[ES] Los fármacos pertenecientes a la familia de los ß-lactámicos son los antibióticos más usados en todo el mundo. Estudios recientes revelan que hasta un 10% de la población refiere haber presentado síntomas alérgico, esta porción de la población se considera "alérgica". En el diagnóstico de la alergia a antibióticos ß-lactámicos existen varios tipos de pruebas que sirven para orientar y confirmar la presencia de una alergia, clasificadas como ensayos in vivo e in vitro. En lo que se refiere a los ensayos in vivo, la detección de los procesos alérgicos más comunes se realiza mediante pruebas de exposición oral controladas, y pruebas intraepidérmicas e intradérmicas. No obstante, estas pruebas tienen sus limitaciones como es el riesgo de inducir reacciones alérgicas sistémicas graves. Por todo ello, su práctica requiere personal entrenado. Este requisito limitan la realización de este tipo de pruebas a centros hospitalarios especializados. La aplicación y desarrollo de técnicas de diagnóstico in vitro tiene como objetivo llegar a un diagnóstico de la alergia sin riesgos para el paciente. Entre las distintas pruebas serológicas y celulares que se pueden emplear, la detección de IgE específica es una de las más extendidas debido a que, dada su sensibilidad y especificidad, y mayor seguridad. Los sistemas de diagnóstico in vitro actuales utilizan una instrumentación analítica cara y de gran tamaño, así como materiales desechables caros, manejados por personal cualificado, por lo que este tipo de pruebas se realizan únicamente por servicios de alergia y/o análisis clínicos de grandes centros sanitarios. En consecuencia, hay una necesidad de desarrollar nuevos métodos de diagnóstico que cumplan los requisitos de sensibilidad, rapidez, sencillez, multiplexado y portabilidad, a un precio reducido para su implantación en todo tipo de laboratorios clínicos de los diferentes niveles de atención sanitaria. Por este motivo, en esta tesis doctoral se plantea como objetivo principal la puesta a punto de un inmunoensayo múltiple, utilizando la tecnología de disco compacto para la detección y cuantificación in vitro de niveles de IgE específica a un amplio espectro de antibióticos ß-lactámicos en muestras de suero humano. Las limitaciones más críticas para la determinación de IgE específica multianalito mediante métodos inmunoquímicos son las relacionados con la sensibilidad y selectividad. Por lo tanto, una parte importante de la tesis se ha centrado en la preparación y caracterización de un panel antígenos ß-lactámicos, selección de inmunoreactivos, formato y estudio de diferentes parámetros claves del inmunoensayo. Otra parte importante de la tesis se ha enfocado en abordar la mejora de la reproducibilidad de los resultados. La estrategia ha consistido en estudiar diferentes sistemas de calibración con el objetivo de estandarizar la cuantificación de los métodos in vitro de diagnóstico de este tipo de alergias. Para ello, se han evaluado las prestaciones de la calibración homóloga, heteróloga y el uso de un patrón interno, comparado sus prestaciones analíticas (relación señal ruido, sensibilidad, reproducibilidad, etc.) con el sistema de referencia. Finalmente, la validación del inmunoensayo se realizó con un conjunto de 101 muestras de suero de pacientes y controles. Los resultados obtenidos han sido comparados con los obtenidos mediante las técnicas de referencia, mostrando una mejor sensibilidad, especificidad, precisión, y linealidad. La capacidad múltiplex de la tecnología de disco compacto permitió llevar a cabo paralelamente estudios de reactividad cruzada frente a diferentes antibióticos ß-lactámicos esclareciendo el patrón de reconocimiento de los pacientes. En esta línea de trabajo, el uso de otras estrategias de conjugación de haptenos ha resultado en la mejora de la sensibilidad clínica del ensayo, identificando nuevos epítopos / [CA] Els fàrmacs que pertanyen a la família dels beta-lactams, són els antibiòtics d'us més estès a tot el món. Estudis recents posen de manifest que fins un 10% de la població ha presentat símptomes d'al·lèrgia, essent considerats població al·lèrgica als beta-lactams. En el diagnòstic de l'al·lèrgia front aquest tipus d'antibiòtics, existeixen diferents tipus de proves que serveixen per orientar i confirmar la presència d'una al·lèrgia, classificades com assajos in vivo i in vitro. Pel que fa als assajos in vivo, la detecció dels processos al·lèrgics més comuns es realitza mitjançant proves d'exposició oral controlades, i proves intra-epidèrmiques i intradèrmiques. No obstant això, aquestes proves tenen les seues limitacions com és el risc d'induir reaccions al·lèrgiques sistèmiques greus. Per