (Tm143-235, Tm167-260 e Tm143-260) se encontram em equilíbrio monômero-dímero nestas condições. A presença de trifluoroetanol promove uma diminuição na razão [θ]222/[θ]208, observada por dicroísmo circular, em todos os fragmentos e induz a formação de trímeros estáveis apenas para aqueles contendo os resíduos 261-284. Estudos de desnaturação por uréia, acompanhados por dicroísmo circular e fluorescência, mostram que os resíduos 261-284 da tropomiosina são muito importantes para estabilidade da metade C-terminal da molécula. Além do mais, a ausência desta região promove um aumento na cooperatividade do desenovelamento induzido por uréia. Os experimentos de desnaturação por temperatura e por uréia mostram que o fragmento Tm143-235 é relativamente instável quando comparado com outros fragmentos de mesmo tamanho. Nós identificamos alguns fatores que podem estar contribuindo para a particular instabilidade desta região, incluindo repulsões inter-hélices entre resíduos em posições g e e\' da repetição heptapeptídica, um resíduo carregado na interface hidrofóbica da \"coiled-coil\" e por fim, uma grande fração de resíduos β-ramificados localizados em posições d. Sabe-se que a não acetilação do N-terminal da molécula de Tm, bem como a ausência de alguns resíduos na sua extremidade C-terminal, fazem com que a Tm deixe de sofrer polimerização. Entretanto, trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório haviam mostrado que um fragmento de Tm recombinante (ASTm1-260), contendo a fusão dipeptídica Ala-Ser (que é conhecida por restaurar a capacidade de polimerização de Tm não acetiladas no N-terminal), polimerizava-se mais do que a proteína recombinante de tamanho integral (ASTm), apesar da deleção dos últimos 24 aminoácidos C-terminais. Para investigar com mais detalhes a natureza da interação cabeça-cauda, nós construímos dois fragmentos que compreendem a metade N-terminal da molécula de Tm, ASTm1-142 e nfTm1-142, o primeiro deles contendo uma fusão dipeptídica AS no N-terminal e o segundo com o N-terminal não acetilado, sem a fusão dipeptídica. Estes dois fragmentos foram empregados em ensaios de interação cabeça-cauda, realizados através de ensaios de desnaturação térmica acompanhados por dicroísmo circular, juntamente com três fragmentos da região C-terminal da Tm. Dois dos fragmentos e-terminais acabam na posição 260 (Tm167-260 e Tm143-260) e um deles termina na posição 284 (Tm220-284), que corresponde ao C-terminal nativo da proteína. Os resultados mostram que ocorre uma interação cabeça-cauda entre o fragmento N-terminal ASTm1-142 e todos os fragmentos C-terminais utilizados neste estudo. As moléculas recombinantes de Tm que terminam na posição 260 são, de fato, capazes de fazer interações cabeça-cauda independentemente do fato de elas se apresentarem instáveis nas condições estudadas. Inclusive, após a interação, ocorre um aumento considerável na estrutura a-hélice, o que se dá preferencialmente nos fragmentos C-terminais. / Tropomyosin (Tm) participates in the process of muscle contraction, which is controlled by an allosteric mechanism involving Ca2+, troponin (Tn), actin (Ac) and myosin. Tm is a coiled-coil flexible molecule composed by two α-helices with 284 amino acids each. Tm molecule performs head-to-tail interactions with another Tm molecule through the overlap of approximately 8 to 15 N-terminal residues of one molecule with 8 to 15 C-terminal residues of the other molecule. Thus Tm forms linear filaments in low ionic strengths, which is characteristic for a polymerization process. The stability of specific regions of Tm may be important to its function in controlling the regulation of muscle contraction. Besides, Tm can be used as a relatively simple model and of natural occurrence to understand the intra- and intermolecular interactions that govern the stability of \"coiled-coils\". We therefore produced eight recombinant fragments of Tm (Tm143-284(50HW), Tm189-284(50HW), Tm189-284, Tm220-284(50HW), Tm220-284, Tm143-235, Tm167-260 and Tm143-260) and one synthetic peptide (Ac-Tm215-235) to investigate the relative conformational stabilities of different regions derived from the C-terminal end of the molecule, which is known to interact with the troponin complex. Analytical ultracentrifugation experiments show that fragments comprising the last 24 residues of the molecule (Tm143-284(50Hw), Tm189-284(50HW), Tm220-284(50Hw), Tm220-284) are completely dimerized at 10 µM (dimer concentration in buffer containing 50 mM phosphate, pH 7.0, 100 mM NaCI, 0.5 mM DTT and 0.5 mM EDTA, 10ºC), whereas the fragments that do not posses the native C-terminal portion (Tm143-235, Tm167-260 and Tm143-260) present a monomer-dimer equilibrium at the same conditions. Trifluoroethanol promoted a decrease in the ratio [θ]222/[θ]208 for all fragments (observed by circular dichroism), and induced the formation of stable trimers for the fragments comprising the residues 261-284. Urea denaturation studies, followed by circular dichroism and fluorescence, show that residues 261-284 of Tm are very important for the stability of the C-terminal half of the molecule. Still, the absence of this region promotes an increase in the cooperativity of unfolding induced by urea. Urea and temperature denaturation experiments showed that the fragment Tm143-235 is relatively unstable when compared to other fragments of the same size. We identified some factors that may be contributing to the particular instability of this region, including interhelix repulsions between residues in positions g and e\' of the heptad repeat, a charged residue in the hydrophobic interface of the coiled-coil and a great fraction of (β-branched residues located at d positions. It is known that the non-acetylation of the N-terminus of the Tm molecule, as well as, the absence of some residues in the C-terminus of the molecule cause Tm to loose its ability to undergo polymerization. Former works performed in our laboratory showed that a fragment of recombinant Tm (ASTm1-260) with the dipeptide fusion Ala-Ser (which is known by its ability in restores the polymerization of non-acetylated Tms), despite the absence of the C-terminal 24 amino acids, polymerizes to a much greater extent than the corresponding full length recombinant protein. To better investigate the nature of the head-to-tail interaction we constructed two fragments that comprise the N-terminal half of the Tm: ASTm1-142 and nfTm1-142, the former containing the dipeptide AS (Ala-Ser) fusion to its N-terminus, and the latter presenting a bare non-acetylated N-terminus without the dipeptide fusion . These two fragments were employed in thermal denaturation assays followed by circular dichroism to test their head-to-tail interaction along with three fragments comprising Tm\'s C-terminal region. Two of the C-terminal fragments ends at position 260 (Tm167-260 and Tm143-260), whereas one ends at position 284 (Tm220-284). Results show that there is a head-to-tail interaction between the N-terminal fragment ASTm1-142 and all other e-terminal fragments employed in this study. Recombinant Tm molecules ending at position 260, are capable of performing head-to-tail interactions, regardless of their stability under the studied condition. Upon interaction, an increase in the a-helix content occurs preferentially in the e-terminal fragments.

