Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-05-15T19:41:16Z No. of bitstreams: 2 Tese - Lilian Rosana Silva Rabelo - 2015.pdf: 1454721 bytes, checksum: c59a6c6722bdc9563eb632b7040fd681 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-05-16T12:07:47Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Lilian Rosana Silva Rabelo - 2015.pdf: 1454721 bytes, checksum: c59a6c6722bdc9563eb632b7040fd681 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-16T12:07:47Z (GMT). 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However the presence of the disease Huanglongbening (HLB), transmitted by D. citri, was detected in three states, only: São Paulo, Minas Gerais and Paraná. The present work was to study the occurrence of D. citri in citrus orchards of Goiás State, analyzing the population dynamics and verify the presence of Candidatus Liberibacter spp. through its detection in the vector, to improve strategies related to its management. To this end, surveys were conducted through sticky traps and visual inspections in commercial citrus orchards, located in Goiás mesoregions: south, central, east and northeast, from February 2012 to April 2014. The adults captured were analyzed by PCR for detcção Ca. Liberibacter spp. and was also carried out the study of population fluctuation of D. citri. Join the occurrence of Diaphorina citri in Goiás in the municipalities of Agua Fria de Goiás, meso northeast, Pirenópolis, mesoregion east, and Santa Izabel, central region, in low density. The hosts where there was detection of the psyllid were ponkan mandarin (Citrus reticulata Blanco), orange-pear (Citrus sinensis L. Osbeck), orange-natal (Citrus sinensis L. Osbeck) and Tahiti lime (Citrus x limon). There was no detection of Candidatus Liberibacter, therefore, keep the state as harmless area Huanglongbing (HLB). The population peak of adults and / or nymphs of D. citri occur in mid-spring and early summer, with population peak in October 2012 and 2013 and February 2013, being directly influenced by the issue of the growing flow of citrus plants and by climatic precipitation and temperature parameters. / O psilídeo-asiático-dos-citros, Diaphorina citri, por ser o vetor da bactéria Candidatus Liberibacter spp., está associado a mais importante doença da cultura cítrica da atualidade, o Huanglongbing (HLB), e tem impactado negativamente na produção de citros em vários países no mundo, inclusive no Brasil. D. citri assumiu o status de praga-chave da citricultura nacional por ser o principal vetor da Huanglongbing (HLB) – doença registrada no Brasil no ano de 2004 –, e por possuir alta capacidade de transmitir bactérias a ela associadas. Há registro da incidência do psilídio-asiático-dos-citros, D. citri, em seis Estados brasileiros: São Paulo, Minas Gerais, Paraná, Rio de Janeiro, Bahia, Rio Grande do Sul e Roraima. No entanto, a presença da doença Huanglongbening (HLB), transmitida pelo D. citri, foi detectada em apenas três destes Estados: São Paulo, Minas Gerais e Paraná. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo estudar a ocorrência de D. citri em áreas citrícolas do Estado de Goiás, analisar a flutuação populacional e verificar a presença de Candidatus Liberibacter spp. por meio de sua detecção no vetor, visando melhorar as estratégias relacionadas ao seu manejo. Para tanto, foram realizados levantamentos, por meio de armadilhas adesivas e inspeções visuais, em pomares citrícolas comerciais, situados nas mesorregiões goianas: sul, centro, leste e nordeste, de fevereiro de 2012 a abril de 2014. Os adultos capturados foram analisados por meio de PCR para detcção de Ca. Liberibacter spp. e também foi realizado o estudo da flutuação populacional de D. citri. Registra-se a ocorrência de Diaphorina citri em Goiás nos municípios de Água Fria de Goiás, mesorregião nordeste, Pirenópolis, mesorregião leste, e Santa Izabel, mesorregião centro, em baixa densidade. Os hospedeiros em que houve detecção do psilídeo foram: tangerina Ponkan (Citrus reticulata Blanco), laranja-pera (Citrus sinensis L. Osbeck), laranja-natal (Citrus sinensis L. Osbeck) e limão Tahiti (Citrus x limon). Não houve detecção de Candidatus Liberibacter, sendo assim, mantêm-se o Estado como área indene de Huanglongbing (HLB). O pico populacional de adultos e/ou ninfas de D. citri ocorrem em meados da primavera e início do verão, com pico populacional em outubro de 2012 e 2013 e fevereiro de 2013, sendo influenciada diretamente pela emissão do fluxo vegetativo das plantas de citrus e pelos componentes climáticos precipitação e temperatura.