tot això, la seua pràctica requereix personal entrenat. Aquests requisits limiten la realització d'aquesta mena de proves a centres hospitalaris especialitzats. L'aplicació i desenvolupament de tècniques de diagnòstic in vitro té com a objectiu arribar a un diagnòstic de l'al·lèrgia sense riscos per al pacient. Entre les diferents proves serològiques i cel·lulars que es poden emprar, la detecció d'IgE específica és una de les més esteses donada la seua sensibilitat, especificitat, i major seguretat. Els sistemes de diagnòstic in vitro actuals utilitzen una instrumentació analítica cara i de gran grandària, així com materials d'un sol ús també cars, que requereixen de personal qualificat, per la qual cosa aquest tipus de proves es realitzen únicament per serveis d'al·lèrgia i/o anàlisis clíniques de grans centres sanitaris. En conseqüència, hi ha una necessitat de desenvolupar nous mètodes de diagnòstic que complisquen els requisits de sensibilitat, rapidesa, senzillesa, multiplexatge i portabilitat, a un preu reduït per a la seua implantació en tota mena de laboratoris clínics dels diferents nivells d'atenció sanitària. Per aquest motiu, en aquesta tesi doctoral es planteja com a objectiu principal la posada a punt d'un immunoassaig múltiple, utilitzant la tecnologia de disc compacte per a la detecció i quantificació in vitro de nivells d'IgE específica a un ampli espectre d'antibiòtics ß-lactáms en mostres de sèrum humà. Les limitacions més crítiques per a la determinació d'IgE específica multianàlit mitjançant mètodes inmunoquímics estan directament relacionades amb la sensibilitat i selectivitat. Per tant, una part important de la tesi s'ha centrat en la preparació i caracterització d'un panell antígens ß-lactáms, selecció d'inmunoreactius, del format d'assaig i estudi de diferents paràmetres claus de l'immunoassaig. Una altra part important de la tesi s'ha enfocat a abordar la millora de la reproductibilitat dels resultats. L'estratègia ha consistit a estudiar diferents sistemes de calibratge amb l'objectiu d'estandarditzar la quantificació dels mètodes in vitro de diagnòstic d'aquesta mena d'al·lèrgies. Per a això, s'han avaluat les prestacions del calibratge homòleg, heteròleg i l'ús d'un patró intern, comparant les seues prestacions analítiques (relació senyal soroll, sensibilitat, reproductibilitat, etc.) amb el sistema de referència. Finalment, la validació de l'immunoassaig es va realitzar amb un conjunt de 101 mostres de sèrum de pacients i controls. Els resultats obtinguts han sigut comparats amb els obtinguts mitjançant les tècniques de referència, mostrant una millor sensibilitat, especificitat, precisió, i linealitat. La capacitat múltiplex de la tecnologia de disc compacte va permetre dur a terme paral·lelament estudis de reactivitat creuada enfront de diferents antibiòtics ß-lactáms esclarint el patró de reconeixement dels pacients. En aquesta línia de treball, l'ús d'altres estratègies de conjugació d'haptens ha resultat en la millora de la sensibilitat clínica de l'assaig, identificant nous epítops / [EN] ß-lactam antibiotics are one of the most widely used antimicrobials worldwide. However, up to 10% of the population reports having presented allergic symptoms derived from their consumption. Consequently, this portion of the population is considered "allergic". In the diagnosis of allergy to ß-lactam antibiotics there are several types of tests that serve to orient and confirm the presence of an allergy. These diagnostic methods are classified as in vivo and in vitro assays. Regarding in vivo tests, the most standardized tests are the provocation, prick and intradermal test. The aim of these assays is to observe the response produced by the different beta-lactam antibiotics in the patient after oral or cutaneous administration. Despite their wide use, these tests have their limitations, such as the risk of inducing severe systemic allergic reactions. Therefore, their practice requires specialized professionals for their indication, performance and interpretation. This requirement limit the performance of this type of test to specialized hospitals. The use and development of in vitro diagnostic techniques can overcome these disadvantages and allow the diagnosis of allergy without risks. In vitro assays are less invasive and therefore neither pose a risk of adverse reactions. Among the different serological and cellular tests that can be used, the detection of specific IgE is one of the most widespread due to its sensitivity and specificity. Current in vitro diagnostic systems use expensive and bulky analytical instrumentation and high-cost single-use materials, handled by qualified