En el marc d’aquesta tesi s’han desenvolupat tres biosistemes analítics integrats que mostren: 1) la millora substancial que suposa realitzar un procés d’integració, encara que aquest sigui parcial, en el rendiment analític de les metodologies proposades; 2) com la miniaturització, en diferents graus, permet augmentar de forma significativa la robustesa, la sensibilitat o la selectivitat dels sistemes proposats; i 3) noves solucions a la problemàtica comuna dels biosensors i biosistemes analítics consistent en la pèrdua d’activitat de l’element biològic. El primer treball descriu la construcció d’un biosensor amperomètric per a glucosa basat en un biocompòsit de grafit i resina epoxi. L’enzim glucosa oxidasa (GOD) i la sal orgànica conductora tetratiafulvalé-tetracianoquinodimetà (TTF·TCNQ) s’incorporen al compòsit per formar un biosensor renovable. S’avaluen diferents proporcions grafit/TTF·TCNQ/GOD per tal d’optimitzar el sensor pel que fa a les seves prestacions analítiques i posteriorment integrar-lo en un sistema d’anàlisi per injecció en flux (FIA), amb una cel·la dissenyada especialment a tal efecte. Els millor resultats en la determinació de glucosa en begudes refrescants s’obtenen amb una composició de 5% de GOD, 76% de polímer, 9.5% de grafit i 9.5% de TTF·TCNQ. El segon treball descriu el disseny, construcció i avaluació d’un analitzador miniaturitzat basat en la tecnologia de ceràmiques verdes (Low temperature co-fired ceramics, LTCC) per a la determinació de pesticides, que integra una etapa de pretractament mitjançant dos mescladors tridimensionals i un sistema de detecció amperomètrica per mesurar el producte de una reacció d’inhibició enzimàtica. El sistema de detecció s’integra de forma monolítica a la plataforma de fluídica, i consisteix en dos làmines de platí com a elèctrodes de treball i auxiliar, i d’un elèctrode de referència serigrafiat. El sistema és caracteritzat i avaluat satisfactòriament per la determinació de carbofuran a nivell nanomolar. Per últim, es descriu un mètode ultrasensible per determinar toxicitat deguda a pesticides en un lab-on-a-chip de vidre mitjançant la inhibició de l’enzim acetilcolinesterasa immobilitzat sobre partícules magnètiques. S’optimitzen la introducció de forma reproduïble d’una quantitat controlada de partícules modificades amb l’enzim al canal del xip i la seva captura en una zona determinada mitjançant l’ús d’un camp magnètic extern. Aquest procediment permet de forma fàcil i altament reproduïble la renovació del material biosensor després de cada determinació. S’avaluen o optimitzen el potencial de treball per a la detecció selectiva de tiocolina en un elèctrode platí, la reproductibilitat i sensibilitat en la detecció de tiocolina, el voltatge del flux electroosmòtic i el temps de la reacció d’inhibició. S’aconsegueix la determinació del pesticida carbofuran (un dels pesticides carbamats més tòxics) a nivell nanomolar. / Three integrated analytical biosystems have been developed within the scope of this thesis, showing: 1) the substantial improvement in the analytical performance of the proposed methodologies thanks to the Integration process; 2) how miniaturisation provides significant increases of the robustness, sensitivity and selectivity of the proposed systems; and 3) new solutions to the loss of activity of the biological element of biosensors and analytical biosystems. The first work describes how an amperometric glucose biosensor based on graphite and non-conducting epoxy resin biocomposite was constructed. Glucose oxidase (GOD) and the tetrathiafulvalene-tetracyanoquinodimethane (TTF•TCNQ) conducting organic salt were incorporated into the bulk of the composite to form a renewable biosensor. Several graphite-TTF•TCNQ ratios (w/w) were studied in order to select the best biosensor to be integrated in a FIA system for the automated detection of glucose. The optimal amount of GOD in the composite was studied as well. The selection was based on the analytical response of the electrodes. Best results were obtained by an electrode whose composition was 5% GOD, 76% polymer, 9.5% graphite and 9.5% TTF•TCNQ. An especially designed flow amperometric cell was constructed so that the biosensor could be integrated into a FIA system and glucose in beverage samples could be determined. In the second work the design, construction and evaluation of a miniaturized analyser for pesticides determination that integrates a pre-treatment stage, based on two three-dimensional mixers or reactors, and an amperometric detection system to measure the product of an enzymatic inhibition reaction are presented. The detection system was monolithically integrated in the microfluidic platform and it consisted of a screen-printed reference electrode and two platinum sheets, acting as auxiliary and working electrodes, which were embedded within the ceramic structure. The miniaturized system was characterized and successfully evaluated by determining carbofuran at nanomolar level. Finally, in the third work an ultrasensitive method to determine toxicity due to pesticides in a glass lab-on-a-chip by means of enzymatic inhibition of acetylcholinesterase immobilised on magnetic beads is described. The reproducible insertion of a controlled amount of enzyme-coupled magnetic beads inside the chip channel and their immobilisation in a capture region with the aid of a magnetic field has been optimised. This procedure enables the easy renewal of the biosensing material after each determination in a highly reproducible manner. Several operational parameters such as the working potential for the selective detection of thiocholine (TCh) on a platinum disc electrode, the TCh detection reproducibility and sensitivity, the electroosmotic flow driving voltage and the inhibition time were also evaluated or optimised. The detection of carbofuran (one of the most toxic carbamate pesticides) has been achieved down to the nanomolar level.