Um dos inseticidas mais utilizados para o controle do psilídeo Diaphorina citri (Hemiptera: Liviidae) em pomares de citros no Brasil tem sido o neonicotinoide imidacloprid. Para subsidiar um programa de Manejo da Resistência de D. citri a imidacloprid foram realizados estudos de monitoramento da suscetibilidade a inseticidas em populações de D. citri provenientes das principais regiões citrícolas do Estado de São Paulo, interações de imidacloprid com inseticidas e fungicidas, e avaliação da viabilidade de associação de imidacloprid com o parasitoide Tamarixia radiata (Hymenoptera: Eulophidae). Para a caracterização de linhas básicas de suscetibilidade de D. citri aos inseticidas imidacloprid, deltamethrin e dimethoate foram utilizados bioensaios de contato residual. Foram definidas as concentrações diagnósticas de 56 mg de imidacloprid/L água (CL95), 32 mg de deltamethrin/L água (CL90) e 56 mg de dimethoate/L água (CL95) para o monitoramento da suscetibilidade de 25 populações de D. citri entre 2010 e 1012. Não ocorreram diferenças na sobrevivência aos inseticidas testados em populações de psilídeos coletados em pomares de citros com diferentes intensidades de pulverização com inseticidas. A maior sobrevivência de insetos nas concentrações diagnósticas foi observada em 2010, com valores de sobrevivência variando de 4,7% a 24,0% para imidacloprid, de 0,9% a 11,8% para deltamethrin e de 5,2% a 13,0% para dimethoate. Não foram observados aumentos significativos na sobrevivência de D. citri nos monitoramentos realizados em 2011 e 2012. As interações de imidacloprid com deltamethrin ou dimethoate foram testadas com as CL25 dos respectivos inseticidas em bioensaio de contato residual. As interações foram aditivas sobre a mortalidade de adultos em condições de campo e de casa de vegetação. A mistura de imidacloprid com buprofezin e pyriproxyfen sobre ninfas de 3º instar também foi aditiva. A atividade biológica das concentrações campo de imidacloprid (40?L/mL) e buprofezin (375?g/mL) e da mistura dos mesmos mostrou uma degradação da atividade similar para o controle de D. citri em condições de campo e casa de vegetação. A avaliação da persistência da mistura de imidacloprid e pyriproxyfen (avaliado nas concentrações de 6,25?g/mL e 100?g/mL) indicou que pyriproxyfen teve degradação mais rápida que imidacloprid. A mistura de imidacloprid na CL25 para D. citri com a concentração de campo dos fungicidas Benzimidazol (500?g/mL de tiofanato-metilico), estrubilurina (37,5?g /mL de piraclostrobina) e triazol (50?g/mL de difenenoconazol) não afetaram o desempenho de imidacloprid. Houve significativa redução na taxa instantânea de crescimento (ri) de D. citri quando expostas a diferentes idades de resíduos de imidacloprid pulverizado na concentração de 40?g/mL, mesmo sobre resíduos com 56 dias de idade, levando à extinção da população ou em processo de extinção. A exposição a CL5 (0,501?g/mL), CL10 (0,804?g/mL), CL25 (1,995?g/mL) e CL50 (5,213?g/mL) de imidacloprid para D. citri reduziu o crescimento populacional de D. citri, mas não causou sua extinção. Contudo, essas concentrações de imidacloprid afetaram a ri do parasitoide com a CL50 causando sua extinção. / One of the most widely used insecticides for control of Diaphorina citri (Hemiptera: Liviidae) in citrus groves in Brazil has been the neonicotinoid imidacloprid. To implement an Insect Resistance Management program of D. citri to imidacloprid, studies were conducted to monitor the susceptibility to insecticides in D. citri populations collected from main citrus production regions of São Paulo State, to evaluate the interactions of imidacloprid with insecticides and fungicides, and to assess the feasibility of imidacloprid association with the parasitoid Tamarixia radiata (Hymenoptera: Eulophidae). Residual contact bioassays were used to characterize the baseline susceptibility of D. citri to the insecticides imidacloprid, deltamethrin and dimethoate. Diagnostic concentrations of 56 mg of imidacloprid/L water (LC95), 32 mg of deltamethrin/L water (LC90) and 56 mg of dimethoate/L water (LC95) were defined for monitoring the susceptibility in 25 populations of D. citri from 2010 to 2012. There were no differences in survival to the insecticides tested in D. citri populations collected in citrus groves with different regimes of insecticide use. The highest survival of insects at diagnostic concentrations was observed in 2010, with survival values ranging from 4.7% to 24.0% for imidacloprid, from 0.9% to 11.8% for deltamethrin and 5.2% to 13.0% dimethoate. There were no significant increases in survival of D. citri on monitoring conducted in 2011 and 2012. The interactions of imidacloprid with deltamethrin or dimethoate were tested with the LC25 of each insecticide with residual contact bioassays. The interactions of these insecticides were additive on D. citri adult mortality under field or greenhouse conditions. The interactions of imidacloprid with buprofezin and pyriproxyfen were additive on 3rd instar nymphs. The biological activity at field rates of imidacloprid (40?l/mL) and buprofezin (375?g/mL) as well as the mixture of these insecticides showed a similar degradation in the activity to control D. citri under field and greenhouse conditions. The evaluation of the persistence of the mixture of pyriproxyfen and imidacloprid (evaluated at concentrations of 6.25 ?g/mL and 100?g/mL) indicated that pyriproxyfen degradation was faster than imidacloprid. The mixture of LC25 of imidacloprid to D. citri with fungicides field rates of benzimidazole (500?g/mL of thiophanate-methil), strobilurin (37.5 ?g/mL of pyraclostrobin), and triazole (50?g/mL of difenoconazole) did not affect the performance of imidacloprid. A significant reduction in the instantaneous rate of increase (ri) of D. citri was observed when exposed to different residue ages of imidacloprid sprayed at concentration of 40?g/mL, even when exposed to residues of 56-day old, by leading to their extinction or in extinction process. The exposure to CL5 (0.501 ?g/mL), CL10 (0.804 ?g/mL), LC25 (1.995 ?g/mL) and LC50 (5.213 ?g/mL) of imidacloprid to D. citri did not cause their extinction. However, these concentrations of imidacloprid affected the ri of the parasitoid causing their extinction at LC50.