professionals. Therefore, such tests are performed only by allergy and/or clinical analysis services of hospitals or by companies specialized in clinical diagnostics. Consequently, there is a need to develop new diagnostic methods that can be implemented in all types of clinical laboratories at diverse levels of health care, meeting the requirements of sensitivity, speed, simplicity, multiplexing and portability at a reduced price. For this reason, the main objective of this doctoral thesis is the development of a multiplex immunoassay using compact disc technology for the detection and quantification of specific IgE levels to a wide variety of ß-lactam antibiotics in human serum samples. The most crucial limitations for the determination of multianalyte specific IgE by immunochemical methods are those related to sensitivity and selectivity. Hence, an important part of the thesis has been focused on the preparation and characterization of a pool of beta-lactam antigens, selection of immunoreagents, format and optimization of different critical parameters of the immunoassay. Another important aspect of the thesis has been focused on improving the reproducibility of the results. The strategy consisted of studying different calibration systems with the aim of standardizing the quantification of in vitro diagnostic tests for this type of allergy. To achieve that goal, the performance of homologous and heterologous calibration and the use of an internal standard have been evaluated, comparing their analytical performance (signal-to-noise ratio, sensitivity, reproducibility, etc.) with the reference system. Finally, the validation of the immunoassay was performed with a total of 101 serum samples from patients and controls. The results obtained have been compared with those obtained using the reference techniques, showing improved sensitivity, specificity, precision, and linearity. The multiplex capability of the compact disc technology allowed carrying out parallel cross-reactivity studies against different beta-lactam antibiotics both from the penicillin family and from other families, elucidating the recognition profile. Following this working line, the use of other hapten conjugation strategies improved clinical sensitivity of the assay by identifying new epitopes. / Juárez Rodriguez, MJ. (2022). Metodologías bioanalíticas para el diagnóstico in vitro de alergia a antibióticos ß-lactámicos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/184011 / Premios Extraordinarios de tesis doctorales

Tesis por compendio / [ES] El diagnóstico de alergias a antibióticos ß-lactámicos incluye el uso de pruebas in vivo no satisfactorias ya que consumen mucho tiempo y conllevan el riesgo de provocar una nueva reacción alérgica. Por otro lado, los métodos in vitro basados en la inmunodetección de IgE alérgeno-específica generan una información muy valiosa, confirmando o descartando la alergia y postulándose como una alternativa de diagnóstico segura. A pesar de ello, las pruebas in vitro actuales carecen de sensibilidad y exactitud, con un 81% de falsos negativos, lo que limita su uso diagnóstico. Esto ha desencadenado una creciente demanda de nuevas pruebas in vitro basadas en la inmunodetección de IgE, el biomarcador presente en suero más estudiado en alergia. Sin embargo, la falta de estándares de referencia de IgE alérgeno-específica ha imposibilitado la validación y estandarización de los métodos, lo que hace que los resultados de las distintas pruebas no sean comparables. Además, dicha falta de estándares de referencia hace que las concentraciones de IgE específica se calculen a partir de una curva de calibración de IgE total mediante una interpolación heteróloga, lo que ha demostrado no ser totalmente correcto. Por los motivos mencionados, en esta tesis doctoral se plantea como objetivo principal el diseño, obtención y caracterización de proteínas recombinantes con reactividad frente a antibióticos ß-lactámicos. Esta investigación comienza con la puesta a punto de un inmunoensayo en placa ELISA con detección quimioluminiscente para la cuantificación de IgE específica. El ensayo desarrollado permitió determinar IgE específica por debajo de 0.1 IU/mL (0.24 ng/mL), permitiendo así la identificación de pacientes alérgicos con una mayor sensibilidad, utilizando solo 25 ¿L de muestra (suero). El inmunoensayo mostró una buena sensibilidad (64.6%), así como una excelente especificidad (100%), que mejoran significativamente el carácter predictivo de las pruebas in vitro existentes. A continuación, se abordó la obtención y caracterización de proteínas recombinantes similares a las IgE específicas de los ß-lactámicos utilizando la metodología Phage