Uma série de mutantes recombinantes da tropomiosina com a sonda fluorescente 5-hidroxitriptofano inserida em várias posições ao longo da seqüência primária vêm sendo utilizados em nosso laboratório para o estudo em nível molecular do controle do processo de contração muscular. Estes mutantes têm sido produzidos em cepas de bactéria auxotróficas para triptofano em meio mínimo ao qual adicionamos 5-hidroxitriptofano, um análogo do aminoácido triptofano. Esta sonda fluorescente apresenta a vantagem de absorver energia numa faixa de comprimentos de onda não absorvida pelo triptofano (temos usado com sucesso o comprimento de onda de 312 nm para excitar seletivamente o 5-hidroxitriptofano). Desta forma, o ambiente da sonda pode ser estudado em situações nas quais outras proteínas que possuam triptofanos, como, por exemplo a actina, estejam presentes. Procedemos a uma caracterização dos mutantes utilizados quanto à sua ligação à actina na ausência e presença de troponina (+/- Ca2+) e na presença de acrilamida por meio de ensaios de co-sedimentação com actina. O comportamento funcional dos diversos mutantes foi investigado pela análise da regulação da atividade Mg2+ -ATPásica da acto-S1 miosina destes mutantes na ausência e na presença de troponina (+/- Ca2+). Estudos da estabilidade destes mutantes da tropomiosina por meio de desnaturação por temperatura seguida por dicroísmo circular foram realizados para analisarmos o efeito das mutações na estabilidade global da molécula. Ensaios de desnaturação por uréia seguidas por fluorescência também foram realizados para analisarmos a estabilidade da molécula próxima à região da sonda fluorescente. O presente estudo compreendeu ainda a análise da supressão de fluorescência pelos supressores extrínsecos acrilamida e iodeto para diversos mutantes da tropomiosina na presença e ausência de outras proteínas do filamento fino, o que permitiu a obtenção de informações sobre o grau de exposição da sonda fluorescente nas diversas situações estudadas bem como sobre o ambiente eletrostático ao redor das sondas nestas diferentes situações. Estes resultados permitiram a obtenção de um modelo para a ligação da tropomiosina ao filamento de actina na presença de troponina (+/- Ca2+). Este modelo propõe que as bandas α do padrão de repetição α/β inicialmente proposto por Mclachlan e Stewart (1975 e 1976) se liguem ao filamento na ausência de íons cálcio. A introdução de cálcio no sistema é capaz de induzir uma rotação e um deslocamento na molécula de tropomiosina com relação ao filamento de actina. Nesta situação, seriam as bandas β da tropomiosina as responsáveis pela ligação desta molécula ao filamento de actina. / Several recombinant mutants of tropomyosin with the fluorescent probe 5-hydroxytryptophan inserted at several positions along the primary sequence are being used in our laboratory for studying the control of the muscular contraction process at a molecular level. These mutants are produced in bacterial strains auxotrophic to tryptophan in minimal medium to which 5- hydroxytryptophan, a tryptophan analogue, is added. This fluorescent probe has the advantage of absorbing light in a range of wavelengths not absorbed by the amino acid tryptophan (we have been successfully using the wavelength of 312 nm to selectively excite the 5-hydroxytryptophan). The environment of the probe can thus be studied even when other tryptophan containing proteins, such as actin, are present. We have characterized the mutants as to their ability to bind to actin in the absence and in the presence of troponin (+/- Ca2+) and in the presence of acrylamide through actin co-sedimentation assays. The functional behavior of the several mutants constructed was assessed by analyzing their ability to regulate the acto-S1 myosin Mg2+-ATPase activity in the absence and in the presence of troponin (+/- Ca2+). Studies on the stability of these tropomyosin mutants by thermal denaturation followed by circular dichroism were performed to analyze the effect of the mutations on the molecule\'s global stability. Urea denaturation assays followed by fluorescence were also performed to allow us to investigate the stability of the molecule in the vicinity of the fluorescent probe. The present study also involved the analysis of the fluorescence quenching by the extrinsic quenchers acrylamide and iodide for divers tropomyosin mutants in the presence and in the absence of other thin filament proteins. This allowed us to obtain information on the degree of exposure of the fluorescent probe in the several conditions studied as well as on the electrostatic microenvironment surrounding the probes in these different situations. These results enabled us to propose a model for the binding of tropomyosin to the actin filament in the presence of troponin (+/Ca2+). In this model the α-bands from the α/β repetition pattern initially proposed by Mclachlan and Stewart (1975 and 1976) would be binding the filament in the absence of calcium ions. The introduction of calcium to the system would induce a rolling motion in and a displacement of the tropomyosin molecule with relation to the actin filament. In this situation tropomyosin\'s β-bands would be responsible for the binding of this molecule to the actin filament.