Este trabajo se centra principalmente en la mejora de las propiedades de los sensores y/o biosensores utilizando nanotubos de carbono y nanopartículas metálicas como plataformas de electrodo. Después de haber considerado varios ejemplos de la literatura, para alcanzar este objetivo se ha decidido integrar las nanopartículas metálicas en la superficie de los nanotubos de carbono para conseguir las ventajas de las propiedades de los dos materiales; por esta razón se han ensayado diversos procedimientos de síntesis de la literatura, y éstos han sido adaptados y optimizados. Esta primera etapa del trabajo tuvo como objetivo encontrar un protocolo sintético fácil y rápido para generar un material nano-híbrido y ha terminado con un protocolo de síntesis eficaz que calificaríamos “one-pot” ya que permite tener el material final deseado sin etapas de purificación intermedias. Por supuesto, el protocolo tiene que modificarse ligeramente dependiendo de las nanopartículas metálicas deseadas. Los materiales nano-híbridos obtenidos se han caracterizado, especialmente a través de microscopía electrónica de transmisión (TEM), pero también a veces con microscopía electrónica de barrido (SEM), después de cada síntesis para verificar si el protocolo estaba funcionando. El siguiente paso ha sido la prueba del material nano-híbrido, aplicándolo a la superficie de un electrodo de epoxy-grafito (mayormente utilizado en nuestro laboratorio) o un electrodo serigrafiado (SPE) para la detección de una biomolécula, tirosina. La prueba mostró resultados notables (Artículo 1), con una clara mejora de la capacidad de detección y la sensibilidad del material nano-híbrido contra el electrodo serigrafiado sin modificación o la modificación con sólo los nanotubos de carbono (sin nanopartículas metálicas). Después de este éxito se prepararon otros materiales nano-híbridos con diferentes nanopartículas metálicas; el objetivo era experimentar en un sistema multi electrodos utilizado en nuestro laboratorio, la lengua electrónica, que se utiliza para la resolución de mezclas de analitos. Un sistema de lengua electrónica no es sólo un conjunto de sensores (que se explicará mejor en la introducción de este trabajo), sino que también necesita una etapa de procesamiento de datos ya que los analitos que participan en el proceso suministran señales similares, por lo que se necesita una interpretación quimiométrica avanzada (en nuestro caso con redes neuronales artificiales). Con el objeto de recoger nuevas variantes, en este caso la utilización de biosensores enzimáticos, parte de este trabajo se ha llevado a cabo en la Universidad de Lund (Suecia), en colaboración con el grupo del Prof. Lo Gorton; de esta manera se ha podido aplicar la parte de procesamiento informático sin tener que preocuparse también de la optimización de los electrodos, ya que en ese grupo ya se habían optimizado los biosensores que podrían ser utilizados para nuestro propósito. Esta colaboración dio lugar a un resultado interesante (Artículo 3 - manuscrito) en los que hemos sido capaces de construir una proof-of-concept de una innovadora lengua bio-electrónica usando variaciones de una enzima específica (celobiosa deshidrogenasa - CDH) como elemento de detección que nunca se había construido antes. El último paso de este trabajo ha sido la integración de los materiales nano-híbridos sintetizados en los sensores para la lengua electrónica utilizada en nuestro laboratorio. Los objetivos de la lengua electrónica han sido los azúcares presentes en bagazo de caña utilizado para la producción de biocombustibles. Los resultados recogidos y la buena predicción del sistema de lengua electrónica han sido excelentes y han sido publicados recientemente (artículo 2), y enseñan una proof-ofconcept de un sistema de trabajo para la resolución de mezclas de azúcares. / This work is mainly focused on the improvement of the properties of sensors and/or biosensors using carbon nanotubes and metal nanoparticles as electrode platform. After having gone through a good amount of literature examples, to reach this goal it has been decided to embed the metal nanoparticles on the carbon nanotubes surface to be able to take advantage of both material properties; for this reason, various synthetic procedures from the literature has been tested, modifying and optimizing them. This first step of the work was aimed to find a facile and quick synthetic protocol to generate a nano-hybrid material and it ended with an effective one-pot synthetic protocol that allows having the final desired material without intermediate purification steps. Of course the protocol has to be slightly modified depending on the desired metal nanoparticles. The obtained nano-hybrid materials have been characterised, especially through transmission electron microscopy (TEM) but also some time with scanning electron microscopy (SEM), after every synthesis to verify if the protocol was working. The next step has been a test of the nano-hybrid material, applying it to the surface of an epoxy graphite electrode (largely used in our lab) or a screen-printed electrode (SPE) for the detection of a biomolecule, Tyrosine. This test showed remarkable results (Article 1) with a clear improvement of the detection ability and sensitivity of the nano-hybrid material against the bare screen-printed electrode or the modification with only carbon nanotubes (without metal nanoparticles). After this success few different nano-hybrid materials have been prepared with different metal nanoparticles with the objective to try them in an electrode array system commonly used in our lab, the electronic tongue system, used for the resolution of mixtures of analytes. An electronic tongue system is not just an array of sensors (this would be better explained in the Introduction of this work), but it also needs a step of data processing since the analytes involved in the process supply very similar results; for this, an advanced chemometric treatment is needed, (in our case using Artificial Neural Networks). With the aim of gathering new variants, in this case the use of enzymatic biosensors, part of this work has been carried out at the Lund University (Sweden) in collaboration with the group of Prof. Lo Gorton; in this way, the computer processing part could be applied without having to worry also of the electrode optimization, since in that group they already had optimized biosensors that could be used for our purpose. This collaboration resulted in an interesting outcome (Article 3 – manuscript) where we have been able to build as a proof-ofconcept a novel bio-electronic tongue with variation of a specific enzyme (cellobiose dehydrogenase – CDH), a sensing element never used before in this manner. The last step of this work has been the integration of the synthesised nano-hybrid materials in the sensors for the electronic tongue used in our lab. The targets of the electronic tongue have been the sugars present in sugarcane bagasse used for the production of bio-fuels. The results collected and the goodness of prediction of the electronic tongue system have been satisfactory and they have been recently published (Article 2), showing a proof-of-concept of a working system for sugar mixtures resolution.

Obtener una alta calidad en la industria farmacéutica es un reto constante que requiere un estricto control y supervisión de los productos manufacturados. La tecnología analítica de procesos (PAT, Process Analytical Technology) propone que esto puede lograrse de una manera óptima y sistematizada mediante el control de calidad en diferentes etapas de manufactura (materias primas, intermedios y producto acabado). La simplicidad y rapidez de la espectroscopía de infrarrojo cercano (NIRS, Near Infrared Spectroscopy) junto con el análisis quimiométrico de datos multivariables ha demostrado su eficacia para la determinación de propiedades físicas y composición química de productos farmacéuticos, y su uso en esta industria se ha incrementado considerablemente en los últimos años. El objetivo de esta Tesis es el desarrollo de métodos NIR para el control de calidad en la industria farmacéutica. Para ello, se propusieron y optimizaron nuevas estrategias de diseño y selección del conjunto de calibración y la mejora de las estrategias de modelado NIR, basado en conceptos como el conocimiento del producto y comprensión del proceso de acuerdo con la filosofía de trabajo PAT. La Tesis consiste en tres casos de estudio de diferentes formulaciones farmacéuticas sólidas. En el primer estudio se evalúan diferentes metodologías para la construcción del conjunto de calibración, y también se propone un nuevo modo de cálculo y adición del espectro. Se evaluó la idoneidad de dichas estrategias para la cuantificación de un principio activo (API, active pharmaceutical ingredient) presente a baja concentración (10 miligramos por gramo). Los principales resultados mostraron la eficacia de esta nueva metodología para el control de calidad de un granulado farmacéutico (producto acabado), y demostró una sobresaliente capacidad en términos de robustez y simplicidad experimental en comparación con otras estrategias evaluadas. El segundo estudio consiste en la optimización del proceso de selección de factores relevantes en la implementación de una metodología novedosa para la preparación del conjunto de calibración. Para ello se calcularon modelos para el control de calidad de una formulación en sus tres etapas de fabricación: polvo, núcleos y comprimidos recubiertos. De los resultados obtenidos en este estudio se confirmó la idoneidad del concepto de espacio del modelo definido por los estadísticos T2 Hotelling y residuales Q para la identificación de muestra anómalas (dentro/fuera del espacio), y para la selección objetiva de los factores a utilizar en la construcción conjunto de calibración. También se corroboró la eficacia del método NIR propuesto para el control de calidad en variadas etapas del proceso. El tercer caso de estudio aborda una problemática en la industria farmacéutica que concierne al análisis NIR de muestras sólidas con tendencia a la segregación de sus componentes. En este estudio se evalúa el área efectiva de escaneado espectral y la representatividad de la porción de muestra analizada. También se propone una alternativa eficaz de análisis por NIR para este tipo de muestras basada en la adquisición de espectros de muestras en movimiento. Los resultados obtenidos en este trabajo confirman la influencia del área escaneada con la representatividad de la muestra analizada y esto, a su vez, a la capacidad predictiva de los modelos de calibración. Este estudio resalta la importancia de la optimización del área de escaneado de superficie previo cálculo del modelo, ya que se confirmó como estos factores influyen en los estadísticos de predicción de los métodos NIR propuestos. Este trabajo presenta una alternativa eficaz para el control de calidad de muestras heterogéneas o con tendencia a segregación. Los métodos propuestos en cada uno de los casos de estudios fueron evaluados de acuerdo con las directrices internacionales y europeas, y representan una contribución a la iniciativa PAT y el desarrollo de metodologías NIR en base a su mejora mediante un mejor conocimiento del producto y una mayor comprensión del proceso. / Accomplish high quality in the pharmaceutical industry is a constant challenge that require strict control and supervision not only from final products but also from all manufacturing steps according to process analytic technologies (PAT) initiative. In recent years, the simplicity and expeditiousness of near infrared spectroscopy (NIRS) together with chemometrics data analysis have substantially fostered its use for the determination of pharmaceutical´s physical and chemical properties. The subject of this thesis is the development of NIR methodologies useful for the quality control for the pharmaceutical industry, proposing and optimizing mainly new strategies for the selection and design of the calibration set and improving NIR methodologies based on product knowledge and process understanding. The thesis consists in three cases of study where different solid pharmaceutical formulations were evaluated. In the first study a new methodology for constructing the calibration set is proposed and its suitability for quantifying an API present in low concentration (10 mg.g-1) was evaluated by comparison with two methodologies broadly known. The main results showed the efficiency and suitability of the calculation ad addition of process spectra methodology for the quality control of a pharmaceutical granulate (final product). This methodology showed an outstanding performance in terms of robustness and operational simplicity in comparison with the other evaluated strategies. The second study consists in the optimization of a novel methodology through the incorporation of statistical parameters for the selection of important factors used, and three calibration models were calculated for the quality control of a formulation in its three manufacturing steps: powder, cores and coated tablets. Based on the results obtained with this study the model space concept was established defined by Hotelling’s T2and Q-residuals statistics for outlier identification – inside/outside the defined space – in order to select objectively the factors to be used in the calibration set construction. Also the efficacy of the proposed methodology for stepwise pharmaceutical quality control was confirmed. This work represented a contribution for the field as a guideline for the implementation of this easy and fast methodology in the pharma industry. A third study case addresses a concern in the pharmaceutical industry regarding samples with tendency of segregation and its analysis by using NIR spectroscopy. In this study the effective scanned area and the sample representativeness is evaluated, and an effective alternative based on spectra acquisition on moving samples is proposed. The results obtained in this work confirmed the influence of the scanned area with the representativeness of the analyzed sample and this, in turn, the performance of the calculated calibration models. This study highlights the importance of the optimization of the surface scanned area since the quality of the methodologies to be developed depends strongly on this factor. This work presents an effective alternative for quality control on samples with tendency to segregate. The proposed methods were evaluated according to the European and international guidelines and represent a contribution to the PAT initiative and the development of NIR methodologies based on its improvement by a better product knowledge and process understanding.

Los (bio)materiales compuestos conductores ((bio)compósitos) han sido en los últimos años, una interesante alternativa en el desarrollo de (bio)sensores amperométricos debido especialmente, a su capacidad de integrar varios materiales de diferente naturaleza, y formar un nuevo material con propiedades físicas, mecánicas y eléctricas muy distintas a los materiales originales que lo constituyen. Los (bio)sensores desarrollados con estos materiales presentan diferentes ventajas analíticas respecto a los conductores puros, que les proporcionan un alto valor añadido como por ejemplo, versatilidad, durabilidad, facilidad de regeneración superficial y de integración, funcionalidad como reservorio de material biológico, etc. Las propiedades eléctricas de los (bio)compósitos y, por tanto, su aplicabilidad analítica, están drásticamente influenciadas por la naturaleza de las partículas conductoras que lo forman, así como, de la cantidad y distribución espacial de las mismas en la matriz del (bio)compósito. Una de las características electroquímicas más importantes que poseen estos materiales, es la similitud en su comportamiento electroquímico respecto a (bio)sensores desarrollados con haces de microelectrodos. La presencia de áreas conductoras separadas por áreas no conductoras en la superficie del electrodo, mimetiza la distribución más o menos ordenada de microelectrodos separados entre sí por un aislante eléctrico. Las características de respuesta de los haces de microelectrodos dependen fundamentalmente, de las dimensiones y separación entre sí de los microelectrodos. De manera, que una apropiada optimización de la separación de las partículas conductoras y de su distribución interna en los (bio)compósitos desarrollados permitiría mejorar la eficacia analítica de los (bio)sensores basados en (bio)compósitos. En el trabajo de investigación presentado en esta tesis, se han implementado un conjunto de técnicas instrumentales que, aplicadas de forma estratégica y sistemática, han permitido la caracterización y optimización de la composición de (bio)materiales compuestos basados en grafito y resina epoxy (Epotek H77), permitiendo el desarrollo de (bio)sensores amperométricos más eficaces. Se ha mejorado la estabilidad y reproducibilidad de la señal, y se ha disminuido los límites de detección de forma significativa aumentando la relación señal/ruido. En primer lugar, se ha caracterizado el material compuesto de partida en función de la composición de grafito-resina presente en el mismo. Se han utilizado diferentes técnicas de caracterización que permiten obtener información de las propiedades eléctricas, electroquímicas y morfológicas del material. Se han construido electrodos compósitos de diferentes composiciones y se han caracterizando usando las técnicas de espectroscopia electroquímica de impedancias, voltamperometría cíclica, microscopia de fuerza atómica con punta conductora, microscopia electrónica de barrido, microscopia láser confocal y amperometría hidrodinámica. La utilización de estas técnicas ha permitido estudiar, el efecto que la incorporación de un tercer elemento de carácter biológico, en el material compuesto, tiene sobre la distribución espacial de las partículas conductoras que forman el biocompósito. La eficacia de estas técnicas ha quedado demostrada en la optimización de la composición (16%-17%) de un biosensor de glucosa modelo, donde la eficacia de la respuesta analítica ha sido superior a los biosensores con un contenido de grafito estándar (20%). Los nuevos criterios de optimización, han sido aplicados a biosensores basados en (bio/inmuno)compósitos, que presentan un interés relevante en aplicaciones analíticas. La respuesta analítica de los nuevos biosensores optimizados, se ha comparado con biosensores basados en el mismo tipo de (bio/inmuno)compósito que contienen un 20% de grafito, y que pueden encontrarse en la bibliografía. Concretamente, se han estudiado un biosensor de acetilcolinesterasa, aplicado a la determinación de pesticidas por inhibición enzimática, y un inmunosensor de inmunoglobulina G aplicado a la determinación indirecta de un antígeno, mediante la detección del correspondiente anticuerpo marcado. En los dos casos, se han obtenido mejoras significativas en la respuesta analítica después de la optimización de la composición del (bio/inmuno)compósito. / The conducting (bio)composites have been in the last years an interesting alternative in the development of amperometric (bio)sensors due to their great capability of integrating different kind of materials and due to the creation of a new material with different physical, mechanical and electrical properties from the originals compounds. The developed (bio)sensors with these materials present different analytical advantages regarding to a pure conductive material, for example, versatility, durability, easy surface regeneration and integration, functionality as a biological material reservoir, etc. The electrical properties of the biocomposites and, therefore, their analytical applicability are directly influenced by the conducting particles nature and the amount and spatial distribution of them inside the biocomposite. One of the most important electrochemical properties of these materials is the similarity of their electrochemical behaviour regarding to a microelectrode array. The presence of conducting areas separated by non-conducting areas on the electrode surface simulates imitate more or less an orderly distribution of microelectrodes separated by an electric insulated. The response characteristics of a microelectrode array depend on the dimensions and the separation between the microelectrodes. So, an appropriate optimization of the distance between the conducting particles and their inner distribution of the developed (bio)sensors will allow improving the analytical efficiency of (bio)sensors based on (bio)composites. In the work presented in this thesis, it has been implemented a group of instrumental techniques that, systematically applied, have allowed the characterization and optimization of (bio)composite materials composition based on graphite and epoxy resin (Epotek H77) and the development of a more efficient amperometric (bio)sensors. This efficiency has become in an improvement of the stability and signal reproducibility and, specially, an increase of the signal-to-noise ratio which has allowed decreasing the detection limits. Firstly, it has been characterized the initial composite material as function of the graphite-resin composition present on it. It has been used different characterization techniques that allow obtaining information about the electric, electrochemical and morphological properties of the material. It has been constructed composite electrodes with different compositions and it has been characterized using electrochemical impedance spectroscopy, cyclic voltammetry, current sensing atomic force microscopy, scanning electronic microscopy, confocal microscopy and hydrodynamic amperometry techniques. The use of these techniques has allowed studying the effect of incorporating a third biological compound on the composite material has on the spatial distribution of the conducting particles of the composite. The efficiency of these techniques has been demonstrated in the composition optimization (16%-17%) of a glucose model biosensor, where the analytical response efficiency is higher compared to biosensors with the standard graphite proportion (20%). The new optimization criteria have been applied to composite electrodes based on alternative biological compounds, and the analytical response of the optimized compositions was compared to the one obtained from biosensors with the standard graphite proportions (20%), reported on the literature. Concretely, it has been studied a biosensor with acetylcholinesterase, applied to pesticide determination by means of enzymatic inhibition, and an immunosensor of immunoglobulin G applied to the indirect determination of an antigen by means of the detection of their corresponding labeled antibody. In both cases, it has been obtained an improvement of the analytical response after the composition optimization of (bio/immune)composite.

En els últims anys, a causa de la necessitat de diàgnostics ràpids i de millores en sensat, s’han utilitzat nous elements de reconeixement en biosensors. Un tipus d’aquests nous elements de reconeixement són els aptàmers. Els aptàmers són cadenes sintètiques de ADN o ARN les quals són seleccionades in vitro i tenen la capacitat d’unir-se a proteïnes, ions, cèl.lules, fàrmacs i lligands de baix pes molecular, reconeixent les seves molècules diana amb alta afinitat i especificitat. Diversos biosensors basats en aptàmers, també anomenats aptasensors, han sigut desenvolupats recentment. D’entre totes les tècniques de transducció utilitzades en biosensors, l’Espectrocòpia Electroquímica d’Impedància ha sigut àmpliament emprada como a eina per caracteritzar la superficies de sensors i estudiar esdeveniments en el biosensat en la superficie d’elèctrodes. La característica més important que presenta aquesta tècnica és que no requereix cap espècie marcada per a la transducció, per tant, aquesta tècnica de detecció pot utilitzar-se per dissenyar protocols de detecció directa sense marcatge, evitant assajos més cars i laboriosos. El principal objectiu d’aquesta tesi doctoral va ser el desenvolupament d’aptasensors utilitzant la tècnica electroquímica d’impedància esmentada anteriorment. Per a això, diferents tipus d’elèctrodes van ser utilitzats, tals com elèctrodes de compòsit grafit-epoxi, elèctrodes de biocompòsit grafit-epoxi modificats amb molècules d’avidina i elèctrodes comercials serigrafiats de nanotubs de carboni de paret múltiple. El treball es va dividir principalmente en dues parts d'acord amb la detecció de dues proteïnes diferents. La primera part es va focalitzar en la detecció de trombina. Primer de tot, es van comparar i avaluar diversos aptasensors de detecció directa sense marcatge basat en diferents tècniques d'immobilització dels aptàmers, tals com: adsorció física humida, afinitat avidina-biotina i enllaç covalent mitjançant activació electroquímica de la superfície de l'elèctrode i mitjançant inserció electroquímica. Posteriorment, els elèctrodes de biocompòsit van ser comparats com a plataformes en genosensat i aptasensat. Amb la finalitat d'amplificar el senyal impedimètric obtingut utilitzant elèctrodes de biocompòsit, un protocol sàndwich va ser emprat incloent nanopartícules d'or modificades amb estreptavidina i tractament amplificador de plata. La segona part de l'estudi es va basar en la detecció de citocrom c. Primerament, es va realitzar un simple aptasensor de detecció directa sense marcatge per a la detecció d'aquesta proteïna utilitzant la tècnica d'immobilització d'adsorció física humida. Finalment, i amb l'objectiu d'amplificar el señal impedimètric, es va desenvolupar un assaig tipus sándwich híbrid d’aptàmer i anticòs utilitzant elèctrodes serigrafiats de nanotubs de carboni de paret múltiple. D'aquesta manera, la tesi explora i compara una àmplia gamma de procediments d'immobilització, l'ús de detecció directa sense marcatge o nanomaterial modificat amb biomolècules en diferents protocols directes o d'amplificació, i l'ús de reconeixement directe i sándwich per amplificar la sensibilitat i/o la selectivitat de l'assaig. / In the recent years, due to the need for rapid diagnosis and improvements in sensing, new recognition elements are employed in biosensors. One kind of these new recognition elements are aptamers. Aptamers are synthetic strands of DNA or RNA which are selected in vitro and have the ability to bind to proteins, ions, whole cells, drugs and low molecular weight ligands recognizing their target with high affinity and specificity. Several aptamer-based biosensors, also called aptasensors, have been recently developed. Among all the transduction techniques employed in biosensors, Electrochemical Impedance Spectroscopy has widely used as a tool for characterizing sensor platforms and for studying biosensing events at the surface of the electrodes. The important feature presented by this technique is that it does not require any labelled species for the transduction; thus, this detection technique can be used for designing label-free protocols thus avoiding more expensive and time-consuming assays. The main aim of this PhD work was the development of aptasensors using the electrochemical impedance technique previously mentioned for protein detection. For that, different types of electrodes were used, such as Graphite Epoxy Composite electrodes (GECs), Avidin Graphite Epoxy Composite electrodes (AvGECs) and commercial Multi-Walled carbon nanotubes screen printed electrodes (MWCNT-SPE). The work was divided in two main parts according to the detection of the two different proteins. The first part was focused on thrombin detection. First of all, different impedimetric label-free aptasensors based on several aptamer immobilization techniques such as wet physical adsorption, avidin-biotin affinity and covalent bond via electrochemical activation of the electrode surface and via electrochemical grafting were developed and evaluated. Then, AvGECs electrodes were compared as a platform for genosensing and aptasensing. With the aim to amplying the obtained impedimetric signal using AvGECs, an aptamer sandwich protocol for thrombin detection was used including streptavidin gold-nanoparticles (Strep-AuNPs) and silver enhancement treatment. The second part of the study was based on cytochrome c detection. Firstly, a simple label-free aptasensor for the detection of this protein using a wet physical adsorption immobilization technique was performed. Finally, with the goal to amplify the impedimetric signal, a hybrid aptamer-antibody sandwich assay using MWCNT-SPE for the detection of the target protein was carried out. In this way, the thesis explores and compares a wide scope of immobilization procedures, the use of label-free or nanocomponent modified biomolecules in different direct or amplified protocols, and the use of direct recognition and sandwich alternatives to enhance sensitivity and/or selectivity of the assay

Els efectes dels cannabinoids en la gana en humans es coneixen des de l´antiguitat. Les experiències dels consumidors moderns de cannabis descriuen un augment en les propietats sensorials i hedòniques del menjar, que els porta a un consum impulsiu de menjar saborós. Aquests efectes són deguts a l´activació per delta9-tetrahidrocannabinol (THC), el principal component psicoactiu present en la resina de la planta de marihuana, dels receptors de cannabinoids del cervell. Els lligands endògens dels receptors cannabinoids s´anomenen endocannabinoids (eCBs), els més coneguts són 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) i N-arachidonoylethanolamine (AEA o anandamida). 2-AG i AEA son esters o amides derivats d´àcid araquidònic, que pertanyen respectivament, a dues famílies de compostos lipídics cannabimimètics, els 2-monoacilglicerols (2-MG) i les N-aciletanolamines (NAE), que són derivats de tots els acids grassos naturals de cadena llarga. El sistema endocannabinoid té un paper clau en la regulació homeostàtica i hedònica de la ingesta de menjar. L´expressió elevada de receptors cannabinoids en àrees del cervell que regulen no només la gana sinó també el dolor, l´emoció, la cognició i les funcions motores ressalten el paper que juguen els eCBs en molts processos fisiopatològics. El sistema endocannabinoid està excessivament activat en l´obesitat. Recentment, s´ha demostrat que el sistema endocannabinoid estimula la ingesta de menjar en ratolins mitjançant un augment en la capacitat de detecció olfactiva. Un augment en l’índex de massa corporal (BMI) s´ha associat a dèficits en la capacitat olfactiva en humans. Aquestes investigacions suggereixen una possible interacció entre el sistema endocannabinoid, l´olfacte i l´obesitat. ECBs i cannabimimètics s´estan avaluant en l´actualitat com a biomarcadors d´una sèrie de condicions fisiopatològiques. El fet que les concentracions de eCBs en matrius biològiques no són intercanviables entre laboratoris, limita la seva utilitat per recerca clínica i traslacional. Per superar aquests problemes els investigadors han de prendre una sèrie de mesures en l´obtenció de la mostra, la preservació, el processament i l´anàlisi. La generació artefactual de 2-MG en plasma, la isomerització química de 2-MG i la generació artefactual de NAE en sang són alguns dels reptes a superar. Els objectius principals d´aquesta tesi són i) desenvolupar i validar metodologia analítica per quantificar eCBs i cannabimimètics en plasma humà per utilitzar com a biomarcadors en estudis clínics i traslacionals; ii) avaluar la interacció entre el sistema endocannabinoide, la capacitat olfactiva i la obesitat. En la primer part d´aquesta tesi s´ha validat un mètode analític per la determinació d´una sèrie de 2-MG i NAE en plasma i on s´han superat i/o controlat la major part de factors que contribueixen a la variabilitat en la quantificació de eCBs i compostos relacionats. La troballa més important és que la generació artefactual de 2-MG en plasma es pot controlar utilitzant l´inhibidor de lipases Orlistat. En la segona part d´aquesta tesi s´ha avaluat la funció olfactiva i s´han mesurat les concentracions plasmàtiques d´eCBs i cannabimimètics en un estudi observacional de 161 dones amb un rang de BMI des de baix pes a obesitat mòrbida. Els resultats principals d´aquest estudi mostren que les persones amb obesitat tenen una menor capacitat olfactiva que les persones no obeses i que concentracions plasmàtiques elevades de 2-AG estan associades a una menor capacitat olfactiva. Confirmant estudis anteriors, les concentracions elevades de 2-AG estan associades a un BMI elevat i a obesitat. / The effects of cannabinoids on appetite in humans have been known since ancient times. Following cannabis smoking modern users report an intensification of the sensory and hedonic properties of food, which impels the over-consumption of palatable food. These effects are mediated by activation of brain cannabinoid receptors by delta9-tetrahydrocannabinol (THC), the main psychoactive compound present in the resin of marijuana plant. The endogenous ligands of cannabinoid receptors are called endocannabinoids (eCBs), the most known are 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) and N-arachidonoylethanolamine (AEA or anandamide). 2-AG and AEA are ester or amide derivatives of arachidonic acid, and they belong respectively, to two families of cannabimimetic lipid compounds, the 2-monoacylglycerols (2-MG) and N-acylethanolamines (NAE). 2-MG and NAE are respectively ester and amide derivatives of all natural long-chain fatty acids. The eCB system is a key regulator of both the homeostatic and hedonic regulation of food intake. The high expression of eCB receptors in brain areas that modulate not only appetite but also pain, emotion, cognition and motor functions highlight the role of the eCB in many pathophysiological processes. The eCB system is over-active in obesity. It has been recently demonstrated that the eCB system can promote food intake by increasing odor detection in mice. An increase in the body mass index (BMI) in humans has been associated to deficits in olfactory capacity. These findings suggest a possible interaction between the eCB system, olfaction and obesity. ECBs are under evaluation as biomarkers of number physiopathological conditions. The lack of interchangeability of eCB concentrations in biological matrices between laboratories, limit their usefulness in clinics and translational research. To overcome these problems researchers should take into account a number of issues concerning sample procurement, preservation, processing and analysis. The artefactual 2-MG generation in plasma, the chemical isomerization of 2-MG and the artefactual generation of NAE in blood are some of the challenges to be confronted. The main aim of this thesis are i) to develop and validate analytical methodology for the quantification of eCBs and cannabimimetic compounds to be used as biomarkers in clinical and translational studies; ii) to evaluate the interaction between the eCB system, olfactory capacity and obesity. In the first part of this thesis we have validated a method for the determination of a range of NAE and 2-MG in human plasma. We have been able to overcome and/or control most factors contributing to eCB quantification variability. The most relevant finding is that the artefactual generation of 2-MG can be controlled by using the lipase inhibitor Orlistat. In the second part of this thesis we evaluated the olfactory function and we measured the plasma concentrations of eCBs and cannabimimetics in a cross sectional study of 161 females with BMI ranging from under-weight to morbidly obese. The main results of this study show that obese subjects have a lower olfactory capacity than non-obese ones and that elevated circulating 2-AG plasma concentrations are linked to a lower olfactory capacity. In agreement with previous studies we show that elevated 2-AG concentrations are linked to high BMI and obesity.

La industria farmacéutica necesita disponer de métodos analíticos rápidos y fiables para poder controlar de forma eficiente las diferentes etapas de producción, desde la materia prima, los productos intermedios hasta los productos finales. La irrupción de la iniciativa Process Analytical Technology (PAT) ha impulsado la introducción de modernas técnicas espectroscópicas para realizar la monitorización del proceso de fabricación con el objeto de determinar parámetros críticos de calidad que conduzcan a un mejor conocimiento del producto que puede conducir a la mejora continua. En esta Tesis se realiza el estudio de la aplicación de la Espectroscopia NIR a la determinación de parámetros de interés en la fabricación de comprimidos en la industria farmacéutica con el objeto de proponer nuevas metodologías más rápidas y eficaces que serán alternativas reales a los métodos convencionales y que constituyan un avance en la implantación de PAT. Las etapas de producción de comprimidos que fueron objeto de estudio fueron el mezclado, la granulación y el análisis de parámetros de interés de los comprimidos finales. Se han realizado dos estudios críticos de los distintos métodos cualitativos y cuantitativos, aplicables a la monitorización del proceso de mezclado con el fin de elegir el mejor método para la detección del punto final de mezclado. Se estudian diferentes algoritmos a aplicar a los espectros registrados durante el mezclado que permitan obtener un punto final de mezclado que a su vez asegurará la uniformidad de la dosificación en el comprimido final. El primer estudio se ha realizado usando la espectroscopia NIR y en el segundo se ha realizado un estudio comparativo de los resultados usando los espectros NIR frente a los Raman. Se demuestra que algunos de los procedimiento descritos en la bibliografía no son adecuados para este objetivo, mientras que otros, sencillos y fáciles de desarrollar, proporcionan buenos resultados y aconsejables en esta aplicación. Otro estudio lo constituye la determinación del tamaño de partícula, que es un parámetro importante para asegurar la correcta fluidez de un granulado. Se amplió el estudio con la determinación del principio activo en granulados intermedios del proceso así como en el producto final. Finalmente, se ha establecido un método de determinación de la presión de compactación de los comprimidos. Esta propiedad es importante por su influencia en el test de disolución que será determinante para que el producto pueda ser liberado al mercado. La determinación de la concentración del principio activo (API) en los comprimidos finales tiene por finalidad el asegurar el cumplimiento de especificaciones; este método se ha validado siguiendo las guías ICH y EMA, lo que permite su aplicación en el control analítico del producto acabado en el proceso de producción. Se ha estudiado el desarrollo y optimización de una nueva metodología para desarrollar modelos de calibración que incorporen la variabilidad física producida durante el proceso de fabricación de cada formulación. Este método consiste en la adición de un conjunto de espectros proceso (espectros obtenidos por la diferencia entre los espectros de comprimidos de producción y muestras de laboratorio con la misma concentración nominal) al conjunto de muestras preparadas en el laboratorio como una forma de incorporar los cambios físicos producidos durante cada etapa del proceso de producción de comprimidos. Las metodologías desarrolladas en esta tesis aportan soluciones a situaciones reales de la industria farmacéutica y han demostrado de forma satisfactoria como la espectroscopia NIR puede ser una herramienta para el control de parámetros físicos y químicos del proceso de fabricación de comprimidos, obteniendo adecuadas capacidades predictivas. / The pharmaceutical industry needs to have fast and reliable analytical methods for efficiently controlling each of the different stages of production, from raw materials, intermediate products to finished products. The emergence of the initiative Process Analytical Technology (PAT) has promoted the introduction of modern spectroscopic techniques for monitoring the manufacturing process aimed at determining critical quality parameters that lead to a better understanding of the product and towards continuous improvement. With the goal of propose new methodologies that are real alternatives to conventional methods and also achieve a real advance in the implementation of PAT, in this thesis we study the application of NIR spectroscopy to determine the parameters of interest in the manufacturing process of tablets for the pharmaceutical industry. The stages in the production of tablets which were studied are mixing, granulation and the analysis of parameters of interest of the final tablets. Two critical studies of different qualitative and quantitative methods applicable to the mixing process monitoring were performed in order to choose the best method for detecting the end point of mixing. Different algorithms are studied to be applied to the spectra recorded during the mixing to obtain an end point of mixing, at the same time ensures the uniformity of dosing in the final tablet. The first study was conducted using NIR spectroscopy. The second is a comparative study of the results using the NIR spectra versus Raman. We show that some of the procedures described in the literature are not suitable for this purpose, while other procedures, which are simple and easy to develop, provide good results and are desirable for this application. An additional study is the particle size estimation, which is an important parameter to ensure the proper fluidity of a granulate. This study was expanded with the determination of the active principle in granular intermediate process and in the final product. Finally, we have established a method for the determination of the compaction pressure of the tablets. This compaction property is important for its influence on the dissolution test that will determine that the product can be released to the market. The determination of the concentration of active principle (API) in the final tablets aims to ensure compliance with specifications, this method has been validated following the ICH guidelines and EMA, allowing its application in analytical control of the finished product in the production process. We have studied the development and optimization of a new methodology to develop calibration models that incorporate physical variability produced during the manufacturing process of each formulation. This method consists in adding a set of process spectra (spectra obtained by the difference between the spectra of production tablets and laboratory samples with the same nominal concentration) to the set of samples prepared in the laboratory as a way to incorporate the physical changes during each stage in the production process of the tablets. The methodologies developed in this thesis provide solutions to real situations in the pharmaceutical industry and have successfully demonstrated the ways that NIR spectroscopy can be a suitable tool for controlling physical and chemical parameters within the tablet manufacturing process, obtaining thus adequate predictive capabilities

La industria en general, y particularmente la química y la farmacéutica, necesita mejorar la eficiencia de los procesos de producción, para asegurar la obtención de productos con una elevada calidad y a la vez reducir consumos, lo que redundará en una mejora de la productividad. Esta demanda precisa del desarrollo de metodologías analíticas simples, rápidas, fiables y de bajo coste, que puedan ser utilizadas en rutina y por personal poco cualificado, que posibiliten realizar un seguimiento de todo el proceso de producción, y si es necesario aplicar las medidas correctivas necesarias, con el objeto de obtener productos de elevada calidad. Con el objetivo de proporcionar a la industria nuevas metodologías de análisis que permitan cumplir con estos objetivos, en esta tesis se han realizado diversos estudios basados en la espectroscopia NIR y la espectrometría de movilidad iónica (IMS). En el primer estudio de la tesis se ha aplicado la espectroscopia NIR para la monitorización in-line de un proceso de esterificación enzimática de glicerina con ácido esteárico en presencia de una lipasa de Candida Antarctica, mediante la inmersión de una sonda NIR en el reactor. En los diferentes procesos realizados, la reacción enzimática conduce a la formación de diestearato y monoestearato de glicerina; no se observa la formación de triestearato. Se han desarrollado modelos de calibración PLS para cada uno de los componentes, usando los espectros registrado y los valores obtenidos por cromatografía de permeación en gel; los modelos son simples y presentan una correcta capacidad predictiva. Los métodos desarrollados se han aplicado al seguimiento de otros procesos obteniendo resultados que demuestran la utilidad del NIR en la monitorización in-line de la reacción de esterificación enzimática estudiada. El siguiente estudio ha consistido en el desarrollo de un método NIR para la determinación de los componentes de una mezcla adyuvante para un herbicida que se aplica por pulverización de una suspensión. La gran semejanza de los espectros de algunos componentes ha exigido la aplicación de un diseño experimental para la preparación de muestras, que tiene por objeto asegurar la robustez del modelo de calibración. La aplicación de los modelos construidos a muestras de lotes de producción, mostró la buena capacidad predictiva de los modelos construidos y su utilidad para controlar la composición de este tipo de mezclas. En un tercer trabajo se desarrollaron bibliotecas espectrales para la identificación de formulaciones lubricantes, que presentan espectros muy similares. El método desarrollado basado en la construcción de bibliotecas en cascada o sub-bibliotecas permite asegurar la especificidad necesaria para la discriminación entre productos que la biblioteca general identifica ambiguamente. Utilizando criterios de diferenciación más estrictos la biblioteca permite la diferenciación de formulaciones lubricantes que contienen o no aditivos en un porcentaje relativamente pequeño (0.05-0.7%). En este trabajo también se construyeron modelos PLS para la determinación de composición y viscosidad de los lubricantes. En esta tesis se han desarrollado métodos analíticos utilizando la técnica IMS, por primera vez en nuestro grupo de investigación, con el objeto de complementar algunos aspectos analíticos que no se pueden resolver mediante NIR y que son asequibles a la espectrometría de Movilidad Iónica (IMS). Esta es una nueva técnica nueva que ha sido escasamente utilizada en la industria química y farmacéutica. Se han estudiado, desarrollado y validado dos nuevos métodos analíticos, para la determinación de amina residual a lo largo del proceso de fabricación de amidoaminas y fosfolípidos, y otro para la determinación de dos principios activos (en una baja concentración) de un preparado farmacéutico. En ambos casos se han estudiado la influencia de los factores instrumentales en la respuesta IMS y realizando una optimización del método de cuantificación para conseguir la mejor respuesta instrumental y sensibilidad. Se han construido modelos multivariables que permiten la determinación de las especies de interés. Los métodos desarrollados se han aplicado al control analítico de los preparados estudiados. / The industry, and particularly chemistry and pharmaceuticals, needs to improve the efficiency of production processes to ensure obtaining the products in high quality while reducing consumption, what will result in improving productivity. This demand requires the development of analytical methodologies in simple, fast, reliable and low cost manner, which can be used in routine and by unskilled labor, which enable to track the entire production process, and if necessary, apply corrective actions, to obtain high quality products. In order to provide the industry these new methods of analysis to achieve these objectives, in this thesis there have been carried out several studies based on NIR spectroscopy and ion mobility spectrometry (IMS). In the first study of the thesis, NIR spectroscopy has been applied for in-line monitoring of enzymatic esterification process of glycerol with stearic acid in the presence of a lipase from Candida Antarctica, with a NIR immersion probe in the reactor. In the processes performed, the enzymatic reaction leads to the formation of glycol distearate and glycerol monostearate; not being observed the formation of tristearate. It has been developed PLS calibration models for each of the components, using the spectra recorded and the values obtained by gel permeation chromatography; the models were simple and had a correct prediction. The developed methods have been applied to monitoring processes, obtaining results that demonstrate the usefulness of NIR in-line monitoring of the enzymatic esterification reaction studied. The next study involved the development of a NIR method for determining components of a mixture adjuvant in an herbicide product, which was applied for spraying a suspension. The great similarity of the components spectra has required the implementation of an experimental design for sample preparation, which aim is to ensure robustness of the calibration model. The application of the models built to samples of production batches showed good predictive ability of the models constructed, and their utility for checking the composition of such mixtures. In a third work, spectral libraries were developed for the identification of lubricant formulations, which had very similar spectra. The developed method based on the construction of libraries or sub-cascading libraries, ensures the necessary specificity for discrimination between products that were unambiguously identified in the general library. Using more stringent criteria of differentiation, the library allows the differentiation between lubricant formulations which contain or not additives in a relatively small amount (0.05 to 0.7%). In this work, PLS models were also constructed for the determination of composition and viscosity of lubricants. In the present thesis, we have developed analytical methods using IMS technique for the first time in our research group, in order to complement some analytical issues that cannot be resolved by NIR and that are amenable to IMS. This is a new technique that has been rarely used in the chemical and pharmaceutical industries. There have been studied, developed and validated two new analytical methods for determination of residual amine during the manufacturing process of amidoamines and phospholipids, and one for the determination of two active principles ingredients (in low concentration) of a pharmaceutical preparation. In both cases, we have studied the influence of instrumental factors in the IMS response and we have performed an optimization of the quantification method to get the best instrumental response and sensitivity. Multivariate models were constructed which allowed the determination of the species of interest. The developed methods have been applied to analytical control of the preparations studied.

La industria farmacéutica es objeto de estrictas regulaciones que tienen por objeto asegurar la calidad de los productos que ofrecen al mercado; el aseguramiento de esta calidad se realiza mediante la determinación de parámetros de calidad a través de ensayos off-line en el producto terminado. Sin embargo, la complejidad de los métodos y la variedad de los mismos retrasa de forma importante la liberación del producto con las consiguientes pérdidas económicas y de competitividad para la empresa. Como respuesta a esta situación han surgido las iniciativas de Tecnología Analítica de Procesos (PAT) y la calidad mediante el diseño (QbD), en las que se fomenta el uso de nuevas tecnologías para asegurar la calidad de los productos terminados, controlando las diferentes etapas del proceso de fabricación, permitiendo obtener un mejor conocimiento del proceso productivo y asegurando con ello la calidad del producto final. La diversidad de determinaciones a realizar a conducido a recomendar a la espectroscopia NIR como una de las herramientas más apropiadas para PAT. Las ventajas que presenta la técnica NIR frente a otras técnicas instrumentales, la convierten en la herramienta idónea para satisfacer estas necesidades analíticas (ausencia de pre-tratamiento de muestra, nulo consumo de reactivos sin generación de residuos, fácil y rápida adquisición de resultados, entre otras). Los estudios realizados en la tesis doctoral están dirigidos a proponer y aportar soluciones conducentes a la mejora continua de la calidad en los procesos farmacéuticos. Para ello se han construido modelos de calibración multivariantes NIR para determinar los CQAs tanto de productos intermedios como finales. Los CQA seleccionados para los granulados fueron el contenido de principio activo (API), humedad, pH, tamaño de partícula y propiedades de flujo. Estos modelos se han implementado en el proceso por la empresa que permiten realizar las medidas en tiempo real, de forma no invasiva y en una zona no calificada; esto representa un ahorro muy importante en tiempo y una considerable mejora de la productividad. En otro estudio dedicado a un proceso de mezcla de pellets, se ha desarrollado un nuevo método matemático para determinar la homogeneidad de la mezcla en tiempo real durante el mezclado, además de un método NIR para cuantificar un API. La característica interesante de este estudio fue que se utilizó un equipo NIR inalámbrico, controlado a distancia, permitiendo que el equipo forme parte del proceso. Se realizó un estudio completo, planificado y ejecutado, basado en la filosofía QbD para un proceso de fabricación de un gel farmacéutico. En este estudio se