Foram avaliados 528 isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa de 131 pacientes fibrocísticos atendidos em um centro de referência em fibrose cística (FC) durante o período de 2005 a 2008. 135 isolados clínicos (25,6%) apresentaram subpopulação hipermutante (isolados com altas taxas de mutações) utilizando teste modificado de suscetibilidade aos antimicrobianos. Destes, 9 isolados (6,7%) de 7 pacientes foram classificados como hipermutantes (HPM) segundo estimativa da freqüência de mutação. Após seqüenciamento do gene mutS e análise de mutações relacionadas à inativação do sistema de reparo de erros no pareamento do DNA (Mismatch Repair System - MRS), foi possível observar este tipo de mutação em 5 isolados HPM de 4 pacientes. Avaliamos a formação de biofilme em 45 isolados NHPM, 9 HPM e suas respectivas subpopulações por duas metodologias. Segundo o primeiro método, 24 (53,3%) e 3 (21,4%) isolados NHPM e HPM, respectivamente, foram classificados como não-formadores de biofilme. Pelo segundo método, apenas 4 (8,9%) isolados NHPM e nenhum isolado HPM foram classificados nessa categoria. Os percentuais de resistência aos antibióticos ceftazidima, ciprofloxacino e tobramicina em condições de biofilme foram mais elevados que aqueles obtidos em crescimento plantônico e, em ambas as condições, foi possível evidenciar forte associação entre hipermutabilidade e aumento de resistência antibiótica. A associação dos macrolídeos azitromicina e claritromicina, em concentrações sub-inibidoras, com os antibióticos anti-pseudomonas, demonstrou ação inibitória sobre isolados clínicos de P. aeruginosa em condições de biofilme, o que sugere sua indicação no tratamento de infecções por P. aeruginosa pela sua ação anti-biofilme. / We evaluated 528 clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in 131 CF patients attended at a referral center for cystic fibrosis (CF) during the period of 2005 to 2008. 135 clinical isolates (25.6%) presented hypermutable subpopulation (isolates with high mutation rates) using a modified antimicrobial susceptibility method. Of these, 9 isolates (6.7%) of 7 patients were classified as hypermutable (HPM) according to the estimate of mutation frequency. After gene sequencing and analysis of mutS mutations related to inactivation of the repair system errors in DNA pairing (Mismatch Repair System - MRS), we observed this type of mutation in 5 HPM isolates of 4 patients. We evaluated the biofilm formation in 45 isolates NHPM, 9 HPM and their subpopulations by two methods. According the first method, 24 (53.3%) and 3 (21.4%) isolates NHPM and HPM, respectively, were classified as non-biofilm formers. According the second method, only 4 (8.9%) isolates NHPM and none HPM were classified in this category. The percentages of resistance to antibiotics ceftazidime, ciprofloxacin and tobramycin in conditions of biofilm were higher than those obtained in planktonic growth, and in both conditions, it was observed a strong association between hypermutability and increased antibiotic resistance. The association of macrolides azithromycin and clarithromycin, in sub-inhibitory concentrations, with anti-pseudomonas antibiotics, has shown inhibitory activity on clinical isolates of P. aeruginosa in biofilm conditions, which should be recommended for treatment of CF P. aeruginosa infections due to its anti-biofilm action.

Opções terapêuticas para tratar infecções por Pseudomonas aeruginosa são limitadas por seus diversos mecanismos de resistência, que podem ou não ser detectados no laboratório clínico. Um fenótipo observado na rotina laboratorial é o surgimento de subpopulações resistentes a partir de uma população sensível aos antimicrobianos – heteroresistência. Em P. aeruginosa esse fenômeno já foi investigado para carbapenêmicos, porém, em relação à polimixina B, não há dados literários. Objetivamos avaliar a heteroresistência à polimixina B em dois grupos de P. aeruginosa, um sensível e outro resistente aos carbapenêmicos. Cento e vinte e quatro isolados de P. aeruginosa foram obtidos, aleatoriamente, no Hospital de Clínicas de Porto Alegre em 2011. O perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, disco difusão e microdiluição em caldo – CIM (determinação da concentração inibitória mínima) para polimixina B, foi realizada conforme o Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) 2011. Isolados resistentes aos carbapenêmicos foram avaliados para CIM dos carbapenêmicos e cefalosporinas, e para pesquisa fenotípica e genotípica de metalo-β-lactamase (MβL). Um total de 24/124 isolados foi separado em dois grupos, um sensível (grupo S) e outro resistente (grupo R) aos carbapenêmicos (imipenem e/ou meropenem) para investigação da heteroresistência a polimixina B. Realizou-se ensaio de heteroresistência em duplicata através de diluições seriadas, partindo de uma suspensão de 0,5 de MacFarland e inoculadas em Agar Mueller Hinton com concentrações crescentes de polimixina B (0; 0,5; 1; 2; 4 e 8μg/mL). Após 5 dias de passagem em meio sem antibiótico, foi determinada a CIM dos isolados que cresceram na concentração mais alta de polimixina B. O perfil de análise