A Tropomiosina (Tm) está diretamente envolvida no processo de regulação da contração muscular, que é controlado por um mecanismo alostérico que envolve Ca2+, troponina (Tn), actina (Ac) e miosina. A Tm é uma proteína flexível, de estrutura \"coiled-coil\", constituída de duas α-hélices com 284 aminoácidos cada uma. A molécula de Tm faz interações do tipo \"cabeça-cauda\" com outra molécula de Tm através da sobreposição de aproximadamente 8 a 15 resíduos da extremidade N- terminal de uma molécula com 8 a 15 resíduos da extremidade e-terminal da outra molécula de Tm. Desta maneira, em baixas forças iônicas, formam-se filamentos lineares através de um processo de polimerização. A estabilidade de regiões específicas da Tm pode ser importante para a sua função no controle da regulação da contração muscular. Além disso, a Tm pode ser usada como um modelo relativamente simples e de ocorrência natural para entendermos as interações intra- e intermoleculares que governam a estabilidade das \"coiled-coils\". Assim sendo, nós produzimos oito fragmentos recombinantes de Tm (Tm143-284(50HW), Tm189-284(50Hw), Tm189-284, Tm220-284(50HW), Tm220-284, Tm143-235, Tm167-260 e Tm143-260) e um peptídeo sintético (Ac-Tm215-235) com a finalidade de investigar as estabilidades conformacionais relativas das diferentes regiões derivadas da metade C-terminal da proteína, a qual é conhecida por sua interação com o complexo troponina. Experimentos de ultracentrifugação analítica mostram que os fragmentos que incluem os últimos 24 resíduos da molécula (Tm143-284(50HW), Tm189-284(50HW), Tm220-284(50HW), Tm220-284) estão completamente dimerizados a 10 µM (concentração do dímero em 50 mM de tampão fosfato, pH 7,0; 100 mM de NaCI; 0,5 mM de DTT e 0,5 mM de EDTA, 10°C), enquanto que fragmentos que não possuem o e-terminal nativo (Tm143-235, Tm167-260 e Tm143-260) se encontram em equilíbrio monômero-dímero nestas condições. A presença de trifluoroetanol promove uma diminuição na razão [θ]222/[θ]208, observada por dicroísmo circular, em todos os fragmentos e induz a formação de trímeros estáveis apenas para aqueles contendo os resíduos 261-284. Estudos de desnaturação por uréia, acompanhados por dicroísmo circular e fluorescência, mostram que os resíduos 261-284 da tropomiosina são muito importantes para estabilidade da metade C-terminal da molécula. Além do mais, a ausência desta região promove um aumento na cooperatividade do desenovelamento induzido por uréia. Os experimentos de desnaturação por temperatura e por uréia mostram que o fragmento Tm143-235 é relativamente instável quando comparado com outros fragmentos de mesmo tamanho. Nós identificamos alguns fatores que podem estar contribuindo para a particular instabilidade desta região, incluindo repulsões inter-hélices entre resíduos em posições g e e\' da repetição heptapeptídica, um resíduo carregado na interface hidrofóbica da \"coiled-coil\" e por fim, uma grande fração de resíduos β-ramificados localizados em posições d. Sabe-se que a não acetilação do N-terminal da molécula de Tm, bem como a ausência de alguns resíduos na sua extremidade C-terminal, fazem com que a Tm deixe de sofrer polimerização. Entretanto, trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório haviam mostrado que um fragmento de Tm recombinante (ASTm1-260), contendo a fusão dipeptídica Ala-Ser (que é conhecida por restaurar a capacidade de polimerização de Tm não acetiladas no N-terminal), polimerizava-se mais do que a proteína recombinante de tamanho integral (ASTm), apesar da deleção dos últimos 24 aminoácidos C-terminais. Para investigar com mais detalhes a natureza da interação cabeça-cauda, nós construímos dois fragmentos que compreendem a metade N-terminal da molécula de Tm, ASTm1-142 e nfTm1-142, o primeiro deles contendo uma fusão dipeptídica AS no N-terminal e o segundo com o N-terminal não acetilado, sem a fusão dipeptídica. Estes dois fragmentos foram empregados em ensaios de interação cabeça-cauda, realizados através de ensaios de desnaturação térmica acompanhados por dicroísmo circular, juntamente com três fragmentos da região C-terminal da Tm. Dois dos fragmentos e-terminais acabam na posição 260 (Tm167-260 e Tm143-260) e um deles termina na posição 284 (Tm220-284), que corresponde ao C-terminal nativo da proteína. Os resultados mostram que ocorre uma interação cabeça-cauda entre o fragmento N-terminal ASTm1-142 e todos os fragmentos C-terminais utilizados neste estudo. As moléculas recombinantes de Tm que terminam na posição 260 são, de fato, capazes de fazer interações cabeça-cauda independentemente