A PEGlação é uma bem sucedida estratégia nano-biotecnológica que envolve a ligação covalente do polietilenoglicol (PEG) a uma droga para melhorar sua farmacocinética, farmacodinâmica e perfil imunológico, e portanto, aumentar seu efeito terapêutico. Atualmente, a PEGlação é usada para modificar proteínas, peptídeos, oligonucleotídeos e fragmentos de anticorpos. A Uricase (EC 1.7.3.3, UC) é uma enzima pertencente à classe das oxidorredutases, responsável pela oxidação do ácido úrico, produzindo alantoína. Essa enzima é encontrada em muitos organismos vivos como: bactérias, leveduras, fungos, vegetais e animais. Entretanto, durante a evolução das espécies o gene da UC tornou-se inativo, por isso, em humanos a UC é inativa. Nesse sentido, a UC adquiriu destaque como um potencial fármaco uricolítico, devido à necessidade do desenvolvimento de novos agentes terapêuticos no tratamento de hiperuricemia e gota. Neste estudo, a uricase recombinante purificada de Candida sp (UC-r) e a de rim bovino (UC-b) foram modificadas por PEGlação com mPEG-p-nitrofenil carbonato (mPEG-pNP) e 2-O-mPEG-4,6-dicloro-s-triazina (mPEG-CN), produzindo conjugados com considerável atividade enzimática residual UC-r-mPEG-pNP (87%), UC-r-mPEG-CN (75%) e UC-b-mPEG-pNP (75%), UC-b-mPEG-CN (50%).Além disso, os conjugados obtidos com a UC-r e UC-b apresentaram valores de KM menores do que as enzimas nativas, indicando que a PEGlação conferiu uma interessante propriedade aos conjugados, que permitiu um aumento da afinidade da UC-r e UC-b pelo ácido úrico. O efeito do pH e da temperatura sobre a UC-r e UC-b modificadas indicou que os conjugados obtidos foram mais ativos em pH próximo ao fisiológico e mais estáveis do que a respectiva enzima nativa. As formas PEGladas da UC-r e UC-b foram mais resistentes à ação de diferentes proteases e mantiveram-se estáveis em soro humano, indicando que a PEGlação favoreceu a resistência a degradação proteolítica. Análises espectroscópicas de dicroísmo circular (CD) e infravermelho (FTIR) não apresentaram nenhuma diferença relevante entre a estrutura protéica da UC-r nativa e PEGlada. Estudos in vivo com coelho e camundongos Balb/c mostraram que a UC-r nativa induziu uma intensa resposta imune sendo altamente imunogênica. Por outro lado, a UC-r PEGlada quando injetada cronicamente em camundongos não induziu qualquer resposta detectável de anticorpos. Esses resultados indicam uma suficiente redução da imunogenicidade dessa enzima, devido à conjugação do mPEG-pNP ou mPEG-CN, tornando-a adequada para um possível uso terapêutico. Portanto, nesse trabalho, os resultados obtidos com a UC-r de Candida sp, mostram que dois conjugados apresentaram interessantes propriedades físico-química, biológicas e imunológicas, que permitiram um significativo avanço na transformação de uma enzima de origem fúngica em uma droga, com uma possível aplicação terapêutica no tratamento de hiperuricemia e gota. / PEGylation is a successful nanobiotechnology strategy that involves the covalent attachment of polyethylene glycol (PEG) to a drug to improve its pharmacokinetic, pharmacodynamic, and immunological profiles, and thus, enhance its therapeutic effect. Currently, PEGylation is used to modify proteins, peptides, oligonucleotides, antibody fragments, and small organic molecules. Uricase (EC 1.7.3.3, UC) is an enzyme belonging to the class of oxidorreductases responsible for the oxidation of uric acid, producing allantoin. This enzyme is found in many living organisms such as bacteria, yeasts, fungi, plants and animals. However, during the evolution of the species gene became inactive UC, therefore, in humans UC is inactive. Accordingly, UC has acquired prominence as a potential drug uricolytic due to the need of developing new therapeutic agents for the treatment of hyperuricemia and gout. In this study, purified recombinant uricase from Candida sp (UC-r) and ox kidney (UC-b) were modified by PEGylation with mPEG-p-nitrophenyl-carbonate (mPEG-pNP) and 2-O-mPEG-4,6-dichloro-s-triazine (mPEG-CN), producing conjugates with considerable residual enzyme activity UC-r-mPEG-pNP (87%), UC-r-mPEG-CN (75%) and UC-b-mPEG-pNP (75%),UC-b-mPEG-CN (50%). In addition, conjugates obtained with the UC-r and UC-b had lower KM values than native enzymes, indicating that the PEGylation gave an interesting property the conjugate that increased the affinity of UC-r and UC-b by uric acid. The effect of pH and temperature on the modified UC-r and UC-b indicated that the conjugates were more active at pH close to the physiological and more stable than its native enzyme. PEGylated forms