populacional (PAP) foi definido pela razão do número de unidades formadoras de colônia (UFC) da placa com maior concentração de polimixina B onde houve crescimento bacteriano, pelo número de UFC da placa sem antibiótico. Foram consideradas heteroresistentes amostras que apresentaram subpopulações com crescimento em concentração de polimixina B ≥ 2 μg/mL. Amostras com subpopulações com crescimento em concentração de polimixina B superiores duas vezes ao CIM original, mas < 2 μg/mL, foram classificadas como heterogêneas. O resultado do disco difusão indicou heterogeneidade de suscetibilidade, sendo que gentamicina e imipenem foram os antibióticos com maior percentual de resistência e aztreonam e ciprofloxacino apresentaram os maiores perfis de sensibilidade. Todos os isolados foram sensíveis à polimixina B, com CIM50 e CIM90 de 1μg/mL e 2μg/mL, respectivamente. Trinta e sete isolados (30%; 37/124) apresentaram resistência aos carbapenêmicos. Quatro amostras foram positivas para MβL no teste fenotípico, sendo que o gene blaIMP foi idenficado nestas amostras. O grupo S não apresentou subpopulação heteroresistente, porém 3 isolados apresentaram subpopulação heterogênea. A freqüência do PAP no grupo S variou entre 2,1x10-4 a 4,0x10-7. O grupo R apresentou uma amostra heteroresistente e 6 isolados apresentaram subpopulação heterogênea, a freqüência do PAP variou entre 2,6x10-4 a 2,0x10-7. Os resultados deste estudo indicam baixa ocorrência de heteroresistência à polimixina B em amostras de P. aeruginosa tanto resistentes quanto sensíveis aos carbapenêmicos. No entanto, diversas amostras apresentaram subpopulações heterogêneas (CIM aumentada para a polimixina B), o que poderia explicar eventuais falhas terapêuticas durante o tratamento. / Therapeutic options to treat infections caused by Pseudomonas aeruginosa are limited because of their different resistance mechanisms that can be or don't be detected in the clinical laboratory. A phenotype that has been observed in our laboratory is the emergence of resistant subpopulations from a population sensitive to antibiotics - a phenomenon named heteroresistance. In P. aeruginosa this phenomenon has been investigated for carbapenems, however, in relation to the polymyxin B no data in the literature. We investigate the heteroresistance and polymyxin B into two groups P. aeruginosa, one sensitive and second resistant to carbapenems. One hundred twenty-four strains of P. aeruginosa were obtained randomly at the Hospital de Clinicas de Porto Alegre in 2011. The Antimicrobial Susceptibility Testing (Disk-difusion and the microdiluition broth, with determination of minimum inhibitory concentration (MIC) for polymyxin B, was performed according the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), 2011. Isolates resistant to carbapenems were evaluated for MIC of carbapenems and cephalosporins, also for phenotypic and genotypic metallo-β-lactamase (MβL). A total of 24/124 strains were separated in two groups, one sensitive (S group) and other resistant (R group) to carbapenems (imipenem and / or meropenem) for investigation of heteroresistance polymyxin B. The assay was performed in duplicate heteroresistance through serial dilutions, starting from a 0.5 MacFarland suspension and inoculated into Mueller Hinton Agar with increasing concentrations of polymyxin B (0; 0,5; 1; 2; 4 e 8μg/mL). After 5 days of passage in medium without antibiotics, was determined the MIC of the isolates that grew at the highest concentration of polymyxin B. The population analysis profile (PAP) was defined as the ratio of the number of colony forming units (CFU) on the card with the highest concentration of polymyxin B in which bacterial growth, the number of CFU plate without antibiotic. We considered heteroresistant samples that showed subpopulations with growth in concentration of polymyxin B ≥ 2 mg / mL. Samples with subpopulations growing at higher concentration of polymyxin B twice CIM original, but <2 mg / mL were classified as heterogeneous. The result of AST indicated heterogeneity of susceptibility, and gentamicin and imipenem were the highest percentage with antibiotic resistance and aztreonam and norfloxacin showed the highest sensitivity profiles. All isolates were susceptible to polymyxin B, with CIM50 and CIM90 of 1μg/mL and 2μg/mL, respectively. Thirty-seven isolates (30%; 37/124) were resistant to carbapenems. Four samples were positive for the phenotypic test to MβL and the blaIMP gene was indentificated in this samples. The S group showed no subpopulation heteroresistente, but 3 isolates showed heterogeneous subpopulation. The frequency of PAP in group S varied between 2,0x10-4 to 4,0x10-7. The group R provided a sample heteroresistant and 6 isolates showed heterogeneous subpopulation, the frequency of PAP varied between 2,6x10- 4 a 2,0x10-7. The results of this study indicate a low occurrence of heteroresistance to polymyxin B in samples of P. aeruginosa so resistant assensitive to carbapenems. However, several samples showed heterogeneous subpopulations (MIC increased to polymyxin B) which could explain possible treatment failure during treatment.