do fato de elas se apresentarem instáveis nas condições estudadas. Inclusive, após a interação, ocorre um aumento considerável na estrutura a-hélice, o que se dá preferencialmente nos fragmentos C-terminais. / Tropomyosin (Tm) participates in the process of muscle contraction, which is controlled by an allosteric mechanism involving Ca2+, troponin (Tn), actin (Ac) and myosin. Tm is a coiled-coil flexible molecule composed by two α-helices with 284 amino acids each. Tm molecule performs head-to-tail interactions with another Tm molecule through the overlap of approximately 8 to 15 N-terminal residues of one molecule with 8 to 15 C-terminal residues of the other molecule. Thus Tm forms linear filaments in low ionic strengths, which is characteristic for a polymerization process. The stability of specific regions of Tm may be important to its function in controlling the regulation of muscle contraction. Besides, Tm can be used as a relatively simple model and of natural occurrence to understand the intra- and intermolecular interactions that govern the stability of \"coiled-coils\". We therefore produced eight recombinant fragments of Tm (Tm143-284(50HW), Tm189-284(50HW), Tm189-284, Tm220-284(50HW), Tm220-284, Tm143-235, Tm167-260 and Tm143-260) and one synthetic peptide (Ac-Tm215-235) to investigate the relative conformational stabilities of different regions derived from the C-terminal end of the molecule, which is known to interact with the troponin complex. Analytical ultracentrifugation experiments show that fragments comprising the last 24 residues of the molecule (Tm143-284(50Hw), Tm189-284(50HW), Tm220-284(50Hw), Tm220-284) are completely dimerized at 10 µM (dimer concentration in buffer containing 50 mM phosphate, pH 7.0, 100 mM NaCI, 0.5 mM DTT and 0.5 mM EDTA, 10ºC), whereas the fragments that do not posses the native C-terminal portion (Tm143-235, Tm167-260 and Tm143-260) present a monomer-dimer equilibrium at the same conditions. Trifluoroethanol promoted a decrease in the ratio [θ]222/[θ]208 for all fragments (observed by circular dichroism), and induced the formation of stable trimers for the fragments comprising the residues 261-284. Urea denaturation studies, followed by circular dichroism and fluorescence, show that residues 261-284 of Tm are very important for the stability of the C-terminal half of the molecule. Still, the absence of this region promotes an increase in the cooperativity of unfolding induced by urea. Urea and temperature denaturation experiments showed that the fragment Tm143-235 is relatively unstable when compared to other fragments of the same size. We identified some factors that may be contributing to the particular instability of this region, including interhelix repulsions between residues in positions g and e\' of the heptad repeat, a charged residue in the hydrophobic interface of the coiled-coil and a great fraction of (β-branched residues located at d positions. It is known that the non-acetylation of the N-terminus of the Tm molecule, as well as, the absence of some residues in the C-terminus of the molecule cause Tm to loose its ability to undergo polymerization. Former works performed in our laboratory showed that a fragment of recombinant Tm (ASTm1-260) with the dipeptide fusion Ala-Ser (which is known by its ability in restores the polymerization of non-acetylated Tms), despite the absence of the C-terminal 24 amino acids, polymerizes to a much greater extent than the corresponding full length recombinant protein. To better investigate the nature of the head-to-tail interaction we constructed two fragments that comprise the N-terminal half of the Tm: ASTm1-142 and nfTm1-142, the former containing the dipeptide AS (Ala-Ser) fusion to its N-terminus, and the latter presenting a bare non-acetylated N-terminus without the dipeptide fusion . These two fragments were employed in thermal denaturation assays followed by circular dichroism to test their head-to-tail interaction along with three fragments comprising Tm\'s C-terminal region. Two of the C-terminal fragments ends at position 260 (Tm167-260 and Tm143-260), whereas one ends at position 284 (Tm220-284). Results show that there is a head-to-tail interaction between the N-terminal fragment ASTm1-142 and all other e-terminal fragments employed in this study. Recombinant Tm molecules ending at position 260, are capable of performing head-to-tail interactions, regardless of their stability under the studied condition. Upon interaction, an increase in the a-helix content occurs preferentially in the e-terminal fragments.