of UC-r and UC-b were more resistant to the action of different proteases and remained stable in human serum, indicating that the PEGylation favored resistance to proteolytic degradation. Spectroscopic analysis of circular dichroism (CD) and infrared (FTIR) did not show any relevant difference in protein structure between native and PEGylated UC-r. In vivo studies with rabbit and Balb/c mice showed that UC-r native elicited an intense immune response being highly immunogenic. On the other hand, the PEGlated UC-r when chronically injected into mice did not induce any detectable response to antibodies. These results indicate a sufficient reduction of immunogenicity of this enzyme, due to conjugation of mPEG-pNP or mPEG-CN, making it suitable for possible therapeutic use. Therefore, the results obtained with the UC-r of Candida sp, showed that two conjugates have interesting physical-chemical, biological and immunological, which allowed a significant advance in the transformation of an enzyme of fungal origin in a drug with a possible application therapeutic in the treatment of hyperuricemia and gout.

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Bc. Gabriela Kocurová Supervisor: Prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc. Title of diploma thesis: Investigation of proteolytic enzymes expression in different tissues at the transgenic animal model of Huntington's disease by means of biochemical and immunohistochemical methods Background: Huntington's disease (HD) is a neurodegenerative disorder that is caused by an expansion of a polyglutamine (polyQ) domain in the huntingtin (Htt) protein. Because it is known that mutant Htt and especially its small proteolytic fragments are toxic to neurons (particularly those in the striatum and cortex), it has been suggested that proteolysis of mutant huntingtin (mHtt) might play an important role in HD pathogenesis. Therefore, the aim of the present study was to examine the expression of endogenous and mtHtt and possible participation of the proteolytic enzymes from the group of caspases, matrix metalloproteinases (MMPs), kallikreins (KLKs) and calpains in HD pathology of brain tissue. Methods: In this study we used WT and TgHD minipigs for N-terminal part of the human mtHtt (548aaHTT-145Q, both F2 generation, age 36 months; F3 generation, age 48 months in additional experiment), R6/2 mice were used as...

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The proteasome is responsible for breaking down the majority of the proteins in the cell. However, a complete understanding of how this large multi-subunit protease is assembled is currently lacking. Proper and timely assembly of the proteasome is critical for the functioning of the ubiquitin-proteasome pathway, defects in which have been associated with several different cancers. A recently discovered heterodimeric proteasome assembly chaperone, Pba1p-Pba2p, has been suggested to prevent the assembly process from straying off path. Pba1p-Pba2p associates with proteasomal assembly intermediates via C-terminal HbYX motifs. The HbYX motif is a tri-peptide sequence containing a hydrophobic residue (Hb) followed by a tyrosine (Y), then any amino acid (X). This motif was originally identified in proteasomal activators, and shown to mediate the association of activators with the proteasome by inserting into intersubunit pockets on either end of the proteasome. There are seven unique intersubunit binding pockets, located between neighboring α subunits on the proteasome, to which a HbYX-containing protein can bind; which of these pockets Pba1p-Pba2p binds to remains elusive. I attempted to identify where Pba1p and Pba2p bind via a crosslinking approach. Specific residues were mutagenized to cysteines on Pba1p, Pba2p, and the individual α subunits in order to generate crosslinkable species. By exposing yeast cells expressing these crosslinkable proteins to mild oxidizing conditions, I attempted to trap the Pba1p and Pba2p α intersubunit pocket interactions. In order to optimize crosslinking conditions, the assay was modified several ways. Additionally, measures were taken to increase detection of the crosslinked species via immunoblotting. Despite the efforts to improve the crosslinking and detection, I was unable to successfully detect a crosslinked species. However, crosslinking is a reasonable method to identify the Pba1p and Pba2p proteasomal binding sites, having been successfully used to identify binding sites for other HbYX-motif-containing proteins; further assay optimization should yield Pba1p and Pba2p proteasomal crosslinks.

