The purpose of this research was to study the synthesis and remodeling of extracellular matrix (ECM) by fibroblasts with special emphasis on the culture environment (media composition and initial ECM composition) and the resulting mechanical integrity of the ECM. This was investigated by culturing fibroblasts for 3 weeks in a variety of culture conditions consisting of collagen gels, fibrin gels, or media permissive to the self-production of ECM (Cell-Derived Matrix), and quantifying the mechanics of the resulting ECM. The mechanical characteristics were related to the biochemistry of the resulting ECM, notably in terms of collagen accumulation and collagen fibril diameters. The ultimate tensile strength (UTS) of the collagen gels and fibrin gels at the end of the 3-week period was 168.5 ± 43.1 kPa and 133.2 ± 10.6 kPa, respectively. The ultimate tensile strength of the cell-derived matrices was 223.2 ± 9 kPa, and up to 697.1 ± 36.1 kPa when cultured in a chemically-defined medium that was developed for the rapid growth of matrix in a more defined environment. Normalizing the strength to collagen density resulted in a UTS / Collagen Density in these groups of 6.4 ± 1.9 kPa/mg/cm3, 25.9 ± 2.4 kPa/mg/cm3, 14.5 ± 1.1 kPa/mg/cm3, and 40.0 ± 1.9 kPa/mg/cm3, respectively. Cells were synthetically more active when they produced their own matrix than when they were placed within gels. The resulting matrix was also significantly stronger when it was self-produced than when the cells rearranged the matrix within gels that corresponded to a significantly larger fraction of non-acid and pepsin extractable collagen. These studies indicate that cell-derived matrices have potential both as in vitro wound healing models and as soft connective tissue substitutes.

La medicina regenerativa és una disciplina que ha guanyat reconeixement en les últimes dècades pel fet que moltes malalties no són tractables amb fàrmacs convencionals. Molts grups de recerca i empreses inverteixen temps i diners en la producció de nous paradigmes per curar malalties com el Parkinson, l'artrosi o la regeneració de medul·la espinal. Aquestes propostes es basen en l'ús de teixits biomimètics per reparar òrgans danyats. En aquesta tesi es presenta un nou model experimental per estudiar la formació d'os i cartílag i eventualment la reparació d'aquests teixits. Hem utilitzat Fibroblasts Embriònics de Ratolí (MEFs) combinats amb diferents materials biomimètics per estudiar os i cartílag in vitro i in vivo. Aquests MEFs es van cultivar in vitro i in vivo en RAD16-I, un pèptid auto-ensamblable amb estructura similar a matrius extracel·lulars genèriques, amb l'objectiu d'estudiar l'evolució dels fibroblasts en aquestes dues condicions. També s'han recobert superficialment micropartícules de hidroxiapatita obtenint càrregues inorgàniques similars a l'os i biològicament actives per a utilitzar-les com a substituts d'os o cartílag. Amb la idea de millorar els recobriments superficials, hem desenvolupat una plataforma que permet dur a terme proves combinatòries amb factors de creixement i altres compostos biològicament actius. Cultius in vitro de MEFs han mostrat que quan fibroblasts embrionaris primaris de ratolí es cultiven en RAD16-I, estableixen una xarxa intercel·lular que causa una contracció cel·lular organitzada, proliferació i migració cel·lulars i culmina amb la formació d'una estructura bilateral i simètrica amb un eix central distingible. Durant aquest procés morfològic, augmenta l'expressió d'un grup de gens mesodèrmics (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2). L'expressió de brachyury està localitzada primer en l'eix de simetria central i després s'extén als dos costats de l'estructura. Per acabar, la formació espontània d'un teixit similar al del cartílag acompanya l'expressió de Sox9 i Runx2.L'estudi in vivo de MEFs es va fer gràcies a la tècnica de presa d'imatges no invasiva basada en bioluminiscència (BLI) que ha desenvolupat en el grup de recerca del dr. Jerónimo Blanco. Aquests experiments han mostrat que el RAD16-I és una matriu molt permissiva per a la supervivència i proliferació cel·lulars in vivo. A més, sembla que les pobres propietats mecàniques que té el RAD16-I no li suposen cap desavantatge en termes de creixement cel·lular in vivo. Finalment, hem desenvolupat diferents tipus de micropartícules de hidroxiapatita (HA) no recobertes, i recobertes mitjançant polimerització assistida per plasma. Els recobriments permeten afinar les propietats de la HA i produir partícules que satisfacin les necessitats de diferents aplicacions mèdiques en reparació d'os i cartílag. També hem desenvolupat un mètode per produir plataformes basades en plaques de 96 pous que permetin fer proves combinatòries amb compostos biològicament actius per vàries aplicacions en medicina regenerativa. En conclusió, hem aportat noves idees i eines que permetran trobar teixits regeneratius basats en l'ús de fibroblasts i materials biomimètics. / La medicina regenerativa es una disciplina que ha ganado reconocimiento en las últimas décadas porque muchas enfermedades no son tratables con fármacos convencionales. Muchos grupos de investigación y empresas invierten tiempo y dinero en la producción de nuevos paradigmas para curar enfermedades como el Parkinson, la artrosis o la regeneración de médula espinal. Estas propuestas se basan en el uso de tejidos biomiméticos para reparar órganos dañados. En esta tesis se presenta un nuevo modelo experimental para estudiar la formación de hueso y cartílago y tal vez la reparación de estos tejidos. Hemos utilizado Fibroblastos Embrionarios de Ratón (MEFs) combinados con diferentes materiales