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica encontrada em várias partes do mundo e tem a capacidade de produzir cristais durante a fase estacionária do crescimento. Esses cristais são toxinas compostas por proteínas ativas contra uma ampla variedade de fases imaturas de insetos. As toxinas do Bt têm sido usadas como bioinseticidas por décadas no controle de insetos das ordens Coleoptera, Lepidoptera e Diptera, e algumas toxinas já foram selecionadas como efetivas contra ácaros, nematoides e insetos sugadores de floema da ordem Hemiptera, como os afídeos. Recentemente, foi comprovada a patogenicidade de três isolados de Bt a outro inseto dessa ordem, o psilídeo Diaphorina citri. Esse psilídeo é vetor das bactérias Candidatus Liberibacter spp., agentes causais da principal doença dos citros: o Huanglongbing ou HLB. A descoberta da capacidade endofítica de Bt em plantas de diferentes espécies vegetais abriu perspectivas para novos estudos usando o Bt para controle de insetos sugadores, como a D. citri. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito patogênico de cada toxina Cry ou Cyt presente nestes três isolados através de isolados de Bt recombinantes expressando as toxinas individualmente. Foram montados bioensaios para confirmar a taxa de mortalidade causada por isolados de Bt contra ninfas de D. citri. Os bioensaios foram feitos usando cinco plantas de laranja doce (Citrus sinensis (L.) Osbeck) e dez ninfas de 3º ínstar de D. citri por planta, além dos controles (sem Bt). A mortalidade das ninfas foi avaliada diariamente durante cinco dias. Durante a avaliação, as ninfas mortas foram coletadas para o isolamento do Bt além da detecção do gene da toxina por PCR. No final do experimento, as folhas jovens onde as ninfas se alimentavam também foram avaliadas quanto à presença do Bt. Nossos resultados confirmaram que os isolados de Bt previamente identificados como patogênicos a D. citri causaram elevada mortalidade (em média 68-93%) em ninfas de 3º ínstar. Dentre os isolados recombinantes testados, um deles apresentou grande destaque, causando a mortalidade de 68-81% das ninfas em 48 horas e 83-93% em 120 horas. Esse isolado possui grande potencial de uso no controle biológico de D. citri através da produção de um bioinseticida ou produção de plantas de citros transgênicas. / Bacillus thuringiensis (Bt) is an entomopathogenic bacterium found in several locations around the world and has the ability to produce crystals during the stationary phase of growth. These crystals are composed of protein toxins that are active against a wide variety of insect larvae. The Bt toxins have been used for decades as biopesticides to control insects of the orders Coleoptera, Lepidoptera, and Diptera. Some toxins have been selected as effective for mites, nematodes and phloem-sucking insects of the order Hemipera, such as aphids. The pathogenicity of strains of Bt to Diaphorina citri, an hemipteran known as Asian citrus psyllid, has been recently demonstrated. This psyllid is the vector of the bacteria Candidatus Liberibacter spp., the causal agents of the main disease of citrus: Huanglongbing or HLB. The discovery of the ability of Bt strains to endophytically colonize plants of different species has opened new perspectives for studies. The aim of this work was to evaluate the pathogenic effect of each Cry or Cyt toxin present in these three isolates through the use of recombinant Bt isolates expressing each toxin individually. A series of bioassays were done in order to confirm the mortality caused by Bt strains against nymphs of D. citri. Bioassays were performed in five seedlings of Citrus sinensis (L.) Osbeck (five replicates/ bioassay) and using ten D. citri 3rd instar nymphs to each assay plant. A suspension containing Bt spores was inoculated via drench in each seedling, and five seedlings were maintained as negative control (without Bt). Mortality was assessed daily for five days. During the bioassays, dead nymphs were collected for further Bt isolation and detection by PCR. At the end of the experiment, young leaves where nymphs feed were also collected to Bt isolation and detection. Our results confirmed that the previously identified Bt isolates pathogenic to D. citri cause high mortality to 3rd instar nymphs. Among the ten recombinant isolates tested, one of them stood out, causing 68-81 % and 83-93% mortality after 48 and 120 hours of inoculation, respectively. The isolation of Bt from dead nymphs and young leaves, and PCR performed with specific primers confirmed the presence of the Bt isolates in psyllids and plants, and their involvement in psyllid mortality. This recombinant Bt with the higher mortality rate found in our results has the potential to be used as a bioinsecticide to control D. citri and the toxin gene can be used to genetic engineering of citrus.