Display. La primera aproximación se trata de una proteína formada por dos nanoanticuerpos que mimetiza el comportamiento de una IgE específica. De esta manera, se obtuvieron proteínas recombinantes en las que uno de los nanoanticuerpos reconoce selectivamente un determinante antigénico de un antibiótico ß-lactámico, mientras que el otro reconoce específicamente al parátopo de un anticuerpo detector anti-IgE. Estas construcciones resultaron ser estables y funcionales. El papel de estas proteínas recombinantes como calibrador homólogo se estudió determinando la concentración de IgE específica a penicilina G presente en suero mediante un ensayo quimioluminiscente. El método desarrollado duplicaba la sensibilidad clínica (66%) frente al método de referencia (28%), mientras que mantenía una especificidad clínica del 100%. Alcanzado este punto, la tesis se centró en la producción de IgE específica recombinante utilizando como material de partida el ADN de un paciente alérgico a amoxicilina y penicilina G. A partir del material genético aislado, mediante Phage Display, ingeniería de anticuerpos y métodos de expresión en células de insecto se consiguió producir una IgE específica recombinante. De esta manera, se obtuvo un producto biológico que cumple con los requisitos para su adopción como material de referencia en ensayos in vitro. Igualmente, se utilizó como calibrador homólogo para la determinación de IgE específica a amoxicilina. Se alcanzó un límite de detección de 0.05 IU/mL con el que se conseguía un aumento de la sensibilidad clínica (73%) que cuadruplicaba al método de referencia (16%), manteniendo la especificidad clínica en el 100%. / [CA] El diagnòstic d'al·lèrgies a antibiòtics ß-lactàmics inclou l'ús de proves in vivo no satisfactòries, ja que consumeixen molt de temps i comporten el risc de provocar una nova reacció al·lèrgica. D'altra banda, els mètodes in vitro basats en la immunodetecció d'IgE al·lergen-específica generen una informació molt valuosa, confirmant o descartant l'al·lèrgia i postulant-se com una alternativa de diagnòstic segura. Tanmateix, a les proves in vitro actuals hi ha una manca de sensibilitat i exactitud, amb un 81% de falsos negatius, cosa que en limita l'ús diagnòstic. Tot això ha desembocat en una demanda creixent de noves proves in vitro basades en la immunodetecció d'IgE, el biomarcador present en sèrum més estudiat en al·lèrgia. No obstant això, la manca d'estàndards de referència d'IgE al·lergen-específica ha impossibilitat la validació i estandardització dels mètodes, cosa que fa que els resultats de les diferents proves no siguen comparables. A més, aquesta manca d'estàndards de referència fa que les concentracions d'IgE específica es calculen a partir d'una corba de calibratge d'IgE total mitjançant una interpolació heteròloga, un mètode que ha demostrat no ser totalment correcte ja que no es pren en consideració la interacció entre el determinant antigènic i la IgE específica. Pels motius mencionats, en aquesta tesi doctoral es planteja com a objectiu principal el disseny, l'obtenció i la caracterització de proteïnes recombinants amb reactivitat davant dels antibiòtics ß-lactàmics. Aquesta investigació comença amb la posada a punt d'un immunoassaig en placa ELISA amb detecció quimioluminiscent per a la quantificació d'IgE específica. L'assaig desenvolupat va permetre determinar IgE específica per baix de 0.1 IU/mL (0.24 ng/mL), el que permet la identificació de pacients al·lèrgics amb més sensibilitat, utilitzant només 25 ¿L de mostra (sèrum). L'immunoassaig mostra una bona sensibilitat (64.6%), així com una excel·lent especificitat (100%), que milloren significativament el caràcter predictiu de les proves in vitro existents. A continuació, es va abordar l'obtenció i la caracterització de proteïnes recombinants similars a les IgE específiques dels ß-lactàmics utilitzant la metodologia Phage Display. La primera aproximació és una proteïna formada per dos nanoanticossos que mimetitza el comportament d'una IgE específica. D'aquesta manera, es van obtenir proteïnes recombinants en què un dels nanoanticossos reconeix selectivament un determinant antigènic d'un antibiòtic ß-lactàmic, mentre que l'altre reconeix específicament el paràtop d'un anticòs detector anti-IgE (Omalizumab). Aquestes construccions van resultar estables i funcionals. El paper d'aquestes proteïnes recombinants com a calibrador homòleg es va estudiar determinant la concentració d'IgE específica a penicil·lina G present en sèrum mitjançant un assaig quimioluminiscent. El mètode desenvolupat duplicava la sensibilitat clínica (66%) respecte del mètode de referència (28%), mentre que mantenia una especificitat