Uma série de mutantes recombinantes da tropomiosina com a sonda fluorescente 5-hidroxitriptofano inserida em várias posições ao longo da seqüência primária vêm sendo utilizados em nosso laboratório para o estudo em nível molecular do controle do processo de contração muscular. Estes mutantes têm sido produzidos em cepas de bactéria auxotróficas para triptofano em meio mínimo ao qual adicionamos 5-hidroxitriptofano, um análogo do aminoácido triptofano. Esta sonda fluorescente apresenta a vantagem de absorver energia numa faixa de comprimentos de onda não absorvida pelo triptofano (temos usado com sucesso o comprimento de onda de 312 nm para excitar seletivamente o 5-hidroxitriptofano). Desta forma, o ambiente da sonda pode ser estudado em situações nas quais outras proteínas que possuam triptofanos, como, por exemplo a actina, estejam presentes. Procedemos a uma caracterização dos mutantes utilizados quanto à sua ligação à actina na ausência e presença de troponina (+/- Ca2+) e na presença de acrilamida por meio de ensaios de co-sedimentação com actina. O comportamento funcional dos diversos mutantes foi investigado pela análise da regulação da atividade Mg2+ -ATPásica da acto-S1 miosina destes mutantes na ausência e na presença de troponina (+/- Ca2+). Estudos da estabilidade destes mutantes da tropomiosina por meio de desnaturação por temperatura seguida por dicroísmo circular foram realizados para analisarmos o efeito das mutações na estabilidade global da molécula. Ensaios de desnaturação por uréia seguidas por fluorescência também foram realizados para analisarmos a estabilidade da molécula próxima à região da sonda fluorescente. O presente estudo compreendeu ainda a análise da supressão de fluorescência pelos supressores extrínsecos acrilamida e iodeto para diversos mutantes da tropomiosina na presença e ausência de outras proteínas do filamento fino, o que permitiu a obtenção de informações sobre o grau de exposição da sonda fluorescente nas diversas situações estudadas bem como sobre o ambiente eletrostático ao redor das sondas nestas diferentes situações. Estes resultados permitiram a obtenção de um modelo para a ligação da tropomiosina ao filamento de actina na presença de troponina (+/- Ca2+). Este modelo propõe que as bandas α do padrão de repetição α/β inicialmente proposto por Mclachlan e Stewart (1975 e 1976) se liguem ao filamento na ausência de íons cálcio. A introdução de cálcio no sistema é capaz de induzir uma rotação e um deslocamento na molécula de tropomiosina com relação ao filamento de actina. Nesta situação, seriam as bandas β da tropomiosina as responsáveis pela ligação desta molécula ao filamento de actina. / Several recombinant mutants of tropomyosin with the fluorescent probe 5-hydroxytryptophan inserted at several positions along the primary sequence are being used in our laboratory for studying the control of the muscular contraction process at a molecular level. These mutants are produced in bacterial strains auxotrophic to tryptophan in minimal medium to which 5- hydroxytryptophan, a tryptophan analogue, is added. This fluorescent probe has the advantage of absorbing light in a range of wavelengths not absorbed by the amino acid tryptophan (we have been successfully using the wavelength of 312 nm to selectively excite the 5-hydroxytryptophan). The environment of the probe can thus be studied even when other tryptophan containing proteins, such as actin, are present. We have characterized the mutants as to their ability to bind to actin in the absence and in the presence of troponin (+/- Ca2+) and in the presence of acrylamide through actin co-sedimentation assays. The functional behavior of the several mutants constructed was assessed by analyzing their ability to regulate the acto-S1 myosin Mg2+-ATPase activity in the absence and in the presence of troponin (+/- Ca2+). Studies on the stability of these tropomyosin mutants by thermal denaturation followed by circular dichroism were performed to analyze the effect of the mutations on the molecule\'s global stability. Urea denaturation assays followed by fluorescence were also performed to allow us to investigate the stability of the molecule in the vicinity of the fluorescent probe. The present study also involved the analysis of the fluorescence quenching by the extrinsic quenchers acrylamide and iodide for divers tropomyosin mutants in the presence and in the absence of other thin filament proteins. This allowed us to obtain information on the degree of exposure of the fluorescent probe in the several conditions studied as well as on the electrostatic microenvironment surrounding the probes in these different situations. These results enabled us to propose a model for the binding of tropomyosin to the actin filament in the presence of troponin (+/Ca2+). In this model the α-bands from the α/β repetition pattern initially proposed by Mclachlan and Stewart (1975 and 1976) would be binding the filament in the absence of calcium ions. The introduction of calcium to the system would induce a rolling motion in and a displacement of the tropomyosin molecule with relation to the actin filament. In this situation tropomyosin\'s β-bands would be responsible for the binding of this molecule to the actin filament.

Proteínas que se ligam a RNAs geralmente regulam estabilidade, localização e tradução de mensageiros por interação com seqüências específicas na região 3 não traduzida. A proteína PUMILIO foi descrita pela primeira vez em Drosophila, apresentando a função de controlar a tradução de mensageiros alvo durante o desenvolvimento. Homólogos podem ser encontrados em outras espécies filogeneticamente distantes com funções similares. O seqüenciamento do genoma de Arabidopsis thaliana indicou a presença de quatro genes que codificam homólogos ao PUMILIO de Drosophila. Três deles estão no cromossomo II (APUM-1, 2 e 3), com alto grau de identidade e situados muito próximos uns dos outros. A terceira cópia está no cromossomo IV (APUM-4) e sua seqüência tem menor similaridade em relação aos três anteriores. Neste trabalho, foi clonado e caracterizado APUM-2. Ensaios de northern blot e RT-PCR indicaram que o mensageiro de Apum-2 pode ser encontrado em amostras de raiz, caule, folha, flores e frutos. Entretanto, sistemas repórteres, APUM-2::GUS e APUM-2::GFP, foram introduzidos no vegetal e a expressão foi observada nos ápices do caule e raízes, especificamente nas regiões meristemáticas. Também foram feitas construção para ensaios de genética reversa e as plantas contendo construções constitutivas (35S::APUM-2) se desenvolveram sem dominância apical e com grande quantidade de ramos, folhas e raízes secundárias, mostrando perturbações nos meristemas. Os resultados obtidos sugerem que APUM-2 possui papel relevante durante o desenvolvimento meristemático, possivelmente através de interações com mRNAs. / RNA-binding proteins often regulate the stability, localization, and translation of mRNAs by interaction with specific motifs in the 3-UTR. The PUMILIO protein from Drosophila was shown to control translation of specific mRNAs during development. PUMILIO homologs were found in several species and constitute the PUF family. The Arabidopsis thaliana sequencing project revealed four genes homolougs to PUMILIO. Three are situated in chromosome II (APUM-1, 2, and 3) that are nearly identical among themselves, and that contain a region that is 52% homologous to the PUMILIO. RNA-binding domain. The fourth is in chromosome IV (APUM-4), and shows low similarity to the other three. In this work, we characterized APUM-2 in further detail. Northern blots indicated that Apum-2 is expressed in shoot and root apices. Reporter transgenic plants were made that contained either APUM-2::GUS or Apum2::GFP constructs. Reporter gene expression confirmed that APUM-2 is active in shoot and root apices, specifically in the meristematic regions. Finally transgenic plants containing the 35S::APUM-2 construct were created. Constitutive APUM-2 expression resulted in plants with no apical dominance and a high number of leaves, stems and lateral roots. These results suggest that APUM-2 plays an important role during meristem development, possibly through a mRNA interaction.

Em Saccharomyces cerevisiae, Rrp43p é uma proteína que faz parte do exossomo, um complexo multiproteíco que atua no processamento de snoRNAs, snRNAs e rRNAs e na degradação de mRNA. O exossomo está envolvido nesses processos através de uma ação 3\'→5\' exonucleolítica. Este complexo é composto por onze subunidades em S. cerevisiae e cada uma dessas subunidades tem uma ação predominante nos diferentes processos em que o complexo participa. Por estar envolvido diretamente na maturação dos rRNAs e alguns snoRNAs e snRNAs, assim como na degradação de mRNAs, o exossomo tem um papel importante no controle de expressão gênica. Com o objetivo de entender melhor a função da subunidade do exossomo Rrp43p, e conseqüentemente do complexo, nas modificações do RNA, realizamos estudos de interação entre proteínas através do método de \"two hybrid\", que permite analisar interações in vivo entre duas proteínas, convertendo-se assim, em uma ferramenta importante nestes estudos. Utilizando Rrp43p como \" isca\" estudamos interações com outras proteínas expressas em Saccharomyces cerevisiae, na procura de proteínas envolvidas em alguns eventos de processamento de RNA, que pudessem ajudar a esclarecer em maior detalhe o papel do exossomo na célula. Também examinamos interações da Rrp43p com os demais componentes do exossomo para determinar a possível estrutura deste complexo. Os resultados obtidos demonstram que Rrp43p interage com somente uma outra subunidade do exossomo, Rrp46p. A força desta interação, quando quantificada através do nível de expressão de um gene repórter, é compatível com o fato dessas proteínas formarem parte de um complexo. Estes dados constituem resultados inéditos a respeito da interação entre subunidades do exossomo. Os resultados evidenciam também a interação entre Rrp43p e uma proteína com função ainda não caracterizada em levedura (aqui denominada 137p). Esta interação foi detectada através do sistema do duplo híbrido, e depois confirmada por co-imunoprecipitação. A determinação da função desta nova proteína poderá ampliar as ferramentas de estudo da função e controle de atividade de Rrp43p e do exossomo. / In the yeast Saccharomyces cerevisiae, Rrp43p is one of the eleven subunits of the exosome, a complex involved in the processing of snoRNAs, snRNAs and rRNAs, and in mRNA degradation. The exosome participates in these processes through a 3\'-to-5\' exonucleolytic activity. Each of the eleven subunits is predominately active in one or few of the processes in which the complex takes part. Since the exosome is involved directly in rRNAs, and in some snRNAs and snoRNAs maturation, as well as in mRNA degradation, it plays an important role on the control of gene expression. Aiming to a better understanding of the Rrp43p subunit function on RNA processing, we started a screening for Rrp43p-interacting proteins through the yeast two hybrid system. In this study we expected to find proteins interacting with Rrp43p, which were involved in some aspects of RNA processing, and would improve the current knowledge on the exosome function. In order to obtain more information about the complex structure, we have also studied the interactions between Rrp43p and the other exosome subunits. The results shown here demonstrate that Rrp43p interacts with only one other exosome subunit, Rrp46p. These results can help elucidate the final exosome structure. We also found the interaction of Rrp43p with a protein of yet uncharacterized function (here named 137p). This interaction, identified in the two hybrid system, was also confirmed through co-immunoprecipitation analysis, and the study of 137p function might bring new insights on Rrp43p function and control.

Proteínas que se ligam a RNAs geralmente regulam estabilidade, localização e tradução de mensageiros por interação com seqüências específicas na região 3 não traduzida. A proteína PUMILIO foi descrita pela primeira vez em Drosophila, apresentando a função de controlar a tradução de mensageiros alvo durante o desenvolvimento. Homólogos podem ser encontrados em outras espécies filogeneticamente distantes com funções similares. O seqüenciamento do genoma de Arabidopsis thaliana indicou a presença de quatro genes que codificam homólogos ao PUMILIO de Drosophila. Três deles estão no cromossomo II (APUM-1, 2 e 3), com alto grau de identidade e situados muito próximos uns dos outros. A terceira cópia está no cromossomo IV (APUM-4) e sua seqüência tem menor similaridade em relação aos três anteriores. Neste trabalho, foi clonado e caracterizado APUM-2. Ensaios de northern blot e RT-PCR indicaram que o mensageiro de Apum-2 pode ser encontrado em amostras de raiz, caule, folha, flores e frutos. Entretanto, sistemas repórteres, APUM-2::GUS e APUM-2::GFP, foram introduzidos no vegetal e a expressão foi observada nos ápices do caule e raízes, especificamente nas regiões meristemáticas. Também foram feitas construção para ensaios de genética reversa e as plantas contendo construções constitutivas (35S::APUM-2) se desenvolveram sem dominância apical e com grande quantidade de ramos, folhas e raízes secundárias, mostrando perturbações nos meristemas. Os resultados obtidos sugerem que APUM-2 possui papel relevante durante o desenvolvimento meristemático, possivelmente através de interações com mRNAs. / RNA-binding proteins often regulate the stability, localization, and translation of mRNAs by interaction with specific motifs in the 3-UTR. The PUMILIO protein from Drosophila was shown to control translation of specific mRNAs during development. PUMILIO homologs were found in several species and constitute the PUF family. The Arabidopsis thaliana sequencing project revealed four genes homolougs to PUMILIO. Three are situated in chromosome II (APUM-1, 2, and 3) that are nearly identical among themselves, and that contain a region that is 52% homologous to the PUMILIO. RNA-binding domain. The fourth is in chromosome IV (APUM-4), and shows low similarity to the other three. In this work, we characterized APUM-2 in further detail. Northern blots indicated that Apum-2 is expressed in shoot and root apices. Reporter transgenic plants were made that contained either APUM-2::GUS or Apum2::GFP constructs. Reporter gene expression confirmed that APUM-2 is active in shoot and root apices, specifically in the meristematic regions. Finally transgenic plants containing the 35S::APUM-2 construct were created. Constitutive APUM-2 expression resulted in plants with no apical dominance and a high number of leaves, stems and lateral roots. These results suggest that APUM-2 plays an important role during meristem development, possibly through a mRNA interaction.

Em Saccharomyces cerevisiae, Rrp43p é uma proteína que faz parte do exossomo, um complexo multiproteíco que atua no processamento de snoRNAs, snRNAs e rRNAs e na degradação de mRNA. O exossomo está envolvido nesses processos através de uma ação 3\'→5\' exonucleolítica. Este complexo é composto por onze subunidades em S. cerevisiae e cada uma dessas subunidades tem uma ação predominante nos diferentes processos em que o complexo participa. Por estar envolvido diretamente na maturação dos rRNAs e alguns snoRNAs e snRNAs, assim como na degradação de mRNAs, o exossomo tem um papel importante no controle de expressão gênica. Com o objetivo de entender melhor a função da subunidade do exossomo Rrp43p, e conseqüentemente do complexo, nas modificações do RNA, realizamos estudos de interação entre proteínas através do método de \"two hybrid\", que permite analisar interações in vivo entre duas proteínas, convertendo-se assim, em uma ferramenta importante nestes estudos. Utilizando Rrp43p como \" isca\" estudamos interações com outras proteínas expressas em Saccharomyces cerevisiae, na procura de proteínas envolvidas em alguns eventos de processamento de RNA, que pudessem ajudar a esclarecer em maior detalhe o papel do exossomo na célula. Também examinamos interações da Rrp43p com os demais componentes do exossomo para determinar a possível estrutura deste complexo. Os resultados obtidos demonstram que Rrp43p interage com somente uma outra subunidade do exossomo, Rrp46p. A força desta interação, quando quantificada através do nível de expressão de um gene repórter, é compatível com o fato dessas proteínas formarem parte de um complexo. Estes dados constituem resultados inéditos a respeito da interação entre subunidades do exossomo. Os resultados evidenciam também a interação entre Rrp43p e uma proteína com função ainda não caracterizada em levedura (aqui denominada 137p). Esta interação foi detectada através do sistema do duplo híbrido, e depois confirmada por co-imunoprecipitação. A determinação da função desta nova proteína poderá ampliar as ferramentas de estudo da função e controle de atividade de Rrp43p e do exossomo. / In the yeast Saccharomyces cerevisiae, Rrp43p is one of the eleven subunits of the exosome, a complex involved in the processing of snoRNAs, snRNAs and rRNAs, and in mRNA degradation. The exosome participates in these processes through a 3\'-to-5\' exonucleolytic activity. Each of the eleven subunits is predominately active in one or few of the processes in which the complex takes part. Since the exosome is involved directly in rRNAs, and in some snRNAs and snoRNAs maturation, as well as in mRNA degradation, it plays an important role on the control of gene expression. Aiming to a better understanding of the Rrp43p subunit function on RNA processing, we started a screening for Rrp43p-interacting proteins through the yeast two hybrid system. In this study we expected to find proteins interacting with Rrp43p, which were involved in some aspects of RNA processing, and would improve the current knowledge on the exosome function. In order to obtain more information about the complex structure, we have also studied the interactions between Rrp43p and the other exosome subunits. The results shown here demonstrate that Rrp43p interacts with only one other exosome subunit, Rrp46p. These results can help elucidate the final exosome structure. We also found the interaction of Rrp43p with a protein of yet uncharacterized function (here named 137p). This interaction, identified in the two hybrid system, was also confirmed through co-immunoprecipitation analysis, and the study of 137p function might bring new insights on Rrp43p function and control.

Defects in intracellular transport are implicated in the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD). Hook proteins are a family of cytoplasmic linker proteins that participate in endosomal transport. In this study we show that Hook1 and Hook3 are expressed in neurons while Hook2 is predominantly expressed in astrocytes. Furthermore, Hook proteins are associated with pathological hallmarks in AD; Hook1 and Hook3 are localized to tau aggregates and Hook2 to glial components within amyloid plaques. Additionally, the expression of Hook3 is reduced in AD. Modelling of Hook3 deficiency in cultured cells leads to slowing of endosomal transport and increases β-amyloid production. We propose that Hook3 plays a role in pathogenic events exacerbating AD.

Capítulo 1 A transformação (metaciclogênese) das formas proliferativas epimastigotas do Trypanosoma cruzi em formas não proliferativas e infectivas - tripomastigotas metacíclicos - é um passo crucial que ocorre naturalmente no trato digestivo do inseto vetor reduviídeo. Este processo pode ser reproduzido in vitro em condições químicas definidas quando o meio de diferenciação TAU é suplementado com L-prolina e L-glutamato. Está bem estabelecido que prolina é uma fonte importante de energia e de carbono nos tripanossomatídeos, mas são poucas as evidências de sua participação na diferenciação intracelular do parasita no hospedeiro vertebrado. Este fato nos levou a desenvolver um modelo experimental para verificar se havia uma relação entre concentração de prolina e eclosão de formas tripomastigotas. Culturas mantidas sem L-prolina produziram consistentemente menos formas tripomastigotas quando comparadas a culturas mantidas em L-prolina, 20 - 200 µM. A atividade de transporte de L-prolina foi 15 vezes e 23 vezes maior nos epimastigotas intracelulares em relação a amastigotas e tripomastigotas, respectivamente. A concentração de prolina medida nos epimastígotas intracelulares (0,73 ± 0101 mM) é bem menor que a de amastigotas (6,61 ± 0,01 mM) e tripomastigotas (2,74 ± 0,02 mM). Todos os estágios, no entanto, apresentaram concentração de prolina bem maior do que as células hospedeiras, na ordem de 0,27 ± 0,03 mM. A análise do efeito de prolina sobre os diferentes estágios intracelulares mostrou a importância desse aminoácido na transformação de epimastigotas intracelulares a tripomastigotas. Capítulo 2 A diferenciação das formas infecciosas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi a formas amastigotas não-infectivas e replicativas ocorre normalmente no citoplasma de células infectadas. Um estudo sobre o envolvimento de proteínas fosfatase do tipo 1 e 2A na diferenciação extracelular a 37ºC e 33ºC de tripomastigotas a formas amastigotas foi realizado, utilizando-se o clone CL-14 de T cruzi. Demonstrou-se que Caliculina A (um inibidor de proteínas fosfatase 1 e 2A) desencadeia a transformação de tripomastigotas a amastigotas em pH neutro, através da passagem por formas intermediárias flageladas semelhantes aos epimastigotas. O tratamento de tripomastigotas com duas concentrações de Caliculina A (1nM e 5 nM) resultou, após 6 horas de incubação, em mais de 50% de formas epimastigota-símiles. Após 8 horas de tratamento, todos os tripomastigotas estavam diferenciados a formas amastigotas ou epimastigota símiles. Tripomastigotas metacíclicos do clone CL-14 submetidos ao mesmo tratamento com Caliculina A não apresentaram alterações morfológicos dentro do período de incubação de 8 horas. Capítulo 3 Fatores ambientais, como a temperatura, e a presença ou ausência de metabólitos tais como a L-prolina influenciam a diferenciação intracelular do Trypanosoma cruzi do clone CL-14. Estes fatos, juntamente com a ausência de dados na literatura sobre o perfil proteico de epimastigotas intracelulares levou-nos a estudar o perfil de expressão de proteínas durante a transformação de epimastigotas intracelulares a tripomastigotas em culturas celulares mantidas a 37ºC (temperatura restritiva), comparando-as com aquelas cuja manutenção foi feita a 33ºC (temperatura permissiva). Também foram comparados os perfis proteicos quando os parasitas foram obtidos de culturas celulares mantidas na ausência ou presença de diferentes concentrações de L-prolina. Para tanto, foram feitas preparações de frações enriquecidas em membranas e frações citossólicas dos diferentes estágios do parasita para posterior resolução por eletroforese bidimensional. Através desta análise foi possível identificar polipeptídeos comuns entre os diferentes estágios bem como polipeptídeos específicos de cada estágio de desenvolvimento. / Chapter 1 The transformation of the proliferative epimastigotes of Trypanosoma cruzi into the non-proliferative and infective metacyclic trypomastigotes (metacyclogenesis) is a crucial step occuring naturally in the digestive tract of the reduviid insect vector. This process can be reproduced, in vitro, under chemically defined conditions. It is well established that L-proline is an important energy and carbon source for trypanosomatids but no evidence for its participation in the differentiation of vertebrate host stages of the parasite exists in the literature. This fact prompted us to develop an experimental model to study whether a correlation exits between proline concentration and trypomastigote bursting. In fact, cultures maintained in the absence of L-proline consistently produced fewer trypomastigote forms when compared to cultures maintained in 20 - 200 µM L-proline. The transport activity of L-proline was 15-fold and 23-fold higher in intracellular epimastigote-like forms as compared to amastigotes and trypomastigotes, respectively. Interestingly, proline concentration in intracellular epimastigote-like parasites was 0.73 ± 0.01 mM, as compared to 6.61 ± 0.01 mM for amastigotes and 2.74 ± 0.02 mM for trypomastigotes, while host cells showed an intracellular proline concentration of 0.27 ± 0.03 mM. The data suggest the importance of L-proline in the transformation of intracellular epimastigote-like forms to trypomastigotes. Chapter 2 Differentiation of the infective trypomastigote form of Trypanosoma cruzi to the non-infective and replicative amastigotes normally occurs in the cytoplasm of infected cells. A study about the envolvement of protein phosphatases type 1 and 2A in the extracellular differentiation at 37ºC and 33ºC from trypomastigotes to amastigotes was undertaken using the CL-14 clone of T. cruzi. Calyculin A (an inhibitor of protein phosphatases 1and 2A) triggers the transformation of trypomastigotes to amastigotes at neutral pH through epimastigote-like intermediate forms. Treatment of trypomastigotes for 6 hours with two Calyculin A concentrations (1 nM and 5 nM) resulted in more than 50% of epimastigote-like forms. After 8 hours, all trypomastigotes were differentiated to amastigotes or epimastigotes-like forms. Metacyclic trypomastigotes from the CL-14 clone submitted to the same treatment with Calyculin A showed no morphological changes.