Aquesta Tesi Doctoral presenta l’estudi de degradació de dues classes de retardants de flama bromats (els difenilèters polibromats (PBDEs) i els bromofenols) mitjançant tècniques espectroscòpiques, cromatogràfiques i quimiomètriques. S’ha estudiat dos tipus de degradació: la fotodegradaciói la biodegradació. A més dels estudis específics d’aquests processos, s’ha treballat en la revisió de metodologia existent i en el desenvolupament de nous procediments per a la interpretació d’informació procedent de dades ambientals relacionades amb la presència i destí de contaminants bromats. ESTUDIS DE FOTODEGRADACIÓ Pel que fa als estudis de fotodegradació, s’ha proporcionat una metodologia de seguiment experimental (cromatogràfic i espectroscòpic), tractament quimiomètric i interpretació de resultats vàlida per a la investigació de qualsevol procés de fotodegradació. Per al tractament de les dades s’ha suggerit el mètode de resolució multivariant de corbes per mínims quadrats alternats amb modelització flexible (MCR-ALS) i amb modelització híbrida (HS-MCR), que permeten l’estimació dels perfils de concentració i dels espectres purs dels diferents productes de degradació, així com de les constants de velocitat associades al procés. S’ha comprovat també que l’ús de nous acoblaments cromatogràfics (HPLC-DAD-MS) i cromatogràfic/espectroscòpic són una eina poderosa per a l'estudi general de processos de fotodegradació. Aquests acoblaments han permès obtenir una descripció completa de la cinètica dels processos de fotodegradació amb tots els passos successius, constants cinètiques i fotoproductes formats. A partir de la metodologia proposada s’ha pogut presentar una descripció del procés de fotodegradació del DecaBDE i de sis bromofenols, així com avaluar l’efecte de diversos factors (polaritat en el solvent, grau de bromació, font de radiació...) en la cinètica i en la natura dels productes formats en aquests processos. Pel que fa al procés de fotodegradació del DecaBDE, s’ha observat que és un sistema complex en el qual hi ha involucrats un gran nombre de productes. S’ha postulat que el DecaBDE es pot transformar en compostos més tòxics, com congèneres amb un nombre menor de broms i dibenzofurans. Per tant s’adverteix de l’impacte ambiental i de l’amenaça per la salut pública de l’ús d’aquest compost. S’ha observat, a més, que en augmentar la polaritat del solvent disminueix la velocitat de fotodegradació del DecaBDE. Pel que fa als processos de fotodegradació dels sis bromofenols de diferent grau de bromació, s’ha observat que són també sistemes molt complexos i donen lloc un nombre elevat de fotoproductes. S’ha suggerit que aquests processos presenten mecanismes de reaccions paral•leles o de segon ordre o superior. S’ha detectat que la desbromació gradual és la principal via de la fotodegradació dels bromofenols. A més, s’ha identificat també la possible formació de bezenones i hidroxibenzens bromats entre els productes de fotodegradació. S’ha observat que el brom en posició para fa augmentar la velocitat de fotodegradació i que en incrementar el grau de bromació també augmenta lleugerament la velocitat de degradació. Finalment, s’ha observat que el principal efecte de les diferents fonts de llum està vinculat a la velocitat del procés de fotodegradació, però no a la identitat dels fotoproductes formats. S’observa que com més energètica és la radiació utilitzada, més alta és la velocitat de degradació. ESTUDIS DE BIOTRANSFORMACIÓ Per altra banda, amb la finalitat de tenir un coneixement més ampli sobre el destí ambiental del DecaBDE s’ha estudiat la seva biodegradació. D’una banda, s’ha proposat una nova metodologia d’anàlisi mitjançant cromatografia de líquids amb espectrometria de masses en tàndem per a la determinació de possibles productes de biodegradació dels PBDEs (els seus derivats hidroxilats, els OH-PBDEs) i d’altra banda s’ha estudiat la biodegradació in vitro del DecaBDE mitjançant microsomes de fetge de rata. S’ha observat una disminució de la quantitat del compost original durant la biodegradació, la qual cosa significa que es produeix biotransformació. No obstant això, no s’ha pogut detectar cap producte de biodegradació. Es creu que els metabòlits del DecaBDE poden tenir una possible interacció amb els components cel•lulars, que fa més difícil la seva detecció en les condicions experimentals de la metodologia utilitzada. / This thesis presents the study of degradation of two classes of brominated flame retardants (polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and bromophenols) by means of spectroscopic, chromatographic and chemometric methods. We studied two types of degradation: photodegradation and biodegradation Photodegradation Study A general procedure for the study of complex photodegradation processes of environmental pollutants based on chromatographic and spectroscopic monitoring and chemometric method is proposed. Multivariate curve resolution-alternating least squares (MCR-ALS) has been used to resolve concentration profiles and pure spectra of species involved in the photodegradation process and, hence, to elucidate the photodegradation mechanism and to propose the chemical structure of the main photoproducts. In this work are also proposed new data fusion structures (chromatographic (HPLC-DAD-MS) and HPLC /spectroscopy) and related analysis tools that improve the capability to identify the photoproducts formed and the accuracy in the description of the mechanism driving the photodegradation process Based on the proposed methodology a description of the process of photodegradation of decaBDE and six bromophenols and an evaluation of the effect of various factors (solvent polarity, degree of bromination, radiation source ...) on the kinetics and nature of the products formed have been provided. Biotransformation Study In order to have better knowledge about the environmental fate of DecaBDE we have also studied their biodegradation. On the one hand, we have proposed a new methodology for the analysis and determination of possible biodegradation products of PBDEs (hydroxylated derivatives, the OH-PBDEs) by means of liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Furthermore we studied the in vitro biodegradation of DecaBDE using rat liver microsomes. Decrease in the amount of original compound during biodegradation was observed, which means that biotransformation occurs. However, biodegradation products were not detected. This indicates that DecaBDE metabolites may have a potential interaction with cellular components, which makes it difficult to detect under the experimental conditions of the methodology used.