biomiméticos para estudiar hueso y cartílago in vitro e in vivo. Estos MEFs se cultivaron in vitro e in vivo en RAD16-I, un péptido auto-ensamblable con estructura similar a matrices extracelulares genéricas, con el objetivo de estudiar la evolución de los fibroblastos en estas dos condiciones. También se han recubierto superficialmente micropartículas de hidroxiapatita obteniendo cargas inorgánicas similares al hueso y biológicamente activas para utilizarlas como sustitutos de hueso o cartílago. Con la idea de mejorar los recubrimientos superficiales, hemos desarrollado una plataforma que permite llevar a cabo pruebas combinatorias con factores de crecimiento y otros compuestos biológicamente activos. Cultivos in vitro de MEFs han mostrado que cuando fibroblastos embrionarios primarios de ratón se cultivan en RAD16-I, establecen una red intercelular que causa una contracción celular organizada, proliferación y migración celulares y culmina con la formación de una estructura bilateral y simétrica con un eje central distinguible. Durante este proceso morfológico, aumenta la expresión de un grupo de genes mesodérmicos (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2). La expresión de brachyury está localizada primero en el eje de simetría central y después se extiende a los dos lados de la estructura. Para terminar, la formación espontánea de un tejido similar al del cartílago acompaña a la expresión de Sox9 y Runx2.El estudio in vivo de MEFs se hizo gracias a la técnica de toma de imágenes no invasiva basada en bioluminiscencia (BLI) que han desarrollado en el grupo de investigación del dr. Jerónimo Blanco. Estos experimentos han mostrado que el RAD16-I es una matriz muy permisiva para a la supervivencia y proliferación celulares in vivo. Además, parece que las pobres propiedades mecánicas que tiene el RAD16-I no le suponen ninguna desventaja en términos de crecimiento celular in vivo. Finalmente, hemos desarrollado diferentes tipos de micropartículas de hidroxiapatita (HA) no recubiertas, y recubiertas mediante polimerización asistida por plasma. Los recubrimientos permiten afinar las propiedades de la HA y producir partículas que satisfagan las necesidades de diferentes aplicaciones médicas en reparación de hueso y cartílago. También hemos desarrollado un método para producir plataformas basadas en placas de 96 pozos que permitan hacer pruebas combinatorias con compuestos biológicamente activos para varias aplicaciones en medicina regenerativa. En conclusión, hemos aportado nuevas ideas y herramientas que permitirán hallar tejidos regenerativos basados en el uso de fibroblastos y materiales biomiméticos. / Regenerative medicine is a discipline that has gained recognition in the last decades because many diseases are not treatable with traditional drugs. Many research groups and companies invest time and money in the production of new paradigms to cure conditions such as Parkinson's, arthrosis or spinal cord injuries. These approaches are based in the use of biomimetic tissues to replace damaged organs. In this work we present a new experimental model to study the formation of bone and cartilage and eventually to repair these tissues. We have used Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) combined with different biomimetic materials to study bone and cartilage formation in vitro and in vivo. MEFs have been cultured in vitro and in vivo in RAD16-I, a synthetic self-assembling peptide with structure similar to generic extracellular matrix milieu, to study the evolution of these fibroblasts in both conditions. Also, hydroxyapatite microparticles have been surface coated to produce biologically active bone-like inorganic charges for use in cartilage or bone substitutes. In order to improve the particles' coatings, we have developed a platform that allows us to perform combinatorial testing of growth factors and other biologically active compounds. In vitro cultures of MEFs has shown that when primary mouse embryonic fibroblasts are cultured in a soft nanofiber scaffold, they establish a cellular network that causes an organized cell contraction, proliferation, and migration that ends in the formation of a symmetrically bilateral structure with a distinct central axis. A subset of mesodermal genes (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2) is upregulated during this morphogenetic process. The expression of brachyury was localized first at the central axis, extending then to both sides of the structure. The spontaneous formation of cartilage-like tissue mainly at the paraxial zone followed the expression of Sox9 and Runx2.In vivo study of MEFs was facilitated by a non-invasive bioluminescence imaging (BLI) technique to detect luciferase-expressing cells, developed by Dr. Blanco's research group. These experiments showed that RAD16-I is a very permissive scaffold for cell survival and proliferation in vivo. Furthermore, it seems that the poor mechanical properties of RAD16-I are no disadvantage in terms of cell growth in vivo.Finally, we have developed different types of coated and uncoated hydroxyapatite (HA) microparticles by plasma polymerization. The coatings permit to tune the properties of HA and produce particles that suit the needs of different medical applications in bone and cartilage repair. Moreover, we have developed a method to produce platforms based on 96-well plates that allow the combinatorial testing of biologically active compounds for various applications in regenerative medicine. In conclusion, we have supplied new insights and tools that will enhance the finding of new regenerative tissues based on fibroblasts and biomimetic materials.