Xylella fastidiosa é uma bactéria patogênica encontrada em várias plantas. Esta bactéria secreta proteases extracelulares detectadas em gel de eletroforese, sendo a gelatina usada como substrato co-polimerizado. Três principais bandas protéicas foram detectadas com massa molar (MM) de 122, 84 e 65 kDa produzidas pelo isolado de citros (X0) e duas bandas de aproximadamente 84 e 65 kDa de isolado de videira (9713). Estas bactérias produziram zonas de hidrólise em meio sólido contendo gelatina, caseína e hemoglobina. Os resultados usando a gelatina como substrato foram os melhores para a atividade das proteases. A atividade enzimática das proteases de X. fastidiosa de citros e videira foi completamente inibida por PMSF e parcialmente inibida por EDTA, podendo ser visualizado em gel de eletroforese nativo. A temperatura ótima de atividade protéica foi de 30oC e o pH ótimo de 7,0. Além das proteases secretadas por este fitopatógeno, quitinase e β-1,3-glucanase foram também detectadas no sobrenadante das culturas. Os resultados sugeriram que estas proteases produzidas pela X. fastidiosa de citros e videira pertencem ao grupo das serina e metalo proteases. / Xylella fastidiosa is a pathogenic bacterium found in several plants. These bacteria secrete extracellular proteases into the culture broth as visualized in sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide activity gels containing gelatin as a co-polymerized substrate. Three major protein bands were produced by strain X0 (citrus) with molar masses (MM) of 122, 84 and 65 kDa. Grape strain 9713 produced two bands of approximately 84 and 64 kDa. These organisms produced zones of hydrolysis in agar plates amended with gelatin, casein and hemoglobin. Gelatin was the best substrate for these proteases. SDS-PAGE activity gel indicated that the protease activities of X. fastidiosa from citrus and grape were completely inhibited by PMSF and partially inhibited by EDTA. The optimal temperature for protease activity was 30oC with an optimal pH of 7.0. Among the proteolytic enzymes secreted by the phytopathogen, chitinase and β-1,3-glucanase activities were also detected in cultures of X. fastidiosa (citrus). From these results, it is suggested that these proteases produced by strains of X. fastidiosa from citrus and grape, belong to the serine- and metallo-protease group.

A produção de proteases e biossurfactantes por Bacillus licheniformis UCP-1014 foi investigada neste trabalho. Os experimentos foram realizados em frascos de Erlenmeyer de 125 mL, em triplicata, inóculo 10% v/v, a 150 rpm e 37C. Um planejamento fatorial foi realizado para investigar as concentrações dos componentes do meio de cultivo. Amostras de líquido metabólico foram coletadas, centrifugadas e os sobrenadantes utilizados para determinar pH, atividade proteolítica e tensão superficial. O líquido metabólico foi concentrado por ultrafiltração e a estabilidade da atividade proteolítica no retentado foi determinada quanto ao pH e à temperatura. A estabilidade do retentado foi investigada por planejamento fatorial e a atividade proteolítica determinada com 10, 20 e 30 dias de armazenamento a 28 C. A determinação de proteases foi realizada na presença de azo-caseína. A cultura de B. licheniformis UCP-1014 produziu 112 U/mL de proteases na presença de melaço 1% e uréia 0,5%, a pH 7,5 com 24 h de cultivo. A redução da tensão superficial do líquido metabólico não foi significativa nessas condições de trabalho. O líquido metabólico concentrado reteve cerca de 50% da atividade proteolítica inicial. O concentrado de proteases apresentou a maior atividade enzimática em pH 8 durante 30 min de incubação, retendo 97 % da atividade; a estabilidade térmica máxima foi a 50C durante 30 min, retendo 98 % da atividade enzimática. O retentado do líquido metabólico após formulado manteve 54 % da atividade com 30 dias de armazenamento a 28C. Proteases produzidas por B. licheniformis UCP-1014 na presença de nutrientes de baixo custo podem ser competitivas no mercado / The production of protease and biosurfactant by Bacillus licheniformis UCP-1014 was investigated in this work. The experiments were performed in Erlenmeyer flasks, in triplicate, and inoculum 10% v/v, 150 rpm and 37C. A factorial design was conducted to investigate the concentrations of the medium. Metabolic fluid samples were collected, centrifuged and the supernatant used to determine pH, proteolytic activity and surface tension. The liquid