Los genes MSN2 y MSN4 de la levadura Saccharomyces cerevisiae fueron aislados como supresores en multicopia de mutaciones termosensibles en el gen de la proteína quinasa Snf1p, necesaria para la desrepresión de genes reprimidos por catabolito. Las proteínas Msn2p y Msn4p están funcionalmente relacionadas. Ambas contienen dos dedos de cinc del tipo Cys2-His2, que guardan una gran similitud con los encontrados en las proteínas de Respuesta Temprana al Crecimiento de mamíferos, la proteína del tumor de Wilms, y el represor de levadura Mig1p. Msn2p y Msn4p son capaces de actuar como activadores transcripcionales, pero cuando se inició este trabajo se desconocía su función fisiológica. Durante la caracterización fenotípica del doble mutante msn2 msn4 se observó que esta cepa era sensible a la ausencia de fuente de carbono. Al extender el estudio a otras condiciones de estrés severo, como el estrés térmico, el estrés osmótico o el estrés oxidativo, se observó en todos los casos una mayor sensibilidad de la cepa mutante respecto a la cepa silvestre. Por el contrario, la sobre-expresión de los genes MSN2 y MSN4 produce un aumento de la resistencia celular a las condiciones de estrés. En la cepa msn2 msn4 se encontraron defectos en la expresión de genes de respuesta a estrés, como HSP12, HSP26, CTT1 y DDR2. Estos genes tienen en común la presencia en sus promotores de varios Elementos de Respuesta General a Estrés (STRE). En Saccharomyces cerevisiae, el elemento STRE (consenso: CCCCT ó AGGGG) puede mediar la activación transcripcional en respuesta a múltiples estreses, entre ellos el choque térmico, el estrés osmótico, el estrés oxidativo, el pH ácido, la presencia de ácidos débiles, o el ayuno de fuente de carbono o nitrógeno. Al analizar la expresión regulada por STRE, mediante una fusión STRE-LEU2-lacZ, en el mutante msn2 msn4, se pudo comprobar que en ausencia de las proteínas Msn2p y Msn4p los niveles de expresión basal vía STRE están muy reducidos, y la activación transcripcional en diversas condiciones de estrés se encuentra prácticamente abolida. Por otra parte, la sobre-expresión de los genes MSN2 y MSN4 produce activación de la expresión dependiente de STRE incluso en condiciones de ausencia de estrés. Msn2p y Msn4p se requieren para una correcta regulación de la respuesta mediada a través de este elemento. Se demostró que estas proteínas se unen directamente al elemento STRE mediante la técnica de retardo en gel: las proteínas Msn2p y Msn4p, purificadas o presentes en extractos totales de proteína, se unen in vitro, de forma específica, a elementos STRE presentes en oligonucleótidos sintéticos. Además, mediante análisis de footprinting in vivo con DMS se demostró que existe unión in vivo de estas proteínas a los elementos STRE presentes en diversos promotores de Saccharomyces cerevisiae. Por ello proponemos que Msn2p y Msn4p son los Factores de Unión a STRE (STRF), que no habían sido identificados con anterioridad. En el segundo capítulo de este trabajo analizamos las causas de un hecho observado en la cepa silvestre W303-1A. La transferencia brusca de células silvestres en fase exponencial de crecimiento en glucosa a un medio con rafinosa produce una larga parada del crecimiento, durante el cual las células no son capaces de sintetizar suficiente cantidad de invertasa. Se demostró que durante las primeras horas de cambio de medio, aunque el gen que codifica la invertasa, SUC2, se desreprime normalmente, la privación brusca de glucosa produce en las células de levadura un bloqueo de la traducción, el cual impide que se exprese el enzima. En este proceso no parecen estar implicadas la proteína quinasa dependiente de AMP cíclico ni la proteína quinasa Gcn2p. / The Saccharomyces cerevisiae genes MSN2 and MSN4 encode homologous and functionally redundant Cys2Hys2 zinc finger proteins. A disruption of both MSN2 and MSN4 genes results in a higher sensitivity of yeast cells to different stresses, including carbon source starvation, heat shock and severe osmotic and oxidative stresses. In this work we show that Msn2p and Msn4p are required for the activation of several yeast genes such as CTT1, HSP104, DDR2 and HSP12, whose induction is mediated through stress-response elements (STREs). Msn2p and Msn4p are important factors for the stress-induced activation of STRE dependent promoters and bind specifically to STRE-containing oligonucleotides. Moreover, by in vivo footprinting we demonstrate that Msn2p and Msn4p bind in vivo to the STREs present in several stress gene promoters. We propose that Msn2p and Msn4p are the previously unknown STRE binding factors, or STRFs.In the second chapter of this work we analyse the causes of an experimentally observed fact: expression of invertase in the yeast Saccharomyces cerevisiae is greatly delayed when derepression occurs in a medium that lacks a usable carbon source. The delay is not a consequence of defects in the transcription of the SUC2 gene but is due to the impossibility of translating the normal levels of mRNA generating under derepressing conditions. In the absence of glucose a complete inhibition of translation occurs, and this causes the lag time before the new carbon source can be used, even if the mRNAs of glucose-repressible genes are transcripted early.