Um dos inseticidas mais utilizados para o controle do psilídeo Diaphorina citri (Hemiptera: Liviidae) em pomares de citros no Brasil tem sido o neonicotinoide imidacloprid. Para subsidiar um programa de Manejo da Resistência de D. citri a imidacloprid foram realizados estudos de monitoramento da suscetibilidade a inseticidas em populações de D. citri provenientes das principais regiões citrícolas do Estado de São Paulo, interações de imidacloprid com inseticidas e fungicidas, e avaliação da viabilidade de associação de imidacloprid com o parasitoide Tamarixia radiata (Hymenoptera: Eulophidae). Para a caracterização de linhas básicas de suscetibilidade de D. citri aos inseticidas imidacloprid, deltamethrin e dimethoate foram utilizados bioensaios de contato residual. Foram definidas as concentrações diagnósticas de 56 mg de imidacloprid/L água (CL95), 32 mg de deltamethrin/L água (CL90) e 56 mg de dimethoate/L água (CL95) para o monitoramento da suscetibilidade de 25 populações de D. citri entre 2010 e 1012. Não ocorreram diferenças na sobrevivência aos inseticidas testados em populações de psilídeos coletados em pomares de citros com diferentes intensidades de pulverização com inseticidas. A maior sobrevivência de insetos nas concentrações diagnósticas foi observada em 2010, com valores de sobrevivência variando de 4,7% a 24,0% para imidacloprid, de 0,9% a 11,8% para deltamethrin e de 5,2% a 13,0% para dimethoate. Não foram observados aumentos significativos na sobrevivência de D. citri nos monitoramentos realizados em 2011 e 2012. As interações de imidacloprid com deltamethrin ou dimethoate foram testadas com as CL25 dos respectivos inseticidas em bioensaio de contato residual. As interações foram aditivas sobre a mortalidade de adultos em condições de campo e de casa de vegetação. A mistura de imidacloprid com buprofezin e pyriproxyfen sobre ninfas de 3º instar também foi aditiva. A atividade biológica das concentrações campo de imidacloprid (40?L/mL) e buprofezin (375?g/mL) e da mistura dos mesmos mostrou uma degradação da atividade similar para o controle de D. citri em condições de campo e casa de vegetação. A avaliação da persistência da mistura de imidacloprid e pyriproxyfen (avaliado nas concentrações de 6,25?g/mL e 100?g/mL) indicou que pyriproxyfen teve degradação mais rápida que imidacloprid. A mistura de imidacloprid na CL25 para D. citri com a concentração de campo dos fungicidas Benzimidazol (500?g/mL de tiofanato-metilico), estrubilurina (37,5?g /mL de piraclostrobina) e triazol (50?g/mL de difenenoconazol) não afetaram o desempenho de imidacloprid. Houve significativa redução na taxa instantânea de crescimento (ri) de D. citri quando expostas a diferentes idades de resíduos de imidacloprid pulverizado na concentração de 40?g/mL, mesmo sobre resíduos com 56 dias de idade, levando à extinção da população ou em processo de extinção. A exposição a CL5 (0,501?g/mL), CL10 (0,804?g/mL), CL25 (1,995?g/mL) e CL50 (5,213?g/mL) de imidacloprid para D. citri reduziu o crescimento populacional de D. citri, mas não causou sua extinção. Contudo, essas concentrações de imidacloprid afetaram a ri do parasitoide com a CL50 causando sua extinção. / One of the most widely used insecticides for control of Diaphorina citri (Hemiptera: Liviidae) in citrus groves in Brazil has been the neonicotinoid imidacloprid. To implement an Insect Resistance Management program of D. citri to imidacloprid, studies were conducted to monitor the susceptibility to insecticides in D. citri populations collected from main citrus production regions of São Paulo State, to evaluate the interactions of imidacloprid with insecticides and fungicides, and to assess the feasibility of imidacloprid association with the parasitoid Tamarixia radiata (Hymenoptera: Eulophidae). Residual contact bioassays were used to characterize the baseline susceptibility of D. citri to the insecticides imidacloprid, deltamethrin and dimethoate. Diagnostic concentrations of 56 mg of imidacloprid/L water (LC95), 32 mg of deltamethrin/L water (LC90) and 56 mg of dimethoate/L water (LC95) were defined for monitoring the susceptibility in 25 populations of D. citri from 2010 to 2012. There were no differences in survival to the insecticides tested in D. citri populations collected in citrus groves with different regimes of insecticide use. The highest survival of insects at diagnostic concentrations was observed in 2010, with survival values ranging from 4.7% to 24.0% for imidacloprid, from 0.9% to 11.8% for deltamethrin and 5.2% to 13.0% dimethoate. There were no significant increases in survival of D. citri on monitoring conducted in 2011 and 2012. The interactions of imidacloprid with deltamethrin or dimethoate were tested with the LC25 of each insecticide with