definieron y evaluaron las variables del proceso, pudiendo determinar el espacio de diseño (DS). Los métodos NIR construidos permitieron determinar CQAs durante el proceso de gelificación, tales como viscosidad, pH y contenido de API y su determinación durante el proceso permite asegurar que el sistema se mantiene dentro del DS. Se ha evaluado la idoneidad de la espectroscopia NIR en la monitorización in-line de un proceso de liofilización de una mezcla de multicomponentes. En este estudio se han evaluado diversos métodos quimiométricos que permiten extraer información útil del proceso a partir de los espectros NIR. Finalmente, se han desarrollado algoritmos adecuados para extraer información acerca de la homogeneidad de distribución de un componente en cualquier imagen, sea digital o hiperespectral. Estos métodos permiten informar sobre la homogeneidad de muestras farmacéuticas solidas, como tabletas de diversos tipos (recubiertas, sin recubrimiento, efervescentes) y mezclas en polvo; así pueden proponerse las técnicas de imagen química para el establecimiento de la homogeneización de muestras sólidas. Estos estudios han demostrado que la espectroscopia NIR y las técnicas de Imagen Química son herramientas adecuadas para la Tecnología Analítica de Procesos en la industria farmacéutica. / The pharmaceutical industry is subject to strict regulations, which intent to ensure the quality of the products offered on the market. This quality assurance is done by quality parameters determination through off-line test in the finished product. However, the complexity and variety of the methods delay significantly the release of the product with negative economic consequences and loss of competitiveness for the company. In response to this situation, process analytical technology (PAT) and quality by design (QbD) initiatives emerged, which promotes the use of new technologies to ensure the quality of the finished products, controlling the different stages of manufacturing processes, allowing to obtain a better process understanding and consequently ensuring the quality of the finished product. The diversity of quality parameter determinations conducted to NIR spectroscopy was recommended as one of the most appropriate tools for PAT. The advantages of NIR technique, versus other instrumental techniques, make it the ideal tool for these analytical needs (e.g. no sample preparation, no need for reagents, easy and fast acquisition of results). The studies presented in the Doctoral Thesis are aimed to propose and provide solutions to the continuous improvement of quality in pharmaceutical processes. For this reason multivariate NIR calibration models were constructed to determine the critical quality attributes (CQAs) in both intermediate and finished product. The selected CQAs for a granulate formulation were the active pharmaceutical ingredient (API) content, moisture, pH, particle size and flow properties. These models have been implemented in the manufacturing process by the company by using non-invasively and in real-time NIR measures in a non-qualified area. This strategy represents a tremendous savings in time and a considerable improvement in productivity. In another study concerning a blending process of pellets, it has been developed a new mathematical method to determine in real time the blend homogeneity during blending and a NIR method for quantifying an API. The interesting feature of this study was that we used a wireless NIR equipment, remotely controlled, allowing the spectrophotometer forms part of the process. A full study, planned and executed, based on QbD philosophy for a manufacturing process of a pharmaceutical gel was performed. In this study, the process variables were defined and assessed allowing to design space (DS) of process to be identified. The constructed NIR methods allowed to determine the CQAs throughout manufacturing process, such as viscosity, pH, and API content. These determinations during the process allow to assure that system is within DS. The suitability of the NIR Spectroscopy for the in-line monitoring of a multicomponent mixture freeze drying process has been evaluated. In this study different chemometric methods allowing to extract useful information of process by means of NIR measures were assessed. Finally, appropriate algorithms have been developed to extract information about the homogeneous distribution of components in any image (e.g. digital or hyperspectral). These methods allow to inform about the homogeneity of solid pharmaceutical samples solid, such as coated tablets, cores, effervescent tablets and powder blends; therefore, chemical image techniques can be proposed for the establishment of the homogeneity in solid samples. These studies have demonstrated that NIR spectroscopy and chemical image techniques are adequate tools for the process analytical technology in the pharmaceutical industry.

La investigación llevada a cabo en la presente tesis doctoral describe el desarrollo de biosensores basados en membranas de polisulfona y nanotubos de carbono (PS/CNT). Este tipo de membranas ha permitido la incorporación de diferentes biomoléculas como hormonas, anticuerpos y enzimas, de manera rápida y fácil gracias a la técnica de inversión de fase. Además, el uso de nanotubos de carbono confiere al material excelentes propiedades eléctricas, permitiendo su uso como transductor. Inicialmente realizó un estudio de caracterización de la membrana mediante técnicas de microscopía como la microscopía láser confocal (CSLM), o la electrónica de barrido (SEM) para determinar su estructura, porosidad y rugosidad. La CSLM permitió además visualizar la distribución de las biomoléculas dentro de la membrana compósita. De esta manera, la deposición de membranas PS/CNT sobre electrodos serigrafíados dio lugar a la construcción de inmunosensores para la detección de la hormona hCG mediante un inmunoensayo competitivo. El principal objetivo del trabajo ha sido el desarrollo y optimización de biosensors para su posterior aplicación en el análisis de muestras reales. Con esta finalidad también se han desarrollado sensores enzimáticos empleando este tipo de membranas. Así, por ejemplo, se han estudiado diferentes estrategias para la construcción de sensores de L-lactato, y finalmente se han aplicado satisfactoriamente en el análisis de vino y cerveza. De la misma manera, se han desarrollado biosensores, también enzimáticos, para la determinación de histamina en muestras de pescado. Finalmente, se describe el trabajo realizado en la Universidad Tor Vergata de Roma. Éste consistió en la construcción de biosensores de glucosa con el objetivo de obtener respuestas de ultrasensibilidad gracias al efecto “branch point”, un proceso de competición entre dos o más enzimas para reaccionar con el sustrato. De esta manera, empleando este tipo de respuesta en el desarrollo de puertas lógicas se consigue dar una respuesta binaria en función de la concentración del analito. / The research reported in this dissertation deals with the development of biosensors based on polysulfone and carbon nanotubes (PS/CNT) membranes. This type of membrane has allowed the easy and rapid immobilization of hormones, antibodies and enzymes onto electrode surface by phase inversion technique. Moreover, the use of CNT provides a composite material with excellent electrical properties, and consequently, the possibility of acting as transducer. Initially, the membrane was first characterized using microscopic techniques such as confocal scanning microscopy (CSLM) and scanning electron microscopy (SEM) to determine its structure, porosity and roughness. In addition, CSLM also permitted to visualize the biomolecules distribution into the composite membrane. In this manner, the deposition of CNT/PS membranes onto screen-printed electrodes allowed the construction of immunosensors for the detection of hCG hormone based on a competitive immunoassay. Afterwards, given the main aim of the present work has been the development and optimization of biosensors for their further application in real samples analysis, PS/CNT membranes have been also used for the construction of enzymatic biosensors. For this purpose, L lactate biosensors have been developed using different strategies and enzymes, and finally, successfully applied in wine and beer samples analysis. In the same manner, enzymatic biosensors for histamine determination have also been developed and its response has been checked towards fish samples. Lastly, also the research work carried out in Tor Vergata University (Rome) is described. This consists in the construction of glucose biosensors with the aim of obtaining ultrasensitive responses due to the “branch point effect”; a competition process between two or more enzymes for the same substrate. In this way, this type of response has been used to develop of enzymatic logic gates capable of giving a binary response depending of analyte concentration.