Genetic alterations and deregulation of the epigenetic mechanisms collaborate in the initiation and progression of cancer. In contrast to the genetic defects, the epigenetic abnormalities are potentially reversible. This fact has driven the search for drugs that induce selectively changes in the epigenetic patterns of the tumor cells and thus lead to differentiation, cell death and/or cell growth arrest. Inhibitors of DNA (cytosine-5)-methyltransferases (DNMTs) and inhibitors of Zn(II)-dependent histone deacetylases (HDACs) have been developed with this purpose. The DNMTs inhibitors allow the reactivation of genes, including tumor-suppressor genes, silenced through hypermethylation of the CpG island at their promoter. The HDACs inhibitors allow the reexpression of genes silenced by ypoacetylation of the histones associated at their promoters. Despite all these chemicals have promising effects on cultured cancer cells, many of them have side-effects that limit their use in anticancer chemotherapy. Because of that, we analyzed the properties of the anesthetic procaine (4-aminobenzoic acid 2-diethylaminoethyl ester) as a new inducer of DNA demethylation and we also compared the effects of seven HDACs inhibitors. In both cases, the breast cancer cell line MCF7 was the model system.1. Procaine reduces the proportion of 5-methylcytosine into global genomic DNA, achieving its maximum effect within 24-48 h of treatment. Low concentrations of procaine decrease the amount of 5- methylcytosine at RAR¦Â2 promoter, which is hypermethylated in MCF7 cells, and reactivate its expression with only small decrease in global DNA methylation. This fact could be an advantage, since global DNA hypomethylation leads to chromosomal instability. Finally, procaine reduces cell proliferation and arrests cell cycle in mitosis, but does not induce apoptosis in MCF7 cells after treatments 3 days long.2. The seven inhibitors of Zn(II)-dependent HDACs chosen for comparison were: two carboxylic acids (butanoic and valproic acid); one N-(2¡¯-aminophenyl) benzamide (MS-275); and four hydroxamic acids(trichostatin A, suberoylanilide hydroxamic acid, CX and CY). The results of in vitro HDAC activity assays performed on MCF7 nuclear extracts show the existence of a relationship between the chemical structure of these compounds and their activity: low micromolar concentrations of hydroxamic acids are sufficient for inhibiting almost completely the deacetylase activity, whereas millimolar concentrations of carboxylic acids are required for similar effects. Also the alterations that the drugs cause on cell growth and cell cycle arrest depend on its chemical structure. The IC50 for cell treatments 24 h long is in the range of millimolar concentrations for butanoic and valproic acids and low micromolar for the rest of the chemicals. At the IC50, MS-275 induces cell growth arrest in G1/G0, whereas the hydroxamic acids stop cell cycle mostly at G2/M and the carboxylic acids seems to arrest the cycle at both G1/G0 and G2/M. Despite all these inhibitors induce similar changes in the global acetylation of H4 and H3 when employed at their respective IC50, not all of them are able of reactivate the expression of the same genes. Moreover, it seems that the induced expression levels of CDKN1A and GADD45¦Â determine the alterations induced by the drugs on cell cycle. The changes on histone modifications at the promoters of six genes ( CDKN1A, GADD45¦Â, JunD, IGFBP3, MT1X and MT2A) upon CY treatment were studied. HDACs inhibition induces an increase in histone H4 tetraacetylation and in dimethylation of lysine 4 in H3, as well as a decrease in dimethylation of lysine 9 in H3. Additionally, HDAC2 is released from the promoters upon CY treatment. These changes take place also in the promoters of MT1X and MT2A, the genes whose expression remains unaltered after the treatment with CY. / Las alteraciones genéticas y la desregulación de los mecanismos epigenéticos colaboran en la iniciación y progresión del cáncer. Los defectos epigenéticos son potencialmente reversibles, lo que ha suscitado la búsqueda de fármacos que selectivamente causen cambios en los patrones epigenéticos de las células tumorales, con la consiguiente diferenciación, muerte y/o parada de crecimiento de las mismas. Se han estudiado especialmente inhibidores de metiltransferasas de DNA (DNMTs) e inhibidores de desacetilasas de histonas (HDACs) dependientes de Zn(II). Los inhibidores de DNMTs posibilitan la reactivación de genes silenciados mediante hipermetilación de la isla CpG de su promotor y los inhibidores de HDACs, de genes silenciados vía hipoacetilación de las histonas asociadas a su promotor. A pesar de sus prometedores efectos en cultivos celulares, muchas de estas sustancias presentan inconvenientes que limitan su aplicación en quimioterapia. Por ello, en esta tesis:1. Se ha estudiado por primera vez la capacidad del anestésico procaína para reducir la metilación de DNA genómico y la proliferación de la línea celular MCF7. Procaína reduce la cantidad de 5-metilcitosina en DNA, reactiva genes silenciados por hipermetilación ( RAR¦Â2) e induce parada del ciclo celular en mitosis.2. Se han comparado siete inhibidores de HDACs dependientes de Zn(II): ácido butanoico, ácido valproico, MS-275, tricostatina A (TSA), SAHA, CX y CY. Existe una relación estructura-actividad para los efectos de estas sustancias en ensayos in vitro y en el crecimiento de MCF7. Además, aunque estos inhibidores inducen cambios similares en acetilación global de histonas, no todos reactivan los mismos genes. Los niveles expresión de CDKN1A y GADD45¦Â parecen determinar los efectos de estos compuestos en el ciclo celular. En los promotores de los seis genes estudiados, la inhibición de HDACs aumenta la acetilación de H4 y la dimetilación de la lisina 4 de H3, mientras disminuye la dimetilación de lisina 9 de H3.