residual contact bioassays. The interactions of these insecticides were additive on D. citri adult mortality under field or greenhouse conditions. The interactions of imidacloprid with buprofezin and pyriproxyfen were additive on 3rd instar nymphs. The biological activity at field rates of imidacloprid (40?l/mL) and buprofezin (375?g/mL) as well as the mixture of these insecticides showed a similar degradation in the activity to control D. citri under field and greenhouse conditions. The evaluation of the persistence of the mixture of pyriproxyfen and imidacloprid (evaluated at concentrations of 6.25 ?g/mL and 100?g/mL) indicated that pyriproxyfen degradation was faster than imidacloprid. The mixture of LC25 of imidacloprid to D. citri with fungicides field rates of benzimidazole (500?g/mL of thiophanate-methil), strobilurin (37.5 ?g/mL of pyraclostrobin), and triazole (50?g/mL of difenoconazole) did not affect the performance of imidacloprid. A significant reduction in the instantaneous rate of increase (ri) of D. citri was observed when exposed to different residue ages of imidacloprid sprayed at concentration of 40?g/mL, even when exposed to residues of 56-day old, by leading to their extinction or in extinction process. The exposure to CL5 (0.501 ?g/mL), CL10 (0.804 ?g/mL), LC25 (1.995 ?g/mL) and LC50 (5.213 ?g/mL) of imidacloprid to D. citri did not cause their extinction. However, these concentrations of imidacloprid affected the ri of the parasitoid causing their extinction at LC50.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica encontrada em várias partes do mundo e tem a capacidade de produzir cristais durante a fase estacionária do crescimento. Esses cristais são toxinas compostas por proteínas ativas contra uma ampla variedade de fases imaturas de insetos. As toxinas do Bt têm sido usadas como bioinseticidas por décadas no controle de insetos das ordens Coleoptera, Lepidoptera e Diptera, e algumas toxinas já foram selecionadas como efetivas contra ácaros, nematoides e insetos sugadores de floema da ordem Hemiptera, como os afídeos. Recentemente, foi comprovada a patogenicidade de três isolados de Bt a outro inseto dessa ordem, o psilídeo Diaphorina citri. Esse psilídeo é vetor das bactérias Candidatus Liberibacter spp., agentes causais da principal doença dos citros: o Huanglongbing ou HLB. A descoberta da capacidade endofítica de Bt em plantas de diferentes espécies vegetais abriu perspectivas para novos estudos usando o Bt para controle de insetos sugadores, como a D. citri. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito patogênico de cada toxina Cry ou Cyt presente nestes três isolados através de isolados de Bt recombinantes expressando as toxinas individualmente. Foram montados bioensaios para confirmar a taxa de mortalidade causada por isolados de Bt contra ninfas de D. citri. Os bioensaios foram feitos usando cinco plantas de laranja doce (Citrus sinensis (L.) Osbeck) e dez ninfas de 3º ínstar de D. citri por planta, além dos controles (sem Bt). A mortalidade das ninfas foi avaliada diariamente durante cinco dias. Durante a avaliação, as ninfas mortas foram coletadas para o isolamento do Bt além da detecção do gene da toxina por PCR. No final do experimento, as folhas jovens onde as ninfas se alimentavam também foram avaliadas quanto à presença do Bt. Nossos resultados confirmaram que os isolados de Bt previamente identificados como patogênicos a D. citri causaram elevada mortalidade (em média 68-93%) em ninfas de 3º ínstar. Dentre os isolados recombinantes testados, um deles apresentou grande destaque, causando a mortalidade de 68-81% das ninfas em 48 horas e 83-93% em 120 horas. Esse isolado possui grande potencial de uso no controle biológico de D. citri através da produção de um bioinseticida ou produção de plantas de citros transgênicas. / Bacillus thuringiensis (Bt) is an entomopathogenic bacterium found in several locations around the world and has the ability to produce crystals during the stationary phase of growth. These crystals are composed of protein toxins that are active against a wide variety of insect larvae. The Bt toxins have been used for decades as biopesticides to control insects of the orders Coleoptera, Lepidoptera, and Diptera. Some toxins have been selected as effective for mites, nematodes and phloem-sucking insects of the order Hemipera, such as aphids. The pathogenicity of strains of Bt to Diaphorina citri, an hemipteran known as Asian citrus psyllid, has been recently demonstrated. This psyllid is the vector of the bacteria Candidatus Liberibacter spp., the causal agents of the main disease of citrus: Huanglongbing or HLB. The discovery of the ability of Bt strains to endophytically colonize plants of different species has opened new perspectives