Base teórica: Devido à diminuição do desenvolvimento de novos antimicrobianos nas últimas décadas, terapias combinadas têm sido empregadas contra bactérias multirresistentes como opção à monoterapia no tratamento de infecções graves. Para tratar infecções causadas por Peusdomonas aeruginosa resistente a carbapenêmicos, amicacina e polimixina B têm sido utilizadas em associações com imipenem, pois possuem diferentes mecanismos de ação, o que, teoricamente, indicaria a possibilidade de efeito sinérgico. Objetivo: O objetivo deste trabalho foi verificar a interação, in vitro, de amicacina e polimixina B em associação com imipenem frente a diferentes isolados de P. aeruginosa resistentes a carbapenêmico. Métodos: Foram selecionados isolados de P. aeruginosa resistentes a carbapenêmico oriundos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, coletados no período de janeiro a março de 2015. Foi realizada eletroforese em gel de campo pulsado e detecção do gene blaSPM-1 para selecionar diferentes clones. Seis isolados (três SPM-1 positivos e três negativos para a carbapenemase) foram selecionados para realização da técnica de time-kill, a fim de avaliar a atividade antimicrobiana das combinações de imipenem com amicacina e imipenem com polimixina B. Resultados: Sinergismo ocorreu para combinações de imipenem com amicacina em 3 isolados, dos quais um era SPM-1 positivo e dois eram SPM-1 negativos e todos apresentaram CIMs relativamente baixas a intermediárias. Quanto às combinações de imipenem com polimixina B, houve sinergismo somente para dois isolados, um SPM-1 positivo e um SPM-1 negativo, contudo houve antagonismo em 5 isolados, dois SPM-1 positivos e três SPM-1 negativos. Para 4 isolados, as combinações de imipenem com amicacina tiveram atividade bactericida, enquanto, para todos os isolados, as combinações de imipenem com polimixina B, bem como polimixina B isoladamente, 1x e 2x a CIM apresentaram atividade bactericida. Conclusão: Sinergismo pode ocorrer, para combinações de imipenem mais amicacina, quando os isolados apresentam CIMs relativamente baixas ou intermediárias para imipenem (≤16 μg/mL a 128 μg/mL) e amicacina (≤32 μg/mL). Entretanto, antagonismo aconteceu independentemente de valores altos ou baixos de concentrações inibitórias mínimas para imipenem e polimixina B. Além disso, a presença ou ausência do gene blaSPM-1 não pareceu influenciar nos resultados. / Background: Due to a decrease on new antibiotic development over the last decades, combined therapies have been employed against multigrug-resistant bacteria as an option to monotherapy in severe infection treatment. In order to treat infections caused by carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa, amikacin and polymyxin B have been used in associations with imipenem, because they possess different mechanisms of action, which could, theoretically, indicate the possibility of synergistic effect. Objective: The aim of this study was to verify the interaction, in vitro, of amikacin and polymyxin B in association with imipenem against various carbapenem resistant P. aeruginosa isolates. Methods: Carbapenem resistant P. aeruginosa isolates have been selected from Hospital de Clínicas de Porto Alegre, collected from January to March 2015. Pulsed field gel electrophoresis and detection of blaSPM-1 gene has been performed to select different clones. Six isolates (three SPM-1 positive and three negative for the carbapenemase) were selected for time-kill assay, in order to assess antimicrobial activity of imipenem plus amikacin and imipenem plus polymyxin B combinations. Results: Synergism occurred for combinations of imipenem plus amikacin in three isolates, from which one was SPM-1 positive and two were SPM-1 negative, and all presented relatively low to intermediate minimum inhibitory concentrations. About imipenem plus polymyxin B combinations, synergism occurred in only two isolates, one SPM-1 positive and one SPM-1 negative, however antagonism occurred in five isolates, two SPM-1 positive and three SPM-1 negative. For 4 isolates, imipenem plus amikacin combinations had bactericidal effect, while, for all isolates, combinations of imipenem plus 1x and 2x the MIC of polymyxin B presented bactericidal activity. Conclusions: Synergism can occur, for imipenem plus amikacin combinations, when isolates present relatively low or intermediate MIC of imipenem (≤16 μg/mL to 128 μg/mL) and amikacin (≤32 μg/mL). However, antagonism happened regardless high or low minimum inhibitory concentrations for imipenem and polymyxin B. Also, the presence or absence of blaSPM-1 gene did not seem to influence the results.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A infecção pulmonar é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes com Fibrose Cística (FC). O prognóstico destes pacientes é influenciado pelo número de exacerbações anuais e a carga microbiana nas secreções respiratórias. Pseudomonas aeruginosa é o principal patógeno, tanto em importância quanto em prevalência. Recentemente, foi demonstrada a ocorrência de cepas de P. aeruginosa altamente transmissíveis em centros de atendimento a pacientes com FC. A persistência de P. aeruginosa no pulmão de pacientes com FC está associada, em parte, à presença de cepas com hipermutabilidade (HPM), um fenômeno decorrente, principalmente, de defeitos em genes envolvidos no sistema de reparo do DNA. Tivemos como objetivo investigar a ocorrência de cepas HPM em P. aeruginosa, associadas às infecções pulmonares crônicas em pacientes com FC, bem como, avaliar a associação entre HPM, resistência a antimicrobianos e expressão de fatores de virulência. Das 179 amostras bacterianas estudadas, isoladas de 17 (85%) dos 20 pacientes incluídos no estudo, 43 (24%) apresentaram HPM seguindo os critérios estabelecidos por Maciá e colaboradores. Essas subpopulações apresentaram maiores taxas de resistência a antimicrobianos. As amostras estudadas apresentaram grande variabilidade genética (49 perfis definidos com a utilização da técnica de RADP), embora tenha sido observada, também, a incidência de clones compartilhados por diferentes pacientes. Não encontramos similaridade entre os clones estudados e as cepas epidêmicas circulantes em outros países. Das amostras classificadas como HPM pelos critérios de Macia e colaboradores, apenas 3 delas apresentaram frequência de mutação que permitisse sua classificação como HPM. Com o sequenciamento do DNA encontramos mutações que levaram a mudança de aminoácidos nas proteínas codificadas pelos genes mutS, mutD e urvD. Não observamos mutações nos genes mutM, mutT e mutY que pudessem alterar os aminoácidos