Desde 1930 se conoce que ciertos insectos heterópteros pueden atacar los granos de trigo en crecimiento. En Europa, Asia y Norte de África este ataque se ha asociado a ciertas especies de los géneros Aelia y Eurygaster, mientras que en Nueva Zelanda se atribuye a Nysius huttoni. En España, Eurygaster austriaca seabrai y AeIia germari se han identificado como las especies más frecuentes causantes del daño, se conocen comúnmente como garrapatillo, también llamado paulilla o sampedrito.El garrapatillo se alimenta del jugo del grano de trigo en su fase lechosa, segregando unas enzimas proteolíticas, denominadas proteasas que debilitan las proteínas de la harina procedente de esos trigos, alterando las propiedades viscoelásticas de la masa y su calidad panadera. Las proteínas son el constituyente mayoritario de la harina de trigo. Se han clasificado en albúminas, globulinas, gliadinas y gluteninas dependiendo de su solubilidad.No se ha detectado la enzima responsable de producir la degradación proteolítica causada por Aelia y Eurygaster. Únicamente en el caso de Nysius huttoni se ha demostrado que la enzima causante de la degradación de las proteínas son proteasas alcalinas.El método más ampliamente utilizado para la detección de éstos trigos infestados es la determinación de la actividad proteolítica mediante el alveógrafo. Este equipo mide el efecto sobre la extensibilidad de la red de gluten. El objetivo general de la investigación es definir posibles métodos que permitan la detección y cuantificación de forma rápida y sencilla de la actividad proteolítica procedente de la infestación del trigo por insectos heterópteros.Las conclusiones obtenidas, nos muestran que no se han podido aislar las enzimas proteolíticas procedentes de la saliva de los insectos Aelia y Eurygaster responsables de la degradación proteolítica de los trigos. La electroforesis capilar zonal, SE-HPLC, y el índice de gluten permiten detectar la modificación proteica causada por la infestación por garrapatillo. / It has been reported since the 1930s that certain heteropterous insects cause damage to wheat cultivars. These insects (wheat bugs) feed on different stages of developing grain. In Europe, The Middle East and North Africa the insects responsible for bug damage of wheat are species of the genera Eurygaster and Aelia, whilst in New Zealand the attack is attributed to Nysius huttoni. In Spain, the insects that most frequently cause damage are Aelia germari and Eurygaster austriaca.Wheat bugs suck the milky nutrients from the immature grain by piercing it with their mouthparts and injecting their salivary juices, which contain very potent enzymes. The most important and extensively studied of these enzymes are the proteases, since flour from bug-damaged wheat has poor quality. Dough prepared from this flour is very sticky and weak and produces loaves of poor volume and unsatisfactory texture.Extensive research has been done on wheat damaged by N. huttoni. The protease of this insect is of alkaline nature and some inhibitors have been described. Less information is available about the effect caused by the insects Aelia and Eurygaster. Cereal proteins have been first classified on the basis of their solubility into four classes: albumins, globulins, gliadins and glutenins.The aim of the present study was to analyze the extent of Aelia spp. and Eurygaster spp. damage on wheat proteins to help understand the real mechanism of bug action and quantify simple and fast methods to detect de infestation. The conclusions are shown the effect of Aelia spp. and Eurygaster spp. wheat bugs on the protein fractions has been studied by size-exclusion high-performance liquid chromatography (SE-HPLC), free-zone capillary electrophoresis (FZCE). .High-performance capillary electrophoresis (CE) has emerged as a powerful technique in the characterization of cereal proteins, in consequence, FZCE might be a useful tool for rapid determination of bug attack.Gluten Index could be used as both rapid and sensitive technique for the detection of wheat protein modification due to insect attack.

En el cambiante contexto socioeconómico de nuestros días, el panorama general del medioambiente resulta complejo. Se ha producido una mejora, por ejemplo, en la reducción de la contaminación del aire en algunas zonas del planeta, y también un importante avance en la gestión de los recursos hídricos y de la calidad del agua. Pero aún en esa zona correspondiente a los denominados países desarrollados todavía persisten numerosos y diversos problemas. La Química Analítica, junto con otras disciplinas contribuye al conocimiento y posible solución de algunos de estos problemas lo que contribuye a la sostenibilidad.Esta Tesis pretende ser una contribución para solucionar algunos problemas de interés medioambiental en el análisis de agua y de aire haciendo uso de las herramientas que la Química Analítica dispone para ello. Los objetivos de esta tesis se planearon estudiando el contexto científico y legal de la contaminación en agua y aire. Eligiendo algunos analitos de interés para los que se requieran nuevos métodos de análisis. Los analitos han sido seleccionados por ser contaminantes que pueden encontrarse en el medioambiente. Se han tenido en cuenta parámetros de la calidad de las aguas como el amonio y metales, y de la calidad del aire, como algunas aminas alifáticas. Los analitos también han sido elegidos por revertir importancia en la eutrofización de las aguas. La selección de los métodos analíticos se realizó con el fin de mejorar varios parámetros analíticos característicos como: · Sensibilidad y selectividad.· Precisión y exactitud.· Bajo coste y bajo impacto medioambiental.· Simplicidad y tiempo de análisis corto.· Volumen de muestra reducido.Los objetivos específicos de esta Tesis se resumen en:· Mejora de algunos parámetros relacionados con la calidad del agua. Evaluación de la influencia de los protocolos de acondicionamiento de muestras de agua para elementos traza analizados por quimioluminiscencia. Disminución de los límites de detección para amonio y amoniaco obtenidos con la reacción de Berthelot haciendo uso de la espectroscopía de reflectancia difusa. Estimación de la influencia de los ácidos húmicos y detergentes en la determinación de amonio. Elaboración de una guía para la elección del método analítico de amonio más apropiado en función de las necesidades del tipo de agua analizada.· Estudio del impacto de una mina en desuso en el transporte de uranio en el Río Fal, resultado de una estancia de investigación en la Universidad de Plymouth (U.K).· Eutrofización. Puesta a punto de métodos de screening de muestras para detectar la presencia de grupos amino primarios y métodos de screening de aminas alifáticas con cromatografía líquida convencional y cromatografía líquida capilar. También estudia la creación de soportes detectores para alguna de estas aminas.