Cette thèse porte sur la conception et la réalisation d'un microsystème d'éjection matriciel monolithique pour la fonctionnalisation in-situ des puces à ADN. L'objectif est de développer un système flexible, peu onéreux et performant, permettant le dépôt localisé de micro-gouttes de réactifs (nucléotides en solution dans l'acétonitrile) afin de synthétiser les séquences d'oligonucléotides in-situ. Les avantages d'un tel système sont le faible coût de l'équipement, une grande fléxibilité dans le choix des séquences synthétisées et la possibilité de réaliser des puces à forte densité d'unités d'hybridation. L'éjection par actionnement thermique a été retenue. Le principe s'inspire du jet d'encre thermique mais l'originalité vient du fait que les éjecteurs sont disposés de façons matricielle avec une très grande densité et sont actionnables individuellement. La structure retenue intègre une résistance chauffante sur une membrane diélectrique et une buse d'éjection réalisée en résine photosensible Su8. Ces caractéristiques permettent d'atteindre localement des températures suffisamment élevées pour provoquer une ébullition localisée autour de la buse déjection. Un procédé technologique original a été mis au point pour intégrer le dispositif d'adressage à cette résistance. Il s'agit de diodes réalisées dans la résistance en polysilicium. Ces diodes sont obtenues par diffusion et implantation de zones N et P. La tension de seuil et le courant de fuite de ces diodes ont été paramétrés en fonction des dopages mis en Suvre de façon à ce que seul le micro-éjecteur actionné ne chauffe. Les matrices réalisées ont été caractériésées électriquement et thermiquement ; il a été ainsi montré que l'adressage est opérationnel, la puissance thermique offerte est suffisante pour l'éjection. Il a été montré que des gouttelettes de 0,1pl à 3nl pouvaient être éjectées lorsque la tension d'alimentation varie entre 25V et 5V et l'impulsion électrique d'alimentation entre 50µs et 50ms.

La glycomique est la science qui s’intéresse à l’étude structurelle et fonctionnelle des saccharides,également appelés hydrates de carbone (ou carbohydrates). Les saccharides (aussi appelés glycanes dans ce cas) sont impliqués dans un très grand nombre d’évènements biologiques « normaux » et/ou pathologiques. Les relations entre la structure du saccharide et ses fonctions biologiques sont étudiées à l’aide de techniques conventionnelles telles que la cristallographie, la RMN, l’ITC, la plasmonique de surface. Ces études sont longues et couteuses et restent souvent limitées du fait de la très grande diversité des structures saccharidiques et de la difficulté à obtenir des saccharides pures en quantité importante.Pour pallier ces difficultés, nous proposons d’adapter la technologie biopuce qui permet d’effectuer un nombre très élevé d’études en parallèle (High Throughput Screening) avec des quantités réduites de matériels biologiques ou biochimiques.Cette thèse vise donc le développement de puces à sucres (ou glycoarray, carbohydrate array) avec deux principales innovations : 1) l’utilisation comme sondes de glycomimétiques qui miment les hydrates de carbone naturels mais dont la synthèse est plus aisée ; 2) l’immobilisation des sondes glycomimétiquessur la puce via l’hybridation d’ADN.La synthèse à façon des glycomimétiques permet d’obtenir des sondes de structures et de naturechimique diverses et offre la possibilité d’ajouter pour chaque type de sondes une étiquette ADN pour d’une part immobiliser les glycomimétiques de manière orientée sur la puce par DDI (DNA DirectedImmobilisation) et d’autre part localiser et identifier les glycomimétiques sur la puce. Ces glycomimétiques ont été synthétisés par l’Institut des Biomolécules Max Mousseron de Montpellier en collaboration avec l’Institut de Chimie et Biochimie Moléculaire et Supramoléculaire de Lyon.Une première partie de ce travail a été de valider l’élaboration des puces à sucre puis d’augmenter les capacités d’analyses des glycoarrays basés sur la DDI. Pour cela l’efficacité de l’immobilisation par DDIa été comparée à une immobilisation covalente. Nos résultats ont montré une reconnaissance supérieure par la lectine RCA 120 de glycomimétiques immobilisés par DDI aux faibles concentrations englycomimétiques. La miniaturisation de la puce a consisté à graver 40 microréacteurs sur un format lame de microscope. Chaque microréacteur formant une puce de 64 plots différents, on peut ainsi réaliser 40expériences indépendantes. Grâce à ce type de glycoarrays, des tests d’IC50 ont permis d’obtenir des données quantitatives de l’affinité des glycomimétiques/lectines en utilisant d’infimes quantités de matériels biologiques. D’autre part, nous avons démontré la possibilité d’accélérer les études d’interactions sucres/lectines en poolant simultanément 8 glycomimétiques et 2 lectines.La deuxième partie de la thèse a été d’utiliser les glycoarrays pour étudier les paramètres structuraux(distribution spatiale, nature chimique de la molécule, charge…) permettant d’exacerber l’affinitélectines/glycomimétiques. Trois lectines ont été étudiées : RCA120 (lectine modèle d’origine végétale) et deux lectines PA-IL et PA-IIL facteurs de virulence de la bactérie Pseudomonas aeruginosa. Trois typesd’architectures de glycomimétiques (en peigne, en antenne et en couronne) ainsi que l’effet de la charge portée (+, -, neutre) ont été étudiés. L’architecture en peigne a clairement montré une affinité supérieure vis-à-vis des 2 lectines (PA-IL et PA-IIL) et PA-IL marque une préférence pour les structures chargées positivement. Soulignons que les interactions monovalentes sucres/lectines sont souvent faibles (mM). [...] / No abstract

Dans le contexte de l'étude pan-génomique de données d'expression des gènes (transcriptome), différents outils existent déjà. Parmi eux, les techniques de réduction de dimensionnalité cherchent les formes remarquables et les composants importants du système qui peuvent aider à résumer les données. Au cours de ma thèse, j'ai étudié en profondeur les différentes techniques existantes dans ce domaine. Nous avons ensuite développé notre propre approche basée sur la combinaison de la décomposition en valeurs singulières (Singular Value Decomposition) et le Multidimensional Scaling. Nous avons prouvé son utilité et sa précision. En plus des outils d'analyse de données spécifiques à l'étude de l'expression des gènes, nous avons développé un logiciel qui permet de correler l'expression des gènes à des réseaux d'interactions protéine-protéine. Et ceci afin de lier l'information sur l'expression des gènes à celle des interactions entre protéines (protéome) qui ont lieu au sein de la cellule. Tous les outils venant d'être décrits et de nombreux autres ont été utilisés afin d'analyser différent types de données biologiques. La première application a été de corréler l'expression d'auto-anticorps et de cytokines dans le corps humain lors d'une infection au paludisme. Nous avons déterminé des marqueurs spécifiques du paludisme cérébral, permetant à termes de prévenir et détecter plus tôt la maladie. La plus grande analyse que nous avons réalisé visait à définir le profil du transcriptome des cellules T régulatrices (Treg). Ces cellules sont détruites au cours d'une infection par le VIH, une bonne caractérisation moléculaire de celles-ci permettrait par exemple de mieux suivre l'évolution des Treg au cours des traitements pour le SIDA. Parmi les nouveaux marqueurs moléculaires de Treg que nous avons étudié, un nouveau facteur de transcription FOXLF a été découvert, qui pourrait jouer un rôle important dans l'apparition du caractère de "regulation" chez les Treg.

L’ARN polymérase dépendante d’ADN (RNAP) est une enzyme responsable de la polymérisation de ribonucleotides dans une séquence d'ARN complémentaire de l'ADN de matrice. La famille de RNAP a plusieurs membres, comme de protéines sous-unité unique (par exemple du bactériophage T7) ou multiple sous-unité (bactériennes et eucaryotes). Transcription de l'ARN - un événement crucial dans l'expression des gènes - varie en fonction de l'origine de RNAP. Bien que le processus de transcription est relativement bien caractérisée, de nombreux éléments restent mal compris, surtout par rapport à la dynamique de la reconnaissance de promoteur, d'évasion et de l'allongement dans une contexte de cellule où la densité moléculaire, les concentrations et les effets plus proches environs sont importants. L'objectif de cette thèse était la développement d’une méthode qui permettrait suivre la réaction RNAP in vitro en temps réel dans des conditions très contrôlées. Un axe majeur a été mis pour développer un biocapteur basé surface qui permettrait à la caractérisation des principales étapes de la réaction de transcription. Par conséquent, les interactions entre des molécules d'ADN immobilisés sur une surface du capteur et RNAP libre délivré par un système microfluidique de la surface ont été examinées. Changements de l'indice de réfraction, corrélés avec les changements de masse sur la surface ont été suivis en utilisant l'imagerie par résonance de plasmon de surface (SPRi). SPRi est une technique sensible dédiée à l'analyse des interactions entre deux ligands en temps réel. Les bases du mécanisme sont la détection de légères différences dans la réflexion de la lumière polarisée à un angle fixe qui est associé avec une variation de masse à l'interface. Les données obtenues à partir SPRi sont utilisées pour déterminer la cinétique des interactions. Géométrie d’ADN puces permet de suivre plusieurs échantillons simultanément, qui raccourcit considérablement le temps que de manipulation et améliore la qualité et la reproductibilité des résultats obtenus. Autres biocapteurs optofluidique: résonateur de microring et microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF) ont été développés en parallèle. Nous avons biofunctionalisé et caractérisé des surfaces de capteur (de verre couvert de polymère pour un résonateur de microring et la microscopie TIRF et 50 nm couche mince d’or sur des prismes de SPRi) afin d'immobiliser ADN d'une manière contrôlée, par création d’une monocouche auto-assemblée (SAM). Fonctionnalisation de polymères