sintetizados. Como são escassos estudos sobre a influência da HPM em alterações fenotípicas outras que a resistência a antimicrobianos, comparamos a expressão de atributos de virulência nas populações selvagens e subpopulações. Não observamos alterações nos estados nutricionais, mobilidade e capacidade de formação de biofilme dos microrganismos estudados. Ao contrário, as subpopulaçãoes apresentaram uma menor atividade de LasA e um aumento na produção de piocianina, o que reforça nossa hipótese de que células mutantes teriam uma vantagem no ambiente pulmonar de pacientes com FC. Devido à diferença nos testes propostos para caracterização de HPM, sugerimos que o teste de difusão em agar modificado seja adotado como uma metodologia de triagem a ser utilizada em laboratório de microbiologia clinica. / Pulmonary infection is a major cause of morbidity and mortality in patients with Cystic Fibrosis (CF). The prognosis of these patients is influenced by the number of annual exacerbations of the infectious processes and the microbial load in their respiratory secretions. Pseudomonas aeruginosa is the main CF pathogen, both in importance and predominance. Recently, highly transmissible P. aeruginosa strains were reported among CF patients from different CF Health Care centers. The persistence of P. aeruginosa in the lung of CF patients is associated, at leat in part, with the presence of strains with hipermutability (HPM), a phenomenon caused mainly by defects in genes involved in the DNA repair system. In this report, 43 (24%) out of 179 P. aeruginosa isolates recovered from 17 (85%) out of 20 CF patients included in the study were characterized as HPM, according to the criteria established by Maciá and collegues. The HPM subpopulations exhibited higher rates of antimicrobial resistance. By using the RAPD technique, bacteria included in our study were shown to exhibit high genetic variability and could be grouped in 49 different clones. However, a few clones were shared by different patients. No similarity was detected among these clones and epidemic strains from others countries. Of the 43 isolates classified as HPM by Maciás criteria, only 3 exhibited mutation frequencies allowing their inclusion in the HPM group. By sequencing the DNA from these bacteria we found mutations in the genes mutS, mutD and urvD that resulted in changes in the aminoacids sequences. We did not observe mutations in the genes mutM, mutt and mutY that could have altered the aminoacid sequence from synthesized protein. Since there are only a few report in the literature on the influence of HPM on bacterial phenotypic alterations other than antimicrobial resistance, we also compared 81 bacterial isolates from the wild populations and HPM subpopulations in their virulence properties No difference among the microorganisms were detected considering their nutricional variations, mobility and ability of biofilm formation. In contrast, HPM subpopulations exhibited decreased LasA activity and increased production of pyocianyn. These results reinforced our hypothesis that bacterial mutants may have some advantage in the pulmonary environment of CF patients. Due to the difference in the results of the two sorts of test used to identify HPM, we propose the test of diffusion in modified agar as a trial test to be included in laboratories of clinical microbiology.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / ExoU, uma citotoxina produzida pelo patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa e translocada para o citosol de células hospedeiras via sistema de secreção do tipo III, é associada à gravidade de infecções agudas. No presente trabalho, o efeito de ExoU na ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante foi avaliado em culturas de células epiteliais respiratórias humanas infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa (produtora de ExoU), com a mutante deletada no gene exoU, PA103&#8710;exoU, ou com a mutante complementada com exoU sem atividade tipo fosfolipase A2, PA103&#8710;UT/S142A. Análises das dosagens de hidroperóxidos lipídicos e isoprostanos, considerados marcadores de estresse oxidativo, revelaram que ExoU promoveu um aumento em suas concentrações. Foi observado, também, que ExoU estimulou a produção de espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e peroxinitrito nas células infectadas, assim como a expressão de iNOS e eNOS, mas não de nNOS. Além disso, ExoU foi responsável pelo aumento da atividade de SOD1 e pela redução dos níveis de GSH, mas não afetou a atividade da catalase ou de NQO1. No modelo in vivo, a dosagem de malondialdeído, um subproduto da lipoperoxidação de membranas, evidenciou uma maior produção deste composto no pulmão de camundongos infectados pela cepa produtora de ExoU, em comparação ao pulmão de camundongos infectados pela cepa mutante. Em conjunto, estes resultados mostram que ExoU ativa a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, levando à peroxidação lipídica e modulando o sistema de defesa antioxidante / ExoU, a cytotoxin produced by the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa and translocated into the cytosol of host cells via a type III secretion system, is associated with severity of acute infections. In the present work, the effect of ExoU in the activation of oxidative stress and antioxidant response was evaluated in cultures of human respiratory epithelial cells infected with P. aeruginosa PA103 strain (producer of ExoU), or with its isogenic mutants, the ExoU-deficient PA103&#8710;exoU or the exoU-depleted mutant complemented with an exoU gene with a site-specific mutation in the PLA2 catalytic site, PA103&#8710;UT/S142A. Analysis of dosages of lipid hydroperoxides and isoprostanes, considered markers of oxidative stress, revealed that ExoU promoted an increase in their concentrations. It was also observed that ExoU stimulated the production of reactive oxygen species, nitric oxide and peroxynitrite in infected cells, as well as the expression of iNOS and eNOS, but not nNOS. Furthermore, ExoU was responsible for the increased activity of SOD1 and the reduced levels of GSH, but did not affect the activity of catalase or NQO1. In the in vivo model, the analysis of malondialdehyde, a byproduct of lipid peroxidation of membranes, showed increased production of this compound in the lungs of mice infected with the ExoU-producing strain compared to the lungs of mice infected with the mutant strain. Together, these results show that ExoU activates the production of reactive oxygen and nitrogen species, leading to lipid peroxidation and modulating the antioxidant defense system.