clínica del 100%. Assolit aquest punt, la tesi es va centrar en la producció d'IgE específica recombinant utilitzant com a material de partida l'ADN d'un pacient al·lèrgic a amoxicil·lina i penicil·lina G. En combinació amb la metodologia Phage Display, enginyeria d'anticossos i mètodes d'expressió en cèl·lules d'insecte, es va aconseguir produir una IgE específica recombinant. D'aquesta manera, es va obtenir un producte biològic que compleix els requisits per ser adoptat com a material de referència en assajos in vitro. Igualment, es va utilitzar com a calibrador homòleg per a la determinació d'IgE específica a amoxicil·lina. Es va assolir un límit de detecció de 0.05 IU/mL amb què s'aconseguia un augment de la sensibilitat clínica (73%) que quadriplicava al mètode de referència (16%), mantenint l'especificitat clínica al 100%. / [EN] The diagnosis of ß-lactam antibiotics allergy involves using unsatisfactory in vivo tests that are time-consuming and carry the risk of triggering a new allergic reaction. On the other hand, in vitro methods based on allergen-specific IgE immunodetection generate precious information, confirming or ruling out allergies and postulating themselves as a safe diagnostic alternative. Despite this, current in vitro tests lack sensitivity and accuracy, with 81% false negatives limiting their diagnostic use. This has led to a growing demand for new in vitro tests based on the immunodetection of IgE, the most studied biomarker in serum allergy. However, the lack of reference standards for allergen-specific IgE has made it impossible to validate and standardize methods, which means that the results of the different tests are not comparable. Furthermore, this lack of reference standards means that specific IgE concentrations are calculated from a total IgE calibration curve by heterologous interpolation, which has been shown not to be entirely correct. For the reasons mentioned above, the main objective of this doctoral thesis is to design, obtain and characterize recombinant proteins with reactivity against ß-lactam antibiotics. This research begins with developing an ELISA immunoassay with chemiluminescent detection for quantifying specific IgE. The assay developed allowed the determination of specific IgE below 0.1 IU/mL (0.24 ng/mL), thus allowing the identification of allergic patients with greater sensitivity, using only 25 µL of sample (serum). The immunoassay showed good sensitivity (64.6%) and excellent specificity (100%), significantly improving the predictive character of existing in vitro tests. Next, the obtaining and characterizing recombinant proteins similar to ß-lactam-specific IgE was approached using the Phage Display methodology. The first approach deals with a protein consisting of two single-domain antibodies that mimics the behavior of a specific IgE. In this way, recombinant proteins were obtained in which one of the nanobodies selectively recognizes an antigenic determinant of a ß-lactam antibiotic, while the other specifically recognizes the paratope of an anti-IgE detector antibody. These constructs were found to be stable and functional. The role of these recombinant proteins as a homologous calibrator was studied by determining the concentration of penicillin G-specific IgE present in serum by employing a chemiluminescent assay. The developed method doubled the clinical sensitivity (66%) compared to the reference method (28%), while maintaining a clinical specificity of 100%. At this point, the thesis focused on the production of recombinant specific IgE using as starting material the DNA of a patient allergic to amoxicillin and penicillin G. in combination with the Phage Display, antibody engineering and expression methods in insect cells, a recombinant-specific IgE was produced. In this way, a biological product was obtained that meets the requirements for its adoption as reference material in in vitro assays. Likewise, it was used as a homologous calibrator for the determination of specific IgE to amoxicillin. A detection limit of 0.05 IU/mL was achieved, which increased clinical sensitivity (73%) fourfold compared to the reference method (16%), while maintaining clinical specificity at 100%. / This work was supported by CSIC 2007-348, ANII FMV 2019_156321, and ANII FMV 2018_148245. P.Q.-C. acknowledges financial support from Generalitat Valenciana through the research staff training program (GVA ACIF/2018/173). This research was also funded by Agencia Estatal de Investigación (PID2019-110713RB-I00, FEDER), program UPV-La FE 2019 (P105 VALBIOAL), and PROMETEO/ 2020/094 / Quintero Campos, P. (2022). Diseño, obtención y caracterización de proteínas recombinantes a partