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Das Typ III Sekretionssystem (T3SS) ist ein Proteinkomplex den Gramnegative Bakterien nutzen um in einem Schritt Effektorproteine (Effektoren) aus dem Zytosol über die Doppelmembran zu sekretieren. Für viele Bakterien ist das T3SS ein essenzieller Virulenzfaktor, der es ihnen erlaubt mit ihrem Wirt zu interagieren und diesen zu manipulieren. Charakteristisch für das T3SS ist die strukturelle Komponente, der Nadelkomplex. Dieser ähnelt strukturell einer Spritze, deren Basalkörper die bakteriellen Membranen und das Periplasma durchspannt und einer Nadel, die vom Basalkörper aus dem Bakterium ragt. Basierend auf dem Modell einer Spritze wird angenommen, dass Effektoren entfaltet und anschließend durch Basalkörper und Nadelkanal sekretiert werden. Trotz der kontinuierlichen Forschung an T3SS entbehrt dieses Modell einer experimentellen Grundlage und der Mechanismus ist nicht vollständig erklärt. Ziel der Arbeit war es, eine experimentelle Basis für den Sekretionsmechanismus des T3SS zu schaffen. Um zu verstehen, wie das T3SS Effektoren sekretiert, wurden zunächst Fusionsproteine konstruiert, welche aus einem Effektor und einem stabil gefalteten Knotenprotein bestehen. Aufgrund des Knotens in der Fusion ist davon auszugehen, dass dieser während der Sekretion nicht entfalten kann. Die Effektordomäne wird sekretiert während der Knoten im Kanal verbleibt und diesen verstopft. Nach unseremWissen ist diese Arbeit die erste Visualisierung von Effektorfusionen an isolierten Nadelkomplexen. Die Effektorfusion wird N-terminal voran durch den Kanal sekretiert, wobei der Kanal das Substrat umschließt und gegen Proteasen und chemische Modifikationen abschirmt. Die Ergebnisse dieser Arbeit untermauern eine Grundidee der Funktionsweise des T3SS und liefern eine vielversprechende Strategie für in situ-Strukturanalysen. Dieser Ansatz lässt sich auch auf andere Proteinsekretionssysteme übertragen, bei welchen Substrate vor dem Transport entfaltet werden müssen. / The Type III Secretion System (T3SS) is a complex used by Gram-negative bacteria to secrete effector proteins from the cytoplasm across the bacterial envelope in a single step. For many pathogens, the T3SS is an essential virulence factor that enables the bacteria to interact with and manipulate their respective host. A characteristic structural feature of the T3SS is the needle complex (NC). The NC resembles a syringe with a basal body spanning both bacterial membranes and a long needle-like structure that protrudes from the bacterium. Based on the paradigm of a syringe-like mechanism, it is generally assumed that effectors are unfolded and secreted from the bacterial cytoplasm through the basal body and needle channel. Despite extensive research on T3SS, this hypothesis lacks experimental evidence and the mechanism of secretion is not fully understood. This work aimed to provide an experimental basis for the model of the T3SS mechanism. In order to elucidate details of the effector secretion mechanism, fusion proteins consisting of an effector and a bulky protein containing a knotted motif were generated. It is assumed that the knot cannot be unfolded during secretion of the chimera. Consequently, these fusions are accepted as T3SS substrates but remain inside the NC channel and obstruct the T3SS. This is, to our best knowledge, the first time effector fusions have been visualized together with isolated NCs and it demonstrates that effector proteins are secreted directly through the channel with their N-terminus first. The channel encloses the substrate and shields it from a protease and chemical modifications. These results corroborate an elementary understanding of how the T3SS works and provide a powerful tool for in situ-structural investigations. This approach might also be applicable to other protein secretion systems that require unfolding of their substrates prior to secretion.

In der Hefe Saccharomyces cerevisiae können Proteine entweder co- oder posttranslational durch die Membran des Endoplasmatischen Retikulum transportiert werden. Sie besitzen eine Signalsequenz, die sie zu einem hydrophilen Kanal in der Membran bringt, durch den der Transport erfolgt. Die zentrale Komponente des Translokationsapparates in der Membran ist der aus den Untereinheiten Sec61p, Sbh1p und Sss1p bestehende Sec61p-Komplex. Beim Proteintransport wirkt der Sec61p-Komplex zusammen mit anderen Faktoren: Im cotranslationalen Transport geht er eine feste Bindung mit Ribosomen ein; der posttranslationale Transport erfordert die Assoziation mit dem tetrameren Sec62/63p-Komplex unter Bildung des sogenannten Sec-Komplexes. In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur des Sec61p-Komplexes durch Elektronenmikroskopie analysiert. Er liegt in Detergenzlösung in ringförmigen Strukturen mit einem Durchmesser von ~82Å und einer zentralen Pore von ~21Å vor. Jeder Ring besteht aus drei oder vier heterotrimeren Sec61p-Komplexen. Die oligomeren Ringstrukturen des Sec61p-Komplexes entsprechen vermutlich proteinleitenden Kanälen der Membran des Endoplasmatischen Retikulum. In Membranen wird ihre Bildung durch die Bindung von Ribosomen oder die Interaktion mit dem Sec62/63p-Komplex induziert. Eine dreidimensionale Struktur, die durch Kryo-Elektronenmikroskopie erhalten wurde, zeigt, daß das Ribosom so an den Sec61p-Komplex bindet, daß der Tunnel im Ribosom, durch den die naszierende Polypeptidkette das Ribosom verläßt, genau in die zentrale Pore des Sec61p-Oligomers mündet. Es existiert also ein kontinuierlicher Kanal, der sich vom Peptidyltransferase-Zentrum im Ribosom durch die zentrale Pore des Sec61p-Oligomers erstreckt, durch den naszierende Polypeptidketten cotranslational direkt in das Lumen des Endoplasmatischen Retikulum transportiert werden könnten. In dieser Arbeit wurde ein dem Sec61p-Komplex verwandter heterotrimerer Komplex in der Membran des Endoplasmatischen Retikulum identifiziert, der aus den Untereinheiten Ssh1p, Sbh2p und Sss1p besteht. Sss1p ist beiden trimeren Komplexen gemein; Ssh1p und Sbh2p sind homolog zu Sec61p bzw. Sbh1p. Durch Deletion von Ssh1p und Sbh2p wurde gezeigt, daß der Ssh1p-Komplex wie der Sec61p-Komplex am Transport von Proteinen in das Endoplasmatische Retikulum beteiligt ist. Der Ssh1p-Komplex ist mit membrangebundenen Ribosomen assoziiert und bildet in Detergenzlösung oligomere Ringstrukturen, aber interagiert nicht mit dem Sec62/63p-Komplex. Wir postulieren daher, daß der Ssh1p-Komplex ausschließlich den cotranslationalen Transport von Proteinen vermittelt. Beim posttranslationalen Transport interagiert das vollständig synthetisierte Modellsubstrat Prepro-Alphafaktor mit vielen cytosolischen Proteinen. Die cytosolischen Chaperone Hsp70 und TRiC konnten als Interaktionspartner identifiziert werden. Bei der Bindung des Prepro-Alphafaktors an die Membran werden die cytosolischen Proteine freigesetzt. Wir verwendeten einen Photoquervernetzungsansatz, um zu untersuchen, wie die Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors im Bindungsschritt durch den Sec-Komplex erkannt wird. Die Signalsequenz-bindungsstelle wird hauptsächlich von Sec61p gebildet und befindet sich an der Grenzfläche zur Lipiddoppelschicht. Die gebundene Signalsequenz ist in einer helikalen Struktur fixiert und wird auf gegenüberliegenden Seiten von den Transmembrandomänen 2 und 7 des Sec61p umgeben. Sec62p und Sec71p, zwei Untereinheiten des Sec62/63p-Komplexes, flankieren gemeinsam eine Seite der Signalsequenzhelix, befinden sich aber in größerer Entfernung zur Signalsequenz als Sec61p. Es wird ein Modell vorgeschlagen, das beschreibt, wie die Bindung der Signalsequenz den Translokationskanal für den Transport öffnen könnte. / Protein transport across the membrane of the endoplasmic reticulum occurs either co- or posttranslationally in the yeast Saccharomyces cerevisiae. In both cases, polypeptides are directed to a translocation apparatus in the membrane by virtue of their signal sequences and then transported across the lipid bilayer through a protein-conducting channel. The major component of the protein translocation apparatus in the membrane is the heterotrimeric Sec61p complex consisting of the subunits Sec61p, Sbh1p and Sss1p. During translocation the Sec61p complex associates with other factors: In the cotranslational mode it interacts with ribosomes, whereas in the posttranslational mode it associates with the tetrameric Sec63/62p complex to form the so-called Sec complex. Here, we have analyzed the structure of the Sec61p complex by electron microscopy. In detergent this complex forms ring-like structures with a diameter of about 82Å and a central pore of about 21Å. Each ring contains 3 or 4 heterotrimeric Sec61p complexes. In membranes the formation of ring structures of the Sec61p complex is induced by its association with ribosomes or the Sec62/63p complex. We propose that the ring-like Sec61p oligomers represent protein-conducting channels of the endoplasmic reticulum membrane. A 3-dimensional structure of the ribosome-Sec61p complex obtained by electron-cryo-microscopy and single particle reconstruction showed, that the central pore of the Sec61p oligomer aligns precisely with the exit of a tunnel traversing the large ribosomal subunit that forms the passageway for the nascent chain. Thus, in cotranslational translocation a continuous channel extending from the ribosome through the Sec61p oligomer could guide the nascent chain directly into the lumen of the endoplasmic reticulum. Furthermore, we have discovered a trimeric protein complex in the yeast endoplasmic reticulum membrane that is structurally related to the Sec61p complex. This so-called Ssh1p complex consists of Ssh1p, a distant relative of Sec61p, of Sbh2p, a homolog of the Sbh1p subunit of the Sec61p complex, and of Sss1p, a component common to both trimeric complexes. In contrast to Sec61p, Ssh1p is not essential for cell viability, but it is required for normal growth rates. Sbh1p and Sbh2p individually are also not essential for cell viability, but cells lacking both proteins are impaired in their growth at elevated temperature and accumulate precursors of secretory proteins in the cytosol. Like the Sec61p complex, the Ssh1p complex forms ring-like structures in detergent and interacts with membrane-bound ribosomes, but it does not associate with the Sec62/63p complex. We therefore postulate that the Ssh1p complex functions exclusively in the cotranslational pathway of protein translocation. In the posttranslational transport process the newly synthesized translocation substrate prepro-a-factor associates with a large number of cytosolic proteins including the chaperones Hsp70 and TRiC. Upon binding of prepro-a-factor to the Sec complex all cytosolic proteins are released. Using a photo-crosslinking approach and a unique mapping technique we have investigated, how the signal sequence of prepro-a-factor is recognized by the Sec complex during the binding step. The signal sequence contacts primarily the multispanning membrane protein Sec61p. The bound signal sequence adopts a helical structure that interacts on opposite sides with transmembrane domains 2 and 7 of Sec61p, respectively. Sec62p and Sec71p, two subunits of the Sec62/63p complex, contact one side of the signal sequence, but are further away than Sec61p. Our data show, that the signal sequence binding site is located at the interface of the protein channel and the lipid bilayer. We suggest that binding of the signal sequence could open the channel for polypeptide transport.

EBAG9 (estrogen receptor-binding fragment-associated gene 9) hat als unabhängiger prognostischer Marker viel Aufmerksamkeit erregt, da in einigen Tumoren hohe Expressionsraten und Tumorentwicklung korrelieren. In diesen Fällen ist eine hohe EBAG9 Expression häufig mit einer schlechten klinischen Prognose verbunden. EBAG9 ist ein ubiquitär exprimiertes Golgi Protein. Aktuelle Daten demonstrieren, dass es in sekretorischen Zellen an der regulierten Exozytose und an der zytotoxischen Funktion von Lymphozyten beteiligt ist. In epithelialen Zellen führt es zur Generierung von Tumor-assoziierten O-Glykanen, welche ein Erkennungsmerkmal vieler Krebsarten sind. In dieser Arbeit wurde der pathogenetische Zusammenhang zwischen EBAG9 Expression und der Veränderung des zellulären Glykoms untersucht. Um einen tieferen Einblick in die zelluläre Funktion von EBAG9 in epithelialen Zellen zu gewinnen, wurden Zellen mit tumorähnlicher EBAG9 Expression verwendet. Innerhalb dieser Arbeit wurde demonstriert, dass EBAG9 mit anterograden COPI Vesikeln assoziiert und zwischen dem ER-Golgi intermediären Kompartiment und cis-Golgi pendelt. EBAG9 verursacht eine Verzögerung des anterograden Transportes vom ER zum Golgi und verändert die Lokalisation von Komponenten der ER Qualitätskontrolle und des Glycosylierungsapparates. Auf der anderen Seite beschleunigt die verminderte Expression von EBAG9 den Proteintransport durch den Golgi und verstärkt die Aktivität von Mannosidase II. Mechanistisch betrachtet verhindert EBAG9 die Rekrutierung von ArfGAP1 an die Membran. Dies beeinträchtigt das Auflösen der COPI Vesikelhülle und somit die Fusion von Vesikeln am cis-Golgi. Damit agiert EBAG9 in epithelialen Zellen als negativer Regulator des COPI-abhängigen ERGolgi Transportes und stellt damit ein neues phatogenetisches Prinzip dar, bei dem die Beeinflussung des intrazellulären Transportes zu der Entstehung von Tumor-assoziierten Glykanen führt. / The estrogen receptor-binding fragment-associated gene 9 (EBAG9) has received increased attention as an independent prognostic marker for disease-specific survival since in some human tumor entities high expression levels correlate with tumor progression and poor clinical prognosis. Interestingly, EBAG9 was identified as an ubiquitously expressed Golgi protein. Recent data demonstrate an involvement in regulated exocytosis in secretory cells and the cytotoxic functions of lymphocytes. However, EBAG9 is expressed in essentially all mammalian tissues, and in epithelial cells it has been identified as a modulator of tumorassociated O-linked glycan expression, a hallmark of many carcinomas. This thesis addresses the pathogenetic link between EBAG9 expression and the alteration of the cellular glycome. To gain further insights into the cellular functions of EBAG9 in epithelial cells, tumor-associated EBAG9 overexpression was mimicked in living cells. It was demonstrated that EBAG9 associates with anterograde COPI-coated carriers and shuttles between the ER-Golgi intermediate compartment and cis-Golgi stacks. EBAG9 overexpression imposes a delay in anterograde ER-to-Golgi transport and mislocalizes components of the ER quality-control and glycosylation machinery. Conversely, EBAG9 downregulation accelerates glycoprotein transport through the Golgi and enhances mannosidase activity. Functionally, EBAG9 impairs ArfGAP1 recruitment to membranes and consequently, interferes with the disassembly of the coat lattice at the cis-Golgi prior to fusion. Thus, EBAG9 acts as a negative regulator of a COPI-dependent ER-to-Golgi transport pathway in epithelial cells and represents a novel pathogenetic principle in which interference with intracellular membrane trafficking results in the emergence of a tumor-associated glycome.