was concentrated by ultrafiltration metabolic the stability and proteolytic activity in the retentate was determined for pH and temperature. In making the retentate was used a factorial design, and protease stability was determined during 10, 20 and 30 days at 28C. The determination of protease was performed in the presence of azo-casein. The culture of B.licheniformis UCP-1014 produced 112 U/mL protease in the presence of 1% molasses and urea 0,5%, pH 7,5 at 24h of culture. The reduction in surface tension was not significant in these metabolic conditions. The concentration of proteases produced by B. licheniformis UCP-1014 had the highest stability of enzyme activity in the absence of substrate at pH 7 during 60 min of incubation and maximum thermal stability between 40 90C for 90 min. The liquid concentrate and formulated metabolic retained about 50% of proteolytic activity whose value decreased during storage at 28C. Proteases produced by B. licheniformis UCP-1014 in the presence of nutrients of low cost can be competitive in the market

O reaproveitamento de resíduos agroindustriais como fontes de carbono e de nitrogênio tem sido investigado na área de biotecnologia para produção de enzimas por micro-organismos. Dentre as enzimas microbianas importadas no Brasil, as proteases são aplicadas no processamento tecnológico de detergentes, fármacos, cosméticos, alimentos, dentre outros. O objetivo deste trabalho foi produzir proteases por cultivo submerso utilizando resíduos agroindustriais. A determinação da atividade proteolítica ocorreu na presença de azocaseína a 0,2 %. Cultivos submersos de culturas isoladas de Bacillus sp. foram realizados em frascos de Erlermeyer. A atividade máxima de proteases foi determinada na presença de milhocina. A concentração do líquido metabólico com atividade proteolítica por ultrafiltração reteve cerca de 80 % da atividade inicial. Um planejamento experimental fatorial foi realizado para investigar a estabilidade do líquido metabólico. A maior atividade proteolítica média do líquido metabólico livre de células (196 U/mL) foi determinada na presença de sorbato de sódio a 0,5 %, cloreto de cálcio a 0,5 %, glicerol a 7,5 % e polietilenoglicol-200 a 0,5 %. O extrato enzimático formulado reteve 68 % da atividade proteolítica com 10 dias de armazenamento à temperatura ambiente (28 ˚C). O retentado com atividade proteolítica apresentou pH ótimo 9 e 11 e retenção de 90 - 100 % da atividade durante 90 min em pH ótimo; a temperatura ótima foi 50 ˚C e a estabilidade térmica máxima a 40 ˚C durante 30 min a pH 11. A formulação de líquido metabólico concentrado com atividade proteolítica que apresenta estabilidade térmica em pH alcalino é um bioproduto que pode ser utilizado como aditivo em detergentes. / The reuse of agro-industrial waste as sources of carbon and nitrogen has been investigated in biotechnology for the production of enzymes by microorganisms. Among the microbial enzymes imported into Brazil, the proteases are applied in technological processes in the fields of detergents, pharmaceuticals, cosmetics, food, among others. The aim of this work was to produce proteases by submerged cultivation in the presence of agro-industrial waste. The determination of proteolytic activity was in the presence of 0.2 % azocasein. Submerged cultivation of Bacillus sp. strains isolated were carried out in Erlermeyer flasks. The maximum protease activity was determined in the presence of corn steep liquor. The concentration of the liquid metabolic by ultrafiltration of the metabolic liquid with proteolytic activity retained 80% of the activity. A factorial experimental design was carried out to investigate the stability of the metabolic liquid. The maximum proteolitic activity of the liquid metabolic cell-free (196 U/mL) was determined in the presence of 0.5 % sodium sorbate, 0.5 % calcium chloride, and 7.5 % of glycerol and polyethyleneglycol-200. The enzyme extract formulated retained 68 % of the proteolytic activity after 10 days at storage at room temperature (28 ˚C). The retentate with proteolytic activity showed optimum pH 9 and 11 and retention 90 - 100 % of the activity for 90 min at optimum pH; the optimum temperature was 50 ˚C e the maximum thermal stability was at 40 ˚C for 30 min at pH 11. The formulation of metabolic liquid concentrate with proteolytic activity which has thermal stability at alkaline pH is a bioproduct which can be used as an additive in detergents.