· Desarrollo de sistemas detectores para estudiar la calidad del aire para aminas alifáticas primarias y secundarias. Aplicación al análisis in situ tanto en ambientes laborales como en ambientes exteriores. Esta Tesis, aporta métodos de análisis para algunos contaminantes químicos que pueden encontrarse tanto en el medioambiente como en ambientes laborales, basándose en los requisitos que la ciencia del medioambiente exige a la química analítica. También se determinan especies constituyentes del medioambiente tratando de estudiar su trasporte a través del medio en el cual se encuentran. Las muestras estudiadas han sido, muestras de agua de diversa naturaleza, muestras de aire y de sedimentos.Los métodos propuestos para algunos parámetros de la calidad de las aguas así como para especies causantes de la eutrofización en esta Tesis se han aplicado a diversas muestras de agua residuales, de río, grifo, riego, lluvia, mar, lago y pantano para abarcar una parte de la gran cantidad de muestras de agua que podemos encontrar en el medioambiente. También se estudia el transporte de uranio a través del medio hídrico y en sedimentos como constituyente natural de las aguas. Se proponen metodologías para la determinación de contaminantes ambientales en muestras de aire. Estos métodos pretenden mejorar los ya existentes en cuanto a sensibilidad y selectividad. Además, se busca la posibilidad de realizar análisis semicuantitativos basados en reactivos coloreados para emplear los procedimientos como ensayos o dispositivos de alerta en caso de presencia de agentes químicos contaminantes en el aire ambiental. / This Thesis intends to be a contribution to solve some problems of environmental interest in the analysis of water and of air using the tools that the Analytic Chemistry arranges for it. The objectives of this thesis were planned studying the legal and scientific context of the contamination in water and air. Choosing some analytes of interest for the ones that new methods of analysis are required. Parameters of water quality have kept in mind themselves as the ammonium and metals, and air quality, like aliphatic amines. The analytes have also been chosen by reverting importance in the eutrophication of water. The main contributions of this Thesis have been: Improvement of some parameters related to the quality of the water. Evaluation of the influence of the water samples conditioning protocols for elements outline analyzed by chemiluminiscence. Improved detection limits for ammonium and ammonia obtained with the reaction of Berthelot using diffuse reflectance. Effect of humic acids and surfactants. Guide for the election of the more appropriate method for ammonium determination in function of the needs of the type of water analyzed. To study the impact of a disused mine in uranium transport in river Fal (U.K.). Development of screening methods for samples and amines with HPLC and Capillary LC. Finally, development of detector supports to study the air quality for primary and secondary amines. Application to in-situ determinations in indoor and outdoor air samples.

Esta tesis va dirigida al estudio del acoplamiento microextracción en fase sólida (SPME)-cromatografía. Abarca aspectos poco tratados en la bibliografía como el acoplamiento SPME-cromatografía líquida (CL) convencional y la formación de derivados en la fibra.El primer objetivo específico consiste en el estudio de la configuración SPME sobre fibras y CL convencional, los analitos elegidos fueron aminas alifáticas y anfetaminas. Se demostró la utilidad del reactivo FMOC para su determinación en matrices acuosas y de aire, así como en muestras de orina. Se estudiaron diferentes opciones de acoplamiento SPME-derivatización. En la determinación de anfetaminas, se dedicó una parte a la determinación enantiomérica empleando el reactivo quiral OPA-NAC.El segundo objetivo específico consiste en el acoplamiento SPME-cromatografía de gases (CG) para la determinación de los principales compuestos orgánicos volátiles legislados en materia de aguas. El procedimiento de muestreo se realizó mediante SPME en espacio de cabeza de la muestra como alternativa a la inyección directa, con el fin de evitar las principales dificultades asociadas a la técnica de extracción líquido-líquido, como son las bajas sensibilidad y selectividad.El tercer objetivo específico que se planteó es el acoplamiento SPME en tubo-CL capilar. En el primer apartado se comparan las ventajas y desventajas de este acoplamiento con columna abierta y con columna empaquetada, con la configuración de la SPME sobre fibras-CL convencional para la determinación de triazinas. En el segundo apartado se propone un procedimiento basado en la configuración de SPME en tubo con columna abierta probando dos capilares con distinto diámetro interno y espesor de fase, para llevar a cabo el screening de triazinas y pesticidas organofosforados.Resumiendo, esta tesis contribuye a la reducción de la manipulación de la muestra durante las etapas de extracción y derivatización. Los trabajos desarrollados han supuesto una contribución importante al aplicar la derivatización con distintas metodologías a distintos analitos y muestras. También contribuye a la miniaturización de sistemas, al desarrollo de los acoplamientos SPME-CL, al conocimiento de los métodos de screening de muestras y a la mejora de la sensibilidad para la determinación de triazinas y pesticidas organofosforados mediante SPME en tubo y CL capilar. / The Thesis is about the study of three different couplings between solid-phase microextraction (SPME) and chromatography. The first objective consists of the configuration SPME-on-fibre and conventional liquid chromatography (LC). The analytes selected were aliphatic amines and amphetamines. The utility of the FMOC reagent was successful in water and air determinations. As regards the amphetamines determination, it was studied an enantiomeric analysis using the chiral reagent OPA-NAC.The second objective consists of the configuration SPME-gas chromatography for the determination of the main volatile organic compounds in water legislation. The sampling procedure was carried out in the sample headspace in order to avoid some problems related to the liquid-liquid extraction methodology, such as, poor sensitivity and selectivity.The third objective consists of the coupling in-tube-SPME and capillary liquid chromatography. In the first place, the advantages and disadvantages of this configuration, with an open column and with a packed column, were compared with the configuration of SPME-on-fibre and conventional LC for the determination of triazines. In the second place, the organophosphorous pesticides were determined by means the in-tube-SPME with an open column configuration.To sum up, this thesis is an important contribution to the reduction of the sample preparation.