for studies. The aim of this work was to evaluate the pathogenic effect of each Cry or Cyt toxin present in these three isolates through the use of recombinant Bt isolates expressing each toxin individually. A series of bioassays were done in order to confirm the mortality caused by Bt strains against nymphs of D. citri. Bioassays were performed in five seedlings of Citrus sinensis (L.) Osbeck (five replicates/ bioassay) and using ten D. citri 3rd instar nymphs to each assay plant. A suspension containing Bt spores was inoculated via drench in each seedling, and five seedlings were maintained as negative control (without Bt). Mortality was assessed daily for five days. During the bioassays, dead nymphs were collected for further Bt isolation and detection by PCR. At the end of the experiment, young leaves where nymphs feed were also collected to Bt isolation and detection. Our results confirmed that the previously identified Bt isolates pathogenic to D. citri cause high mortality to 3rd instar nymphs. Among the ten recombinant isolates tested, one of them stood out, causing 68-81 % and 83-93% mortality after 48 and 120 hours of inoculation, respectively. The isolation of Bt from dead nymphs and young leaves, and PCR performed with specific primers confirmed the presence of the Bt isolates in psyllids and plants, and their involvement in psyllid mortality. This recombinant Bt with the higher mortality rate found in our results has the potential to be used as a bioinsecticide to control D. citri and the toxin gene can be used to genetic engineering of citrus.

A citricultura se destaca como uma das mais importantes atividades do agronegócio brasileiro, sendo o estado de São Paulo o principal produtor mundial de laranja e o maior exportador de suco concentrado e congelado. O psilídeo dos citros (Diaphorina citri) tornou-se nos últimos anos um dos mais importantes vetores na cultura, devido à transmissão de \'Candidatus Liberibacter asiaticus\' e \'Ca. L. americanus\', bactérias associadas ao huanglongbing (HLB), principal doença da citricultura atual. Uma vez que não há variedades comerciais de citros resistentes ao HLB, seu manejo é baseado no uso de mudas sadias, erradicação de plantas infectadas e pelo controle químico do vetor. No entanto, o custo elevado e os significativos danos ambientais causados pelos inseticidas químicos, associados à possibilidade da seleção de populações de psilídeos resistentes a esses produtos, têm levado à busca por estratégias alternativas de manejo do vetor do HLB que sejam mais adequadas e sustentáveis. Nosso grupo tem tentado contribuir nesse sentido, com a prospecção e caracterização de estirpes de Bacillus thuringiensis (Bt) patogênicos ao psilídeo. Sendo assim, os objetivos deste estudo foram: (a) Confirmar a capacidade endofítica e a patogenicidade de estirpes de Bt em seedlings e mudas de citros com diferentes combinações de copa/porta-enxerto; (b) Determinar a concentração letal (CL50) necessária para ocasionar mortalidade em populações de D. citri; (c) Estudar a interação entre toxinas Cry e receptores de membrana do intestino de ninfas e (d) Avaliar a compatibilidade das estirpes selecionadas com agrotóxicos comumente utilizados na citricultura. Os bioensaios realizados com seedlings e mudas de citros demonstraram que as estirpes de Bt (Cyt1A, Cry2Aa, Cry4A, Cry10, Cry11, S1302, S1450 e S1989) translocaram endofiticamente nas plantas, mantendo sua viabilidade e, em sua maioria, o potencial patogênico para ninfas de D. citri. Para seedlings, os valores de mortalidade passaram de 80% para as estirpes S1302 e S1450. Foram observados esporos e células vegetativas de B. thuringiensis subsp. kurstaki expressando green fluorescent protein (Btk::GFP), visualizados por microscopia de fluorescência, aderidos principalmente aos elementos de vasos e no xilema, obtidas de amostras seccionadas transversal e longitudinalmente, de caule e raiz de seedlings e mudas de laranjeira Pera. A CL50 e CL80 para a estirpe S1302 foi de 4,92 × 104 esporos/mL e 6,63 × 107 esporos/mL, respectivamente. Já para a estirpe S1450, 50% de mortalidade das ninfas testadas foi estimada em 2,19 × 104 esporos/mL, e a CL80 foi de 6,18 × 108 esporos/mL, quando utilizadas suspensões de esporos da bactéria diretamente no substrato de seedlings de laranjeira Pera. Os ensaios de ligação demonstraram que todas as toxinas Cry presentes nas estirpes S1302, S1450 e S1989 (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2Aa, Cry2Ab2, Cry1B e Cry11) interagiram com os receptores de membrana intestinal, brush border membrane vesicles (BBMV\'s), obtidos de ninfas de D. citri. Ensaios in vivo evidenciaram que as estirpes S1302 e S1450 mostraram-se compatíveis com todos os agrotóxicos comumente utilizados na