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Luiz Juliano Neto / Banca: João Ruggiero Neto / Resumo: Fungos termofílicos têm despertado grande interesse acadêmico e industrial por produzirem uma variedade de enzimas termoestáveis com potenciais aplicações em processos biotecnológicos como biocatálise nas indústrias de couro, farmacêutica, têxtil e alimentícia, e na preparação de produtos de limpeza e cosméticos. Particularmente, as proteases, além de participarem de inúmeros processos fisiológicos vitais como vias metabólicas, hemostasia e sinalização celular, também representam hoje cerca de 60% do mercado mundial de enzimas. Neste trabalho, descrevemos a produção, purificação e caracterização bioquímica de uma serino-protease produzida por um fungo termofílico do gênero Myceliophthora. As taxas de atividade proteolítica foram avaliadas através de fermentação em meio sólido (FES) e submerso (FSM) e observou-se um rendimento na atividade proteolítica 4,5 vezes maior para o meio sólido. A enzima bruta obtida por ambos os procedimentos (FES e FSM) exibiu a mesma temperatura ótima de 50 ºC, porém em relação ao pH ótimo houve um deslocamento de 7 (FSM) para 9 (FES) sugerindo que o perfil enzimático do fungo difere de acordo com suas condições de fermentação. Baseado nesses resultados prosseguiu-se os estudos com o extrato bruto obtido por FES. A imobilização da enzima bruta em esferas de alginato de cálcio resultou no aumento da temperatura ótima e na estabilidade térmica quando comparado com a enzima livre. O extrato bruto obtido por FES foi, então, fracionado por métodos cromatográficos como exclusão molecular e troca-iônica que resultaram na protease pura com peso molecular de 28,2 kDa determinado por espectrometria de massa. A protease pura demonstrou pH ótimo de 9,0 e temperatura ótima de 45 °C que corroboram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Thermophilic fungi have attracted great academic and industrial interest because they produce a variety of thermostable enzymes with potential applications in biotechnological processes such as biocatalysis in the industries of leather, pharmaceutical, textile and food, and the preparation of detergents and cosmetics. In particular, proteases not only participate in many vital physiological processes such as metabolic pathways, cell signaling and homeostasis, but also currently represent about 60% of the world market of enzymes. In this work, we describe the production, purification and biochemical characterization of a serine protease produced by a thermophilic fungus of the genus Myceliophthora. The levels of proteolytic activity were evaluated either by solid fermentation (SSF) and submerged (SmF). The crude enzyme obtained by both procedures (SSF and SmF) exhibited similar optimum temperature of around 50 ºC, but in relation to the optimum pH was shifted of 7 (SmF) to 9 (SSF), suggesting that the enzymatic profile of the fungus differs from according to its fermentation conditions. Based on these results, the studies were followed with crude extract obtained by SSF. The immobilized enzyme on beads of calcium alginate resulted in increased optimum temperature and thermal stability when compared to the free enzyme. The crude extract obtained by SSF was then fractionated by chromatographic methods including molecular exclusion and ion-exchange that resulted in the pure protease with molecular weight of 28.2 kDa as determined by mass spectrometry. The pure protease showed optimum pH of 9.0 and optimum temperature of 45 °C that corroborate to the preliminary characterization of the crude extract. Inhibition tests resulted in complete inhibition by PMSF, a canonical... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:36:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MarinoEAN_TESE.pdf: 1510121 bytes, checksum: 824b52d7ab71a45fa42ff2c16c22da7c (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Shrimp farming in Brazil is a consolidated activity, having brought economical and social gains to several states with the largest production concentrated in the northeast. This fact is also reflected in higher feed intake, necessitating a more efficient feed management. Currently, management techniques already foresee food loss due to molting. In this sense, studies relating shrimp s digestive physiology, molting physiology and behavioral response of shrimp feed can optimize the feed management. Thus, our study aimed to evaluate the behavioral response of the marine shrimp L. vannamei (Crustacea: Penaeidae) in accordance with the stages of moulting cycle and feeding schedules based on higher or lower activity of proteolytic digestive enzymes; also, to investigate the influence of feeding schedule on hepatosomatic index and non-specific and specific protease activity (trypsin). Experiments were carried out at the Laboratory of Shrimp Behavioral Studies at UFRN in partnership with the Laboratory of Enzimology UFPE. Juveniles of L. vannamei weighting 5.25 g (+ 0.25 g) were kept in aquaria at a density of 33 shrimp m -2. In the first experiment, shrimp were fed in the light phase or in the dark phase for 8 days; in the ninth day, the animals were observed for 15 minutes every hour during the 12 hours of each phase of the photoperiod. We recorded the frequency of inactivity, exploration, food intake, burrowing, swimming and crawling behavior. At the end of the 12th observation session, the shrimp were sacrified and classified by the method of setogenesis in the molt cycle stages A, B, C, D0, D1, D2 or D3. We found that the shrimp in A stage show high levels of inactivity. Moreover, the frequency of food intake was very low. The shrimp in D3 stage also had low food intake and high inactivity associated with elevated frequencies of burrowing. In the second experiment, shrimp were kept in physiological acclimation to experimental conditions for 28 days, distributed in 12 treatments in the light phase and 12 treatments in the dark phase. In the end, the animals were sacrified and dissected to assess non-specific and specific protease activity (trypsin) activity. In general, these parameters did not vary among animals fed in the light phase and those fed in the dark phase. However, significant differences were found in the activity of specific and nonspecific proteases in relation to food treatment. In the light phase, the major proteolytic activities converged to 10 hours after the start of the light phase, while the lowest activities converged to 6 hours after the beginning of this phase. In the dark phase, the highest enzyme activity converged to 12 hours after the onset of phase, while the lowest activities converged to 3 hours after the onset of phase. In the third experiment, we sought to evaluate the behavioral responses of shrimp in relation to dietary treatments based on higher or lower activity of proteolytic enzymes, considering the results of the second experiment. The behavioral categories observed were the same as the ones in the first experiment, with observations of 30 minutes (15min before and 15min after food supply). We found variation in behavioral responses as a function of the treatments, with greater intake of food in shrimp fed during the period of greatest activity of proteolytic enzymes, in the light phase. Thus we see that periodic events associated with the shrimp s physiology interfere in their behavioral responses, revealing situations that are more adjustable to the provision of food, and consequently optimizing feeding management / A carcinicultura brasileira ? uma atividade consolidada, pois trouxe ganhos econ?micos e sociais a v?rios estados, com a maior produ??o e ?rea cultivada localizada na regi?o nordeste. Esse fato tamb?m se reflete no maior consumo de ra??o, tornando necess?rio um manejo alimentar mais eficiente. Atualmente, as t?cnicas de manejo j? prev?em sobra alimentar em decorr?ncia dos processos de muda. Nesse sentido, estudos relacionando fisiologia digestiva, fisiologia da muda e resposta comportamental do camar?o podem otimizar o manejo alimentar. Assim, nosso trabalho teve o objetivo de avaliar a resposta comportamental do camar?o marinho L. vannamei (Crustacea: Penaeidae) de acordo com os est?gios do ciclo de muda e com a alimenta??o baseada em hor?rios de maior ou de menor atividade de enzimas digestivas proteol?ticas, bem como investigar a influ?ncia do hor?rio de alimenta??o sobre o ?ndice hepatossom?tico, atividade de protease espec?fica (tripsina) e n?o espec?fica. Para tanto, foram realizados tr?s experimentos no Laborat?rio de Estudos do Comportamento de Camar?es Departamento de Fisiologia da UFRN, em parceria com o Laborat?rio de Enzimologia Departamento de Bioqu?mica da UFPE. Juvenis de L. vannamei pesando 5,25 g (+ 0,25 g), foram mantidos em aqu?rios a uma densidade de 33 camar?es m-2. No primeiro experimento, os camar?es foram alimentados na fase de claro ou na fase de escuro durante 8 dias; no nono dia, os animais foram observados por 15 minutos a cada hora, durante as 12 horas de cada fase do fotoper?odo, sendo registradas as freq??ncias de ocorr?ncia dos comportamentos parado, explora??o, ingest?o de alimento, enterramento, nata??o e rastejamento. Ao final da 12? sess?o de