En primer lugar, se estudió la resolución de mezclas de surfactantes empleando electroforesis capilar (CE) con detección espectrofotométrica. Se desarrolló un procedimiento que permitió separar, caracterizar y determinar mezclas de alquil éter sulfatos y ácidos grasos en productos de limpieza. Además, se resolvieron mezclas de los surfactantes anteriores con el alquilbenceno sulfonato (ABS). Para resolver las mezclas se utilizaron métodos experimentales sencillos, pero también se utilizaron herramientas quimiométricas alternativas. También se desarrolló la separación de otras familias de surfactantes no iónicos y ambiiónicos con el ABS, optimizando las condiciones experimentales y mediante procedimientos quimiométricos que mejoraron la resolución y aseguraron la asignación de los picos a las familias de surfactantes. Se trabajó con otros surfactantes no iónicos muy utilizados en productos de limpieza que son los alcoholes grasos etoxilados. Se desarrolló un estudio acerca de la detección de estos solutos en espectrometría de masas (MS) sin derivatización previa. Se calcularon los factores de respuesta empleando infusión directa de los oligómeros en diferentes medios, en el medio elegido como óptimo se establecieron modelos de predicción de los factores de respuesta. Se demostró la compatibilidad del método de detección con una técnica de separación previa cromatográfica o electroforética. Los alcoholes sin etoxilar mostraron una sensibilidad extremadamente baja que impidió su calibración. Para mejorar la sensibilidad se desarrolló un procedimiento rápido y sencillo de oxidación del grupo alcohol a ácido carboxílico empleando óxido crómico. Para alcoholes grasos sin etoxilar la reacción fue cuantitativa, pero se obtuvieron rendimientos inferiores al 100 % para los alcoholes etoxilados. Esto último, unido a la falta de estándares de los ácidos etoxi-carboxílicos no permitió el uso de este procedimiento para la cuantificación de alcoholes etoxilados. Sin embargo, se demostró la utilidad del método para cuantificar alcoholes grasos no etoxilados en productos cosméticos y de higiene personal. Los alquilpolifosfonatos (APPs) son aditivos que se encuentran en productos de limpieza. Se caracterizaron de forma rápida mediante infusión directa en espectrometría de masas. Se detectaron impurezas cuyas estructuras moleculares mostraban la falta de uno o más grupos fosfonato respecto al compuesto nominal. Con ayuda de estudios de MS2 se explicaron satisfactoriamente todos los caminos de reacción observados. Para garantizar la presencia de impurezas se desarrolló un método de CE-MS. Finalmente, se desarrolló un método de CE acoplado a detección fotométrica indirecta (IPD) para caracterizar de forma rápida y sencilla los APPs. También se mejoró la resolución del método de CE-MS, permitiendo la comparación de los electroferogramas de CE-IPD y CE-MS. La mejora de la resolución permitió identificar nuevas impurezas. El método de CE-MS se aplicó a la determinación de APPs en productos de limpieza de formulación compleja. / The resolution of mixtures of surfactants using capillary electrophoresis (CE) with spectrophotometric detection was studied. A procedure capable to separate, characterise and determine mixtures of alkyl ether sulfates and fatty acids in cleaning products was developed. Mixtures of the previous surfactants with alkyl benzene sulphonates (ABS) were also resolved. In order to resolve the mixtures, simple experimental methods were employed, but also alternative chemometric tools were used. The separation of other nonionic and zwitterionic surfactants with the ABS was also developed optimizing the experimental conditions, and using chemometric procedures that improved the resolution and assured the identification of the peaks to the surfactant class. Fatty alcohol ethoxylated are probably the most important nonionic surfactants. The detection of these surfactants in mass spectrometry (MS) without previous derivatisation was studied. The response factors of the oligomers by direct infusion in several media were examined. In the optimum medium, models of the response factors were established. The MS detection was shown to be compatible with a previous chromatographic or electrophoretic separation. The non ethoxylated alcohol showed an extremely low sensitivity which hindered its calibration. Primary alcohols and alcohol ethoxylates were oxidized to carboxylic acids to enhance sensitivity. The oxidation was quantitative for primary alcohols but the oxidation yield was lower than 100 % for alcohols ethoxylates. Application to the analysis of primary alcohols in cosmetic products was demonstrated. The alkylpolyphosphonates (APPs) are additives present in cleaning products. They were characterised by direct infusion in mass spectrometry. The spectra revealed the presence of impurities with fewer phosphonate groups than those corresponding to the nominal compounds. Using MS2 and MS3 studies the degradation pathways were satisfactorily explained. A CE-MS method was used to guarantee the presence of impurities. Finally, a CE with indirect photometric detection was developed to rapid characterisation of APPs. Also the resolution of the CE-MS method was improved. The CE-MS method was applied to the determination of APPs in cleaning products.

La Tesis Doctoral presenta une studio detallado de las propiedades estructurales y electrónicas de varias familias de análogos tiofénicos del TCNQ mediante la utilización de cálculos químico-cuánticos. Los sistemas estudiados son las moléculas de TCNE, TCNQ, tiofeno-TCNQ y distintos derivados de este último obtenidos por modificación de la estructura del espaciador tiofénico. Las estrategias utilizadas para modificar dicha estructura han sido: (i) extensión del sistema  del anillo de tiofeno por fusión de anillos aromáticos, dando lugar a las moléculas de isotianafteno-TCNQ y su análogo de pirazina, o por introducción de grupos vinílicos; (ii) extensión lineal del esqueleto conjugado del espaciador por repetición de la unidad central de tiofeno, obteniéndose dímeros, trímeros y tetrámeros quinoides, o por fusión de anillos conservando la estructura quinoide; (iii) incorporación de grupos dadores y aceptores de electrones en la misma molécula, para dar lugar a los llamados sistemas "push-pull". Los sistemas estudiados han sido elegidos por el interés que suscitan dentro del campo de los materiales moleculares electroactivos.El objetivo del trabajo de Tesis Doctoral ha consistido en analizar la estructura molecular y electrónica de este tipo de sistemas, haciendo hincapié en la influencia de las modificaciones estructurales sobre las propiedades electrónicas de los compuestos. Concretamente, para cada familia a estudio se ha realizado la caracterización de las propiedades en estado neutro a partir de la obtención de geometrías de equilibrio, la evaluación de la transferencia de carga entre las unidades dadoras y aceptoras y la racionalización de las propiedades vibracionales. Por otra parte, se han calculado propiedades electrónicas tales como la afinidad electrónica, los estados electrónicos excitados y la transferencia de carga fotoinducida, también de los sistemas en estado neutro. Los resultados obtenidos han permitido sistematizar la evolución de las propiedades electrónicas en función de la estructura química, y se ha podido establecer una relación precisa entre ambas. Además, se ha estudiado la evolución de las propiedades estructurales y electrónicas con el proceso de dopado (generación de aniones y cationes), a través de la determinación de estructuras y la asignación de espectros vibracionales y electrónicos.La metodología principalmente utilizada ha sido la teoría del funcional de la densidad, en sus versiones independiente y dependiente del tiempo (DFT y TDDFT, respectivamente). La calidad y validez de los resultados DFT han sido calibradas mediante la utilización de otras aproximaciones metodológicas más precisas (CCSD, CCSD(T) y CASSCF/CASPT2). En general, la aplicación de los métodos de cálculo químico-cuánticos ha permitido racionalizar las propiedades estructurales y electrónicas de las distintas familias de análogos tiofénicos del TCNQ, tanto en estado neutro como reducido, incidiendo especialmente en la influencia que las modificaciones estructurales ejercen sobre las propiedades aceptoras de elctrones (afinidad electrónica, propiedades redox) de dichos compuestos. / The present Doctoral Thesis deals with the theoretical study of the structural and electronic properties of TCNE, TCNQ, thiophene-TCNQ, and its derivatives. Such derivatives result from the modification of the thiophenic spacer in thiophene-TCNQ through different strategies like the extension of the p-system of the thiophene ring by fusion of aromatic rings, leading to the isotianaphthene-TCNQ and its pyrazine analogue molecules, or by introduction of vinylic groups; the linear extension of the quinonoid structure through repetition of the central thiophene moiety, leading to quinonoid dimers, trimers and tetramers, or through annelation of thiophene and benzene rings; and finally, The introduction of electron donor and electron acceptor groups in the same molecule, giving rise to the "push-pull" systems. The molecules studied have been chosen because of their interest in the field of electroactive molecular materials. Density functional theory, in its time-independent and time-dependent versions (DFT and TDDFT, respectively), has been extensively used. The quality and suitability of the DFT procedures have been calibrated by using more accurate methodological approaches (CCSD, CCSD(T), and CASSCF/CASPT2). The quantum-chemical calculations have made possible to rationalize the structural and electronic properties of the different families of thiophenic analogues of TCNQ, in their neutral and reduced states, paying special attention to the influence that the structural modifications have on the electron acceptor properties (electron affinity and redox properties) of these compounds.

Esta tesis doctoral puede considerarse como una aplicación de los fundamentos de la química cuántica en el campo de la química atmosférica. Concretamente, se han empleado algunos de los métodos más comunes de la química cuántica para el estudio de los mecanismos de reacción y algunos parámetros cinéticos y termodinámicos de las reacciones que tienen lugar entre el ozono y diferentes radicales de interés en la química de la troposfera y la estratosfera. Éstos son: el radical amino (NH2), el nitróxido (H2NO), el hidroxilo (OH), el flúor (F), y los óxidos de nitrógeno NO y NO2. De todas estas reacciones, algunas han sido seleccionadas por su implicación en fenómenos atmosféricos de gran importancia como son el smog fotoquímico, en el que la reacción entre el NO y el ozono desempeña un papel primordial y la lluvia ácida, fenómeno en el que la reacción NO2 + O3 da lugar al radical nitrato (NO3) que es el principal precursor del ácido nítrico (HNO3) responsable junto al ácido sulfúrico (H2SO4) de este fenómeno de funestas implicaciones para la biosfera. Otras reacciones, como la reacción NH2 + O3, han sido estudiadas, no ya sólo por su implicación en la química atmosférica, que la tienen, sino porque debido a su naturaleza electrónica permiten la utilización simultánea de métodos basados en una única referencia, como los Coupled Cluster (CC) y otros de tipo multiconfiguracional como el CASSCF y el CASPT2, más adecuados para el estudio de este tipo de sistemas, pero menos asequibles desde el punto de vista computacional. La comparación entre estos dos tipos de métodos químico-cuánticos es deseable, ya que no todos los sistemas, especialmente los de mayor tamaño molecular, que además son los más importantes en términos atmosféricos, son