Objetivos: Avaliar o perfil de suscetibilidade, a prevalência da produção de AmpC, β-lactamase de espectro estendido (ESBL) e Metalo-β-lactamase (M-βla) em Pseudomonas aeruginosa obtidas de dois hospitais universitários distintos (ISCMPA e HCPA) em Porto Alegre. Em adição, tipagem molecular por PFGE foi realizada entre os isolados produtores de M-βla para avaliar a relação clonal. Métodos: Foi determinada a suscetibilidade de 238 isolados de P. aeruginosa para 8 agentes antimicrobianos, através do teste de disco-difusão, usando agar Müller-Hinton (MH) de acordo com “National Committee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS) . Todos isolados foram avaliados para produção de AmpC com o disco de imipenem (indutor) próximo ao disco de cefepima/ceftazdima (substrato). Um achatamento no halo de cefepime/ceftazidima pela indução da enzima pelo imipenem, indicava resultado positivo para AmpC. Todos isolados forma avaliados para a presença de ESBL através do teste de aproximação de disco com ceftazidima, cefepima, cefotaxima, ceftriaxona e ticarcilina-clavulanato como inibidor de β-lactamase. A produção de M-βla foi determinada através do teste de aproximação de discos de CAZ a discos impregnados com ácido2-mercatopropiônico (2-MPA). As taxas de resistência foram comparadas através do Teste Exato de Fisher. Valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Análise de macrorestrição com a enzima speI foi realizada em isolados produtores de M-βla. Resultados: As taxas de resistência para todos os agentes foram superiores entre os isolados obtidos na ISCMPA em relação aos do HCPA. A ceftazidima mostrou ser o antibiótico mais efetivo contra os isolados de ambos Hospitais (ISCMPA e HCPA) com taxa de resistência de 25,7% (ISCMPA) e 6,1% (HCPA). A expressão de AmpC foi observada em 190 isolados (83,7% HCPA e 77,1% ISCMPA). Não foi possível detectar a presença de ESBL entre todos as P. aeruginosa avaliadas em ambos hospitais. Foi observada a presença de M-βla em 28 isolados (20,0%) da ISCMPA. Mas não foi detectada M-βla em nenhuma P. aeruginosa do HCPA. A análise de macrorestrição mostrou que 14 de 16 P. aeruginosa Mβla positivas pertenciam a um clone (denominado clone A), e seus subclones. Apenas dois outros clones (B e C) foram identificados em um isolado cada. / Objectives: To evaluate susceptibility profile, the prevalence of extendedspectrum β-lactamases (ESBL) production, AmpC and Metallo-β-lactamases (M-βla) in Pseudomonas aeruginosa obtained from two distinct hospitals (ISCMPA and HCPA) in Porto Alegre, Brazil. In addiction, molecular typing by PFGE was perfomed among isolates producing M-βla in order to evaluate probably clonal relatedness. Methods: The susceptibility of 238 P. aeruginosa to 8 antimicrobial agents was determined by the disk diffusion method, using Müller-Hinton agar (MH) in accordance with “National Committee for Clinical Laboratory Standards” guidelines. All isolates were evaluated for AmpC production with the imipenem disk (strong inducer) near of the cefepime/ceftazidime disk (substrate). A blunting of the cefepime/ceftazidime zone by imipenem-induced enzyme, indicated positive result for AmpC. All isolates were evaluated for ESBL production by disk approximation test with ceftazdime, cefepime, cefotaxime, ceftriaxone plus ticarcillin-clavulanate as inhibitor. M-βla production was determined by disk approximation test with disks containing CAZ and 2-mercatopropionic acid (2-MPA). The results were compared by the Fisher’s Exact Test. Macrorestriction analysis by SpeI, followed by PFGE, was perfomed in isolates M-βla positive. The resistance rates were compared by The Fisher’s Exact Test. P values < 0.05 were considered to be statistically significant. Results: The resistance rates to all antimicrobial agents were higher among isolates obtained from ISCMPA than those obtained from HCPA. The ceftazidime was the more active antibiotic against the isolates in both hospitals with resistance rates of 25,7% (ISCMPA) and 6,1% (HCPA). The derepression of AmpC was observed in 190 isolates (83,7% HCPA and 77,1% ISCMPA). It was not possible to detect the presence of ESBL among all P. aeruginosa evaluated in both hospitals. Positive results for M-βla production were observed in 28 isolates (20,0%) from ISCMPA. But none M-βla production was identified in P. aeruginosa from HCPA. The macrorestriction analysis by PFGE, showed that 14 of 16 M-βla positive P. aeruginosa beloneed to one clone (named clone A) and its subclones.Only two others clones (B and C) were identified in one isolate each.