observa??o, foram sacrificados e classificados pelo m?todo da setog?nese, nos est?gios do ciclo de muda A, B, C, D0, D1, D2 ou D3. Como resultado, encontramos que os camar?es em est?gio A apresentam elevada frequencia do comportamento parado. Por outro lado, a freq??ncia de ingest?o de alimento foi muito baixa. Os camar?es em est?gio D3 tamb?m apresentaram baixa ingest?o de alimento e elevada inatividade, associada a elevadas freq??ncias de enterramento. No segundo experimento, os camar?es foram mantidos em aclimata??o fisiol?gica ?s condi??es experimentais por 28 dias, distribu?dos em 12 tratamentos na fase de claro e 12 tratamentos na fase de escuro. Ao final, os animais foram sacrificados e dissecados para avalia??o da atividade de protease espec?fica (tripsina) e atividade de protease n?o espec?fica. De modo geral, esses par?metros n?o variaram entre os animais alimentados na fase de claro e aqueles alimentados na fase de escuro. No entanto, percebemos diferen?as significativas na atividade das proteases espec?fica e n?o espec?fica em rela??o ao tratamento alimentar. Na fase de claro, as maiores atividades proteol?ticas convergiam para a 10? hora ap?s o in?cio da fase de claro, enquanto as menores atividades convergiram para a 6? hora ap?s o in?cio dessa fase. Na fase de escuro, as maiores atividades dessas enzimas convergiram para a 12? hora ap?s o in?cio da fase, enquanto as menores atividades convergiram para a 3? hora ap?s o in?cio da fase. No terceiro experimento, buscamos avaliar as respostas comportamentais dos camar?es a tratamentos alimentares baseados na maior ou menor atividade de enzimas proteol?ticas, considerando os resultados do segundo experimento. As categorias comportamentais observadas foram ?s mesmas do primeiro experimento, com observa??es de 30 minutos (15min antes e 15min depois da oferta alimentar). Encontramos uma varia??o na resposta comportamental em fun??o dos tratamentos, com maior ingest?o de alimento nos camar?es alimentados no hor?rio de maior atividade de enzimas proteol?ticas, da fase de claro. Assim, percebemos que eventos peri?dicos associados ? fisiologia dos camar?es interferem em suas respostas comportamentais, revelando situa??es mais prop?cias ? oferta de alimento, capazes de otimizar o manejo alimentar

Xylella fastidiosa é uma bactéria patogênica encontrada em várias plantas. Esta bactéria secreta proteases extracelulares detectadas em gel de eletroforese, sendo a gelatina usada como substrato co-polimerizado. Três principais bandas protéicas foram detectadas com massa molar (MM) de 122, 84 e 65 kDa produzidas pelo isolado de citros (X0) e duas bandas de aproximadamente 84 e 65 kDa de isolado de videira (9713). Estas bactérias produziram zonas de hidrólise em meio sólido contendo gelatina, caseína e hemoglobina. Os resultados usando a gelatina como substrato foram os melhores para a atividade das proteases. A atividade enzimática das proteases de X. fastidiosa de citros e videira foi completamente inibida por PMSF e parcialmente inibida por EDTA, podendo ser visualizado em gel de eletroforese nativo. A temperatura ótima de atividade protéica foi de 30oC e o pH ótimo de 7,0. Além das proteases secretadas por este fitopatógeno, quitinase e β-1,3-glucanase foram também detectadas no sobrenadante das culturas. Os resultados sugeriram que estas proteases produzidas pela X. fastidiosa de citros e videira pertencem ao grupo das serina e metalo proteases. / Xylella fastidiosa is a pathogenic bacterium found in several plants. These bacteria secrete extracellular proteases into the culture broth as visualized in sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide activity gels containing gelatin as a co-polymerized substrate. Three major protein bands were produced by strain X0 (citrus) with molar masses (MM) of 122, 84 and 65 kDa. Grape strain 9713 produced two bands of approximately 84 and 64 kDa. These organisms produced zones of hydrolysis in agar plates amended with gelatin, casein and hemoglobin. Gelatin was the best substrate for these proteases. SDS-PAGE activity gel indicated that the protease activities of X. fastidiosa from citrus and grape were completely inhibited by PMSF and partially inhibited by EDTA. The optimal temperature for protease activity was 30oC with an optimal pH of 7.0. Among the proteolytic enzymes secreted by the phytopathogen, chitinase and β-1,3-glucanase activities were also detected in cultures of X. fastidiosa (citrus). From these results, it is suggested that these proteases produced by strains of X. fastidiosa from citrus and grape, belong to the serine- and metallo-protease group.