SU-8 concernées deux méthodes: covalent immobilisation de (bio) molécules et la conjugaison non covalente sur la base de couplage hydrophobe. Pour la fonctionnalisation de surface d’or, quatre stratégies différentes d'immobilisation des molécules ont été comparés: formation de la liaison de thiol - or, la formation des liaisons amide, interactions extrAvidin - biotine et le couplage hydrophobe. Les études de la conjugaison de l'ADN à la surface d'or fonctionnalisé ont été effectuées en ce qui concerne la spécificité et la densité d'ADN immobilisées de longueurs différentes: 50, 500 et 1000 pb. Enfin, les surfaces biofunctionalized ont été utilisées pour suivre en temps réel des réactions de transcription de deux RNAP: bactériophage T7 RNAP monomère et l'holoenzyme d'Escherichia coli RNAP. Les analyses cinétiques de la formation d’un complexe nucléoprotéine et la transcription d'ARN ont été fait par report de la densité et la longueur de l'ADN immobilisé, la position de la séquence du promoteur spécifique. Transcription de l'ARN dans l'appareil SPRi a été confirmée par la collection, la détection et l'analyse des produits ARN.L'objectif final comprends une synthèse de l'ARN contrôlée qui serait une étape intermédiaire d'enquêter en temps réel la production de protéines in vitro. / DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) is an enzyme responsible for the polymerization of ribonucleotides into an RNA sequence complementary to the template DNA. RNAP family has several members being single subunit (e.g. T7 bacteriophage) or multi subunit (bacterial and eukaryote) proteins. RNA transcription – a crucial event in gene expression – differs depending on the RNAP origin. Although the transcription process is relatively well characterized, many elements remain poorly understood, especially with respect to the dynamics of promoter recognition, escape and elongation in a cell like context where molecular density, concentrations and nearest neighbour effects are prevalent.The goal of this thesis was to develop a robust method that would allow real time monitoring of RNAP reaction in vitro in thoroughly controlled conditions. A major axis was to develop a surface-based biosensor that would allow the characterization of the main steps of the transcription reaction. Consequently, interactions between DNA molecules immobilized on a sensor surface and free RNAP delivered through a microfluidic flow system to the surface were examined. Changes in refractive index, correlated with changes in mass at a surface were followed using surface plasmon resonance imaging (SPRi). SPRi is a sensitive technique dedicated to analysis of interactions between two ligands in real time. The mechanism bases on the detection of slight differences in the reflectivity of polarized light at a fixed angle that are associated with a mass variation at the interface. Data obtained from SPRi are used to determine the kinetics of the interactions. Microarray geometry of SPRi allows monitoring several samples simultaneously that significantly shortens manipulation time and improves a quality and reproducibility of obtained results. Other label-free optofluidic biosensors: microring resonator and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy were developed in parallel.We firstly biofunctionalized and characterized sensor surfaces (polymer coated glass for microring resonator and TIRF microscopy and 50-nm thin layer gold coatings on glass prisms for SPRi) in order to immobilize DNA strands in a controlled manner, using a self-assembled monolayer (SAM). Functionalization of photoresist polymer SU-8 concerned two methods: covalent (bio)molecule grafting and non-covalent conjugation based on hydrophobic coupling. Regarding gold surface functionalization, four different strategies of antifouling (bio)molecule immobilization were compared: thiol – gold bond formation, amide bond formation, extrAvidin – biotin interactions and hydrophobic coupling. Studies of DNA conjugation to the functionalized gold surface were performed with respect to specificity and density of immobilized DNA molecules of different lengths: 50, 500 and 1000 bp.Finally, biofunctionalized surfaces were used for real time monitoring of transcription reactions using two RNAPs: monomeric bacteriophage T7 RNAP and the holoenzyme of Escherichia coli RNAP. Kinetic analyses of nucleoprotein complex formation and RNA transcription were performed as a function of immobilized DNA density, the length of the immobilized DNA, the position of the specific promoter sequence with respect to the point of immobilization and the direction of subsequent transcription. RNA transcription in the SPRi apparatus was confirmed by collection, detection and analysis of relevant products.The future development of biosensors dedicated to in vitro gene expression will include the adaptation of the methods presented above to other optofluidic systems and further development of the technique. The final goal comprises a controlled RNA synthesis that would be an intermediate step to investigate real time in vitro protein production.