Os surfactantes são poderosos agentes anfipáticos com aplicação nas indústrias petrolífera, alimentícia e farmacêutica, entre outras. Vários surfactantes quimicamente sintetizados são hoje utilizados, embora o desenvolvimento de produtos biodegradáveis e menos tóxicos, os chamados biossurfactantes, agentes obtidos por via microbiológica, torna-se uma estratégia importante na obtenção de componentes compatíveis com o meio ambiente. Muitos biossurfactantes têm sido produzidos, embora poucos sejam comercializados em virtude do alto custo de produção envolvido na obtenção desses compostos, principalmente no que se refere à utilização de substratos caros a e aos processos de purificação. Neste sentido, a utilização de glicerol, substrato gerado em grandes quantidades a custos cada vez mais reduzidos em função da crescente demanda mundial de biodiesel, aliada a habilidade da bactéria Pseudomonas aeruginosa UCP0992 em produzir biossurfactantes, foi avaliada para a produção de um biossurfactante com vistas à aplicação na área ambiental. Inicialmente, a influência da concentração do glicerol (2-7%), do tipo (NaNO3, NH4NO3, uréia, (NH4)2SO4, peptona, extrato de levedura e milhocina) e da concentração (0,05-0,6%) da fonte de nitrogênio e das condições de cultivo (temperatura 28 e 37C, aeração 60, 80 e 90% e agitação 150 e 200 rpm) foram avaliadas na produção do biossurfactante por Pseudomonas aeruginosa UCP0992. A cinética de crescimento do microrganismo e de produção do biossurfactante foi descrita para o meio mineral suplementado com 3% de glicerol e 0,6% de NaNO3, a 28 C durante 120 horas sob agitação de 200 rpm. Uma relação paralela entre o crescimento do microrganismo, o consumo de glicerol, a obtenção do biossurfactante e a emulsificação do hexadecano foi observada, indicando uma produção associada ao crescimento. O rendimento em biossurfactante isolado após 96 horas foi de 8,0 g/L, para uma biomassa de 4,0 g/L. A tensão tensão superficial do meio foi reduzida de 56 mN/m para 27,4 mN/ e a emulsificação do hexadecando permaneceu inalterada a partir das 72 horas, com percentual de 75%. O biossurfactante apresentou CMC de 700 mg/L, tensão interfacial contra o hexadecano de 2 mN/m, estabilidade térmica (4-120C) e estabilidade a diferentes pH (4-12) relacionadas à capacidade de redução da tensão superficial e à atividade de emulsificação de óleos vegetais e diesel, além de tolerância a concentrações salinas (2-10%). O biossurfactante demonstrou pequenas variações na tensão superficial e na capacidade de emulsificação quando submetido a 90C por durante dias horas. O biossurfactante foi caracterizado como um grupo de raminolipídeos de natureza aniônica. O biossurfactante bruto não apresentou toxicidade frente ao microcrustáceo Artemia salina e ao repolho (Brassica oleracea) nas condições testadas, enquanto que o biossurfactante isolado apresentou toxicidade frente ao microcrustáceo em função da concentração testada. O potencial de aplicação do biossurfactante na remoção de diesel foi demonstrado pelos elevados percentuais de remoção (85%). Os resultados promissores obtidos nesse trabalho indicam a viabilidade de produção de biossurfactantes potentes a partir de glicerol como fonte de carbono / Surfactants are amphipathic agents with application in different industries, such as the petroleum, food and pharmaceutical. Many kinds of chemical surfactants are being used nowadays, although the development of alternative products, with biodegradable nature and lower toxicity, as the so called biosurfactants, metabolites from microorganisms, is a sound strategy for the development of compounds with ecological acceptability and for the knowledge of specific properties and application of these compounds. Different biosurfactants have been produced, but few are being commercialised due the high production costs regarded the utilisation of substrates and purification techniques. Thus, the purpose of this work is to combine the glycerol generated from biodiesel at low cost with the ability of the bacterium Pseudomonas aeruginosa UCP0992 to produce a biosurfactant with ability to remove a hydrophobic pollutant from the petroleum industry. First, the influence of glycerol concentration (2-7%), of type (NaNO3, NH4NO3, urea, (NH4)2SO4, peptone, yeast extract and corn steep liquor), and concentration (0,05-0,6%) of the nitrogen source and of the cultivation conditions (temperature 28 and 37C, aeration 60, 80 and 90% and agitation 150 and 200 rpm) was studied for biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa UCP0992. The kinetic of growth and production of the biosurfactant has been described for the medium supplemented with 3% glycerol and 0.6% NaNO3, at 28 C during 120 hours under 200 rpm. A parallel relation between biomass, consume of glycerol, biosurfactant production, surface tension reduction and hexadecane emulsification showed a growth-associated production. The isolated biosurfactant corresponded to a yield of 8.0 g/L after 96 hours with a biomass of 4.0 g/L. The medium surface tension was reduced from 56 mN/m for 27,4 mN/ and the hexadecane emulsification remained unchanged after 72 hours, with values around 75%. The biosurfactant showed a CMC of 700 mg/L an interfacial tension against hexadecane of 2 mN/m, thermal (4-120C) and pH (4-12) stability regarding the surface tension reduction and the emulsification capacity of vegetable oils and diesel, and tolerance under salt concentrations (2-10%). Little changes in the surface tension and in the emulsification activity were observed when the cell-free broth containing the biosurfactant was submitted under 90C during two hours. The biosurfactant has been characterized as a group of rhamnolipids with anionic nature. The crude biosurfactant did not show toxicity against the micro crustacean Artemia salina and the cabbage (Brassica oleracea) in the conditions tested, while the isolated biosurfactant showed toxicity against the micro crustacean depending on the concentration used. The potential application of the biosurfactant in petroleum and diesel recovery from sand was demonstrated by the percentiles of oils removal (85%). The promising results obtained in this work are noteworthy for possible biosurfactant production from glycerol

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A Pseudomonas aeruginosa é um microorganismo patógeno oportunista, sendo considerado um dos mais importantes agentes de infecções hospitalares, devido a sua múltipla resistência aos diversos antibióticos existentes. É encontrada no solo, água, vegetais, animais, alimentos e em diversos ambientes hospitalares, devido ao seu elevado potencial de resistência pode realizar processos de biorremediação. Um dos maiores problemas ambientais gerados nas atividades de uma indústria têxtil é a grande quantidade de efluentes altamente poluidores gerados, dentre os poluentes destacase o corante preto de remazol, que tem causado sérios problemas ambientais, como afetar a transparência e estética dos corpos aquáticos, impedindo assim a penetração da luz solar, e por conseguinte a atividade fotossintética. Neste sentido, foram realizados estudos iniciais com a P. aeruginosa (UCP1567) isolada de ambiente hospitalar, através da eliminação de plasmídeos relacionados à resistência aos antibióticos, utilizando o cádmio. A amostra foi aclimatada duas vezes em meio Luria Bertani contendo glicose, através da Concentração Mínima Inibitória determinada para o cádmio (32g/mL e 52 g/mL, respectivamente) utilizando o método de diluição. Os resultados obtidos sugeriram que o metal pesado foi eficiente na eliminação dos plasmídeos de resistência, correspondendo a 84,61% para a aclimatação com cádmio a 32g/mL, e 92,30% para 52 g/mL. Em seguida, a cultura após eliminação da resistência pelo cádmio, foi submetida ao processo de descoloração do preto de remazol através de um planejamento fatorial 23, tendo como variáveis independentes a agitação, a concentração do corante e o tamanho do inóculo, e como variável resposta, a descoloração do corante. Os resultados obtidos demonstraram que o potencial de biorremediação da P. aeruginosa não foi afetado, e que a cultura microbiana após eliminação de resistência, promoveu uma descoloração de 85-94,4% do corante, sob condições de repouso, e de 52% sob agitação de 100 rpm e 45% sob agitação de 200 rpm. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen microorganism was considered one of the most important agents of nosocomial infections due to its multiple resistance to many existing antibiotics. It is found in soil, water, plants, animals, food and various hospital settings, due to its high potential for resistance can perform processes of bioremediation. One of the biggest environmental problems generated in the activities of a textile industry is the large number of highly polluting effluents generated among the pollutants out to the black dye Remazol, which has caused serious environmental problems such as transparency and affect the aesthetics of water bodies thus preventing the penetration of sunlight, and thus the photosynthetic activity. In this regard, initial studies were performed with P. aeruginosa (UCP1567) isolated from hospital environment through the elimination of plasmids related to antibiotic resistance, using cadmium. The sample was acclimatized twice in Luria Bertani medium containing glucose, through the Minimum Inhibitory Concentration determined for cadmium (32&#956;g/mL and 52 mg / mL, respectively) using the dilution method. The results suggest that heavy metal was effective in eliminating the resistance plasmids, corresponding to 84.61% for acclimation to cadmium 32&#956;g/mL, and 92.30% for 52 mg / mL. Then, after eliminating the culture of resistance by cadmium, was submitted to the decolorization of Remazol black through a 23 factorial design, with independent variables agitation, the dye concentration and inoculum size, and as the response variable discoloration of the dye. The results showed that the potential for bioremediation of P. aeruginosa was not affected, and that culture after removal of microbial resistance, caused a discoloration of 85 to 94.4% of the dye, under conditions of rest, and 52% and agitation of 100 rpm and 45% under agitation at 200 rpm.

Foram avaliados 528 isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa de 131 pacientes fibrocísticos atendidos em um centro de referência em fibrose cística (FC) durante o período de 2005 a 2008. 135 isolados clínicos (25,6%) apresentaram subpopulação hipermutante (isolados com altas taxas de mutações) utilizando teste modificado de suscetibilidade aos antimicrobianos. Destes, 9 isolados (6,7%) de 7 pacientes foram classificados como hipermutantes (HPM) segundo estimativa da freqüência de mutação. Após seqüenciamento do gene mutS e análise de mutações relacionadas à inativação do sistema de reparo de erros no pareamento do DNA (Mismatch Repair System - MRS), foi possível observar este tipo de mutação em 5 isolados HPM de 4 pacientes. Avaliamos a formação de biofilme em 45 isolados NHPM, 9 HPM e suas respectivas subpopulações por duas metodologias. Segundo o primeiro método, 24 (53,3%) e 3 (21,4%) isolados NHPM e HPM, respectivamente, foram classificados como não-formadores de biofilme. Pelo segundo método, apenas 4 (8,9%) isolados NHPM e nenhum isolado HPM foram classificados nessa categoria. Os percentuais de resistência aos antibióticos ceftazidima, ciprofloxacino e tobramicina em condições de biofilme foram mais elevados que aqueles obtidos em crescimento plantônico e, em ambas as condições, foi possível evidenciar forte associação entre hipermutabilidade e aumento de resistência antibiótica. A associação dos macrolídeos azitromicina e claritromicina, em concentrações sub-inibidoras, com os antibióticos anti-pseudomonas, demonstrou ação inibitória sobre isolados clínicos de P. aeruginosa em condições de biofilme, o que sugere sua indicação no tratamento de infecções por P. aeruginosa pela sua ação anti-biofilme. / We evaluated 528 clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in 131 CF patients attended at a referral center for cystic fibrosis (CF) during the period of 2005 to 2008. 135 clinical isolates (25.6%) presented hypermutable subpopulation (isolates with high mutation rates) using a modified antimicrobial susceptibility method. Of these, 9 isolates (6.7%) of 7 patients were classified as hypermutable (HPM) according to the estimate of mutation frequency. After gene sequencing and analysis of mutS mutations related to inactivation of the repair system errors in DNA pairing (Mismatch Repair System - MRS), we observed this type of mutation in 5 HPM isolates of 4 patients. We evaluated the biofilm formation in 45 isolates NHPM, 9 HPM and their subpopulations by two methods. According the first method, 24 (53.3%) and 3 (21.4%) isolates NHPM and HPM, respectively, were classified as non-biofilm formers. According the second method, only 4 (8.9%) isolates NHPM and none HPM were classified in this category. The percentages of resistance to antibiotics ceftazidime, ciprofloxacin and tobramycin in conditions of biofilm were higher than those obtained in planktonic growth, and in both conditions, it was observed a strong association between hypermutability and increased antibiotic resistance. The association of macrolides azithromycin and clarithromycin, in sub-inhibitory concentrations, with anti-pseudomonas antibiotics, has shown inhibitory activity on clinical isolates of P. aeruginosa in biofilm conditions, which should be recommended for treatment of CF P. aeruginosa infections due to its anti-biofilm action.

P. aeruginosa est une bactérie pathogène de l'homme, responsable d'infections nosocomiales chez les patients immunodéprimés. Bien que son évolution au sein d'un patient soit bien décrite, son évolution génomique globale au cours de sa propagation dans un hôpital est très mal connue. Le clone à haut-risque ST395 multirésistant aux antibiotiques a diffusé dans le Centre Hospitalier Regional Universitaire de Besançon entre 1997 et 2008 en infectant ou colonisant plus de 300 patients. Une approche WGS a été utilisée afin d'identifier l'origine de l'épidémie, les caractéristiques ayant aidé à son installation à l'hôpital ainsi que celles à l'origine de sa disparition. Les génomes de 54 isolats représentatifs de l'épidémie ont été séquencés. L’arbre phylogénétique a mis en évidence deux clusters distincts indiquant la présence de deux épidémies parallèles. La datation d'un ancêtre commun en 1979, date de début de la construction de l'hôpital, indiquerait une contamination précoce du réseau d'eau de l'hôpital. Cette hypothèse est soutenue par la présence d'un îlot génomique spécifique de ST395 portant les gènes codant 6 transporteurs du cuivre et associée à une résistance phénotypique à ce métal constituant les tuyaux du réseaux de distribution d'eau potable. Les isolats tardifs présentaient des signatures génomiques d'adaptation à l’infection chronique (altération du lipopolysaccharide et de la porine OprD – objectivées phénotypiquement, et extinction de la surproduction de la pompe d’efflux MexAB-OprM – contrôlée par RT-qPCR) suite à des mutations indépendantes. Certaines de ces mutations ont été associées à une perte de fitness bactérien. Nous émettons l’hypothèse que l’émergence indépendante d’isolats adaptés à l’infection chronique, et ainsi l’accumulation de culs-de-sac épidémiologiques, a participé à l’épuisement de l’épidémie hospitalière de P. aeruginosa ST395. / P. aeruginosa is an opportunistic pathogen responsible of hospital-acquired infections in immunocompromised patients. Although in-host evolution of P. aeruginosa is well documented, little is known about this pathogen evolution during its spread on a hospital scale. The high-risk multidrug resistant clone ST395 spread among more than 300 patients in the University Hospital of Besançon between 1997 and 2008. We used a WGS approach to identify the origin of the outbreak, the features that could have helped its implantation in our hospital and those associated with the end of the epidemics. The genomes of 54 representative isolates were fully sequenced. The phylogenetic tree indicated two distinct clusters corresponding to two parallel outbreaks. The ancestor of the ST395 clone possibly contaminated our hospital water network during its construction in 1979. This hypothesis is supported by the fact that the ST395 strain had a specific genomic island carrying 6 copper transporter genes implicated in copper resistance, correlated with the resistance to this metal which water supply network is made of. The late isolates displayed independent genomic signatures of chronic adaptation in patients (altered LPS and porin OprD, and extinction of MexAB-oprM efflux pump overproduction). Some of these mutations were associated with a decreased in vitro fitness. We hypothesize that the independent emergence of isolates adapted to chronic infection, and thus the accumulation of epidemiological dead-ends, participated to the end of the hospital outbreak of P. aeruginosa ST395.