Made available in DSpace on 2017-06-01T18:20:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertaca-_marcelo_silva.pdf: 974611 bytes, checksum: 8bf2b65106d8d1d7d04ec3c0dd5827f6 (MD5) Previous issue date: 2011-03-17 / The production of protease and biosurfactant by Bacillus licheniformis UCP-1014 was investigated in this work. The experiments were performed in Erlenmeyer flasks, in triplicate, and inoculum 10% v/v, 150 rpm and 37ºC. A factorial design was conducted to investigate the concentrations of the medium. Metabolic fluid samples were collected, centrifuged and the supernatant used to determine pH, proteolytic activity and surface tension. The liquid was concentrated by ultrafiltration metabolic the stability and proteolytic activity in the retentate was determined for pH and temperature. In making the retentate was used a factorial design, and protease stability was determined during 10, 20 and 30 days at 28ºC. The determination of protease was performed in the presence of azo-casein. The culture of B.licheniformis UCP-1014 produced 112 U/mL protease in the presence of 1% molasses and urea 0,5%, pH 7,5 at 24h of culture. The reduction in surface tension was not significant in these metabolic conditions. The concentration of proteases produced by B. licheniformis UCP-1014 had the highest stability of enzyme activity in the absence of substrate at pH 7 during 60 min of incubation and maximum thermal stability between 40 90ºC for 90 min. The liquid concentrate and formulated metabolic retained about 50% of proteolytic activity whose value decreased during storage at 28ºC. Proteases produced by B. licheniformis UCP-1014 in the presence of nutrients of low cost can be competitive in the market / A produção de proteases e biossurfactantes por Bacillus licheniformis UCP-1014 foi investigada neste trabalho. Os experimentos foram realizados em frascos de Erlenmeyer de 125 mL, em triplicata, inóculo 10% v/v, a 150 rpm e 37ºC. Um planejamento fatorial foi realizado para investigar as concentrações dos componentes do meio de cultivo. Amostras de líquido metabólico foram coletadas, centrifugadas e os sobrenadantes utilizados para determinar pH, atividade proteolítica e tensão superficial. O líquido metabólico foi concentrado por ultrafiltração e a estabilidade da atividade proteolítica no retentado foi determinada quanto ao pH e à temperatura. A estabilidade do retentado foi investigada por planejamento fatorial e a atividade proteolítica determinada com 10, 20 e 30 dias de armazenamento a 28 ºC. A determinação de proteases foi realizada na presença de azo-caseína. A cultura de B. licheniformis UCP-1014 produziu 112 U/mL de proteases na presença de melaço 1% e uréia 0,5%, a pH 7,5 com 24 h de cultivo. A redução da tensão superficial do líquido metabólico não foi significativa nessas condições de trabalho. O líquido metabólico concentrado reteve cerca de 50% da atividade proteolítica inicial. O concentrado de proteases apresentou a maior atividade enzimática em pH 8 durante 30 min de incubação, retendo 97 % da atividade; a estabilidade térmica máxima foi a 50ºC durante 30 min, retendo 98 % da atividade enzimática. O retentado do líquido metabólico após formulado manteve 54 % da atividade com 30 dias de armazenamento a 28ºC. Proteases produzidas por B. licheniformis UCP-1014 na presença de nutrientes de baixo custo podem ser competitivas no mercado