citricultura, ainda que os produtos à base de cobre e o inseticida Dimetoato tenham sido deletérios em aplicações diretas na bactéria in vitro. Esses dados evidenciam a possibildade do uso de Bt como bioinseticida no manejo integrado do HLB. / Citriculture is one the most important activities of Brazilian agribusiness, and the State of São Paulo being the world\'s leading orange producer and the largest juice exporter. Asian citrus psyllid - ACP (Diaphorina citri) has become one of the most important vectors in the citriculture in recent years, due to the transmission of \'Candidatus Liberibacter asiaticus\' and \'Ca. L. americanus\', bacteria associated with huanglongbing (HLB), the main citrus disease worldwide. Nowadays there are no commercial citrus varieties resistant to HLB, and its management is based on the use of healthy nursery citrus trees, eradication of symptomatic planst from the orchards, and vector chemical control. However, excessive cost and environmental damage due to application of chemical insecticides associated with the possibility of selection of ACP resistant populations, have led researchers to persue alternative strategies for the management of HLB. Our group has contributed with the screening of Bacillus thuringiensis (Bt) strains with potential against ACP. Therefore, our objectives were: (a) to confirm Bt endophytic translocation in citrus seedlings and nursery trees with different scion-rootstock combinations and to evaluate their pathogenicity against D. citri; (b) to estimate the lethal concentration (LC50 and LC80) to D. citri nymphs; (c) to study the interaction between Cry toxins and brush border membrane vesicle (BBMV) of the midgut D. citri nymphs, and (d) to evaluate the compatibility of pesticides with the selected Bt strains. The bioassays with citrus seedlings and nursery trees demonstrated that the Bt strains (Cyt1A, Cry2Aa, Cry4A, Cry10, Cry11, S1302, S1450 and S1989) translocated from roots to young leaves, maintaining their viability and pathogenicity against D. citri nymphs. For the seedlings, we found mortality values up to 80% for strains S1302 and S1450. Btk::GFP spores and vegetative cells were visualized by fluorescence microscopy in citrus seedlings and nursery trees adhered mainly to vessels and xylem, from roots to stems, in cross-section analyses. LC50 and LC80 for strain S1302 were 4.92 × 104 spores/mL and 6.63 × 107 spores/mL, respectively. For strain S1450, 50% mortality of nymphs tested was estimated at 2.19 × 104 spores/mL, and LC80 was 6.18 × 108 spores/mL, when bacterial spore suspensions were applied to citrus seedlings. Binding assays demonstrated that all Cry toxins present in strains S1302, S1450 and S1989 (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2Aa, Cry2Ab2, Cry1B and Cry11) interacted with the BBMV obtained from D. citri nymphs. In vivo assays showed that strains S1302 and S1450 were compatible with all pesticides commonly used in citrus orchards, althoug copper-based pesticides and dimethoate insecticide were incompatible in vitro with Bt strains. Our results demonstrate the potential of using Bt as systemic bioinsecticide in the future in HLB management.

A citricultura se destaca como uma das mais importantes atividades do agronegócio brasileiro, sendo o estado de São Paulo o principal produtor mundial de laranja e o maior exportador de suco concentrado e congelado. O psilídeo dos citros (Diaphorina citri) tornou-se nos últimos anos um dos mais importantes vetores na cultura, devido à transmissão de \'Candidatus Liberibacter asiaticus\' e \'Ca. L. americanus\', bactérias associadas ao huanglongbing (HLB), principal doença da citricultura atual. Uma vez que não há variedades comerciais de citros resistentes ao HLB, seu manejo é baseado no uso de mudas sadias, erradicação de plantas infectadas e pelo controle químico do vetor. No entanto, o custo elevado e os significativos danos ambientais causados pelos inseticidas químicos, associados à possibilidade da seleção de populações de psilídeos resistentes a esses produtos, têm levado à busca por estratégias alternativas de manejo do vetor do HLB que sejam mais adequadas e sustentáveis. Nosso grupo tem tentado contribuir nesse sentido, com a prospecção e caracterização de estirpes de Bacillus thuringiensis (Bt) patogênicos ao psilídeo. Sendo assim, os objetivos deste estudo foram: (a) Confirmar a capacidade endofítica e a patogenicidade de estirpes de Bt em seedlings e mudas de citros com diferentes combinações de copa/porta-enxerto; (b) Determinar a concentração letal (CL50) necessária para ocasionar mortalidade em populações de D. citri; (c) Estudar a interação entre toxinas Cry e receptores de membrana do intestino de ninfas e (d) Avaliar a compatibilidade das estirpes selecionadas com agrotóxicos comumente utilizados na citricultura. Os bioensaios realizados com seedlings e mudas de citros demonstraram que as estirpes de Bt (Cyt1A, Cry2Aa, Cry4A, Cry10, Cry11, S1302, S1450 e S1989) translocaram endofiticamente nas plantas, mantendo sua viabilidade e, em sua maioria, o potencial patogênico para ninfas de D. citri. Para seedlings, os valores de mortalidade passaram de 80% para as estirpes S1302 e S1450. Foram observados esporos e células vegetativas de B. thuringiensis subsp. kurstaki expressando green fluorescent protein (Btk::GFP), visualizados por microscopia de fluorescência, aderidos principalmente aos elementos de vasos e no xilema, obtidas de amostras seccionadas transversal e longitudinalmente, de caule e raiz de seedlings e mudas de laranjeira Pera. A CL50 e CL80 para a estirpe S1302 foi de 4,92 × 104 esporos/mL e 6,63 × 107 esporos/mL, respectivamente. Já para a estirpe S1450, 50% de mortalidade das ninfas testadas foi estimada em 2,19 × 104 esporos/mL, e a CL80 foi de 6,18 × 108 esporos/mL, quando utilizadas suspensões de esporos da bactéria diretamente no substrato de seedlings de laranjeira Pera. Os ensaios de ligação demonstraram que todas as toxinas Cry presentes nas estirpes S1302, S1450 e S1989 (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2Aa, Cry2Ab2, Cry1B e Cry11) interagiram com os receptores de membrana intestinal, brush border membrane vesicles (BBMV\'s), obtidos de ninfas de D. citri. Ensaios in vivo evidenciaram que as estirpes S1302 e S1450 mostraram-se compatíveis com todos os agrotóxicos comumente utilizados na citricultura, ainda que os produtos à base de cobre e o inseticida Dimetoato tenham sido deletérios em aplicações diretas na bactéria in vitro. Esses dados evidenciam a possibildade do uso de Bt como bioinseticida no manejo integrado do HLB. / Citriculture is one the most important activities of Brazilian agribusiness, and the State of São Paulo being the world\'s leading orange producer and the largest juice exporter. Asian citrus psyllid - ACP (Diaphorina citri) has become one of the most important vectors in the citriculture in recent years, due to the transmission of \'Candidatus Liberibacter asiaticus\' and \'Ca. L. americanus\', bacteria associated with huanglongbing (HLB), the main citrus disease worldwide. Nowadays there are no commercial citrus varieties resistant to HLB, and its management is based on the use of healthy nursery citrus trees, eradication of symptomatic planst from the orchards, and vector chemical control. However, excessive cost and environmental damage due to application of chemical insecticides associated with the possibility of selection of ACP resistant populations, have led researchers to persue alternative strategies for the management of HLB. Our group has contributed with the screening of Bacillus thuringiensis (Bt) strains with potential against ACP. Therefore, our objectives were: (a) to confirm Bt endophytic translocation in citrus seedlings and nursery trees with different scion-rootstock combinations and to evaluate their pathogenicity against D. citri; (b) to estimate the lethal concentration (LC50 and LC80) to D. citri nymphs; (c) to study the interaction between Cry toxins and brush border membrane vesicle (BBMV) of the midgut D. citri nymphs, and (d) to evaluate the compatibility of pesticides with the selected Bt strains. The bioassays with citrus seedlings and nursery trees demonstrated that the Bt strains (Cyt1A, Cry2Aa, Cry4A, Cry10, Cry11, S1302, S1450 and S1989) translocated from roots to young leaves, maintaining their viability and pathogenicity against D. citri nymphs. For the seedlings, we found mortality values up to 80% for strains S1302 and S1450. Btk::GFP spores and vegetative cells were visualized by fluorescence microscopy in citrus seedlings and nursery trees adhered mainly to vessels and xylem, from roots to stems, in cross-section analyses. LC50 and LC80 for strain S1302 were 4.92 × 104 spores/mL and 6.63 × 107 spores/mL, respectively. For strain S1450, 50% mortality of nymphs tested was estimated at 2.19 × 104 spores/mL, and LC80 was 6.18 × 108 spores/mL, when bacterial spore suspensions were applied to citrus seedlings. Binding assays demonstrated that all Cry toxins present in strains S1302, S1450 and S1989 (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2Aa, Cry2Ab2, Cry1B and Cry11) interacted with the BBMV obtained from D. citri nymphs. In vivo assays showed that strains S1302 and S1450 were compatible with all pesticides commonly used in citrus orchards, althoug copper-based pesticides and dimethoate insecticide were incompatible in vitro with Bt strains. Our results demonstrate the potential of using Bt as systemic bioinsecticide in the future in HLB management.