objeto por el momento de un estudio bien fundamentado por parte de los métodos de tipo multiconfiguracional.La aplicación de los métodos químico-cuánticos utilizados en la presente tesis doctoral ha permitido racionalizar la reactividad comparada de todas las reacciones seleccionadas, llevándonos, entre otras, a las siguientes conclusiones:1. La interacción que se establece entre cualquiera de los radicales estudiados y el ozono viene determinada por los orbitales de tipo  de la molécula de ozono.2. El mecanismo único de todas las reacciones estudiadas en el presente trabajo es una abstracción de oxígeno en una única etapa.3. Por último, observamos que la comparación de los resultados obtenidos por medio de la metodología más rigurosa CASPT2, más en consonancia con el carácter multiconfiguracional de las reacciones aquí estudiadas, y los obtenidos por medio de los métodos CCSD(T) y QCISD(T), más asequibles y adecuados para comparar los diferentes sistemas reactivos entre sí, revela que dichas aproximaciones proporcionan resultados satisfactorios, tanto en el cálculo de geometrías como de energías de activación y entalpías de reacción. / This PhD study can be considered as an application of the main concepts of the quantum chemistry to the field of atmospheric chemistry. Some of the most common methods described in quantum chemistry have been applied to study the reaction mechanism and some other thermodynamic and kinetic parameters of the reactions of ozone with some radicals of interest in the chemistry of the troposphere and stratosphere. These radicals are: the amino radical (NH2), the nitroxide radical (H2NO), the hydroxyl radical (OH), the fluorine radical (F), and the nitrogen oxides NO and NO2.Among all these reactions, most of them have been selected because of its implication on some critical atmospheric phenomena such as the photochemistry smog and acid rain. Reactions NO + O3 and NO2 + O3, for example, play an important role in both phenomena, respectively. Other reactions, like the NH2 + O3 reaction, have been selected not only by its implication on atmospheric chemistry, but because they can be studied simultaneously by theoretical methods based on one o more than one electronic configuration. This is due to its particular electronic structure with no more than 15-19 p electrons. The methods employed have been preferably: the Coupled Cluster (CC) and QCI methodologies, based on a single electronic configuration, and the CASSCF andCASPT2 multiconfigurational methods.The results obtained by these two methods have concluded that all reactions with ozone are very fast and take place in a single step. Also, that the interaction of the radical with the ozone molecule is always determined by the  orbitals of the terminal oxygen atom of ozone.

Durante el periodo de disfrute de la Beca Predoctoral de Formación de Personal Investigador de la Generalitat Valenciana, el becario D. Víctor Miguel Ramírez Ramírez ha trabajado sobre el proyecto de Tesis Doctoral correspondiente al estudio teórico de mecanismos de oxidación de interés en química atmosférica, concretamente las reacciones de oxidación de terpenos, isopreno, y compuestos relacionados.Los terpenos estudiados han sido el -pineno, el -pineno y el d-limoneno. Se ha dilucidado el mecanismo de degradación del -pineno iniciado por el radical OH, analizando las posibles vías de reacción, y poniendo especial énfasis en la reacción inicial de ataque del radical oxidante. Se han empleado los métodos de cálculo AM1 (para realizar la exploración preliminar de la hipersuperficie de energía potencial), y el funcional B3LYP. Además, se han realizado cálculos HF y UMP2 para el estudio de la reacción inicial de adición de OH o abstracción de H sobre este monoterpeno. Para el -pineno y el d-limoneno se ha realizado un estudio detallado de la reacción inicial de adición de OH a todos los átomos de carbono, a través de todas las caras posibles, de los dobles enlaces existentes en estas moléculas.Los metodología empleada ha sido el método UMP2 para realizar la optimización de geometrías, y cálculos puntuales QCISD(T) sobre las estructuras optimizadas UMP2, para el refinamiento de la energía potencial.Además de los terpenos mencionados, se ha realizado un estudio del mecanismo de oxidación del isopreno, iniciado por el radical OH, del mismo modo que para el -pineno. Tras una exploración preliminar de la hipersuperficie de energía potencial mediante el método semiempírico AM1, se han estudiado las reacciones de formación concernientes a algunos de los principales productos de degradación, como son la metilvinilcetona, el formaldehído y algunos de los compuestos hidroxicarbonílicos identificados experimentalmente.Sobre la metilvinilcetona, se ha estudiado la reacción de formación de los dos isómeros de la molécula, por medio de cálculos B3LYP y BHandHLYP, y con el método UMP2. También se muestra la reacción de interconversión de ambos isómeros, localizando el correspondiente estado de transición, no descrito hasta el momento.La formación de formaldehído se ha estudiado a partir de la reacción del radical CH2OH con O2. Nuestros resultados muestran la presencia de un estado de transición para la adición inicial de O2 no considerado hasta la fecha para esta reacción. Se han optimizado los puntos estacionarios de la hipersuperficie de energía potencial con los métodos UMP2 y QCISD. Además, se han realizado cálculos puntuales QCISD(T) sobre las geometrías optimizadas QCISD, para refinar los valores de energía potencial.Para el estado de transición TS1 se han hecho cálculos extra a nivel CCSD para la optimización, y cálculos puntuales CCSD(T) sobre la estructura optimizada QCISD. Asimismo, se han realizado cálculos Restricted Active Space SCF (RASSCF), con ayuda del programa MOLCAS.Finalmente, se ha estudiado la evolución de dos radicales dihidroxialquilo, originados como productos de la degradación intermedia del isopreno por el radical OH, resultando en la formación de dos hidroxicarbonilos identificados experimentalmente. La optimización de geometrías se ha realizado con el método UMP2, mientras que se ha utilizado el método QCISD(T) sobre las geometrías UMP2 para refinar los valores de la energía potencial.Además de estos trabajos, el becario D. Víctor Miguel Ramírez Ramírez ha colaborado activamente con otros miembros del grupo de investigación, en el estudio de la reacción entre el radical HCO y el O2, y la reacción entre el compuesto H2NO y el O3.