Les cellules du système immunitaire sont capables de reconnaître et d'éliminer les cellules cancéreuses prévenant ainsi l'apparition de cancers. Parmi celles-ci, l'activité antitumorale est principalement attribuée aux lymphocytes T CD4 helper de type 1 (Thl). Les lymphocytes CD4 sont activés lors de la reconnaissance d'un antigène (Ag) de tumeur présenté par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH-II). Ils possèdent des propriétés cytotoxiques propres et activent les autres cellules immunitaires. Dans un premier temps, nous nous somme intéressés au mécanisme de présentation sur le CMH-II de la télomérase (hTERT). La protéine hTERT est capable d'interagir avec les HSPGs facilitant ainsi son internalisation par les DC. Elle emprunte ensuite les voies endolysosomale et cytosolique pour générer des peptides nommés UCP présentés dans le contexte HLA-DR. Cette découverte soutient son utilisation en immunothérapie associée aux chimiothérapies. Nous avons ensuite identifié quatre peptides dérivés de hTERT restreints HLA-DP4 puis comparé leur immunogénicité avec les UCP. Cette analyse a mis en évidence la supériorité des UCP en termes d'immunoprévalence et d'immunodominance. Enfin, nous avons étudié l'impact de l'acquisition d'une résistance à l'oxaliplatine sur le profil antigénique de lignées tumorales de cancers colorectaux (CCR). L'évaluation des réponses immunitaires de patients atteints de CCR nous a permis d'identifier des peptides immunogènes dérivés d'Ag surexprimés après une exposition à l'oxaliplatine. En conclusion, ces travaux pourront participer à l'amélioration des stratégies d'immunothérapie et d'immunomonitoring ciblant les lymphocytes CD4 Thl. / Immune cells are able to recognize and eliminate cancer cells to prevent from cancer development. Among them, antitumoral activity is mainly attributed to CD4 T helper 1 (Thl) cells. CD4 Thl cells are activated upon recognition of tumor antigen presented on the Major Histocompatibility Complex class II (MHC-II) molecules. These cells possess their own cytotoxic capacities and activate other immune cells. Firstly, we were interested in the mechanism of presentation of the catalytic subunit of telomerase (hTERT) which is an attractive tumor antigen target for immunotherapies. hTERT protein can interact with cell surface HSPGs facilitating its internalization by DC. Then, hTERT uses thé endo-lysosomal and cytosolic proteolysis pathways to generale immunogenic peptides named UCP (Universal Cancer Peptide) presented in HLA-DR context. This discovery is an additional argument in favor of using hTERT as a target for cancer immunotherapies. Then, we identified four novel hTERT-derived peptides presented by HLA-DP4 and compared their immunogenicity with UCP. This analysis highlighted the superiority of UCP in term of immunoprevalence and immunodominance. This stresses the importance of considering MHC-II locus for immunotherapy strategies stimulating CD4 T cells. Finally, we studied the impact of oxaliplatin treatment and/or oxaliplatin résistance acquisition on CRC antigenome. Evaluation of immune responses in CRC patients permitted the identification of immunogenic peptides derived from antigens upregulated after oxaliplatin exposition. In conclusion, this work could participate in the improvement of cancer immunotherapies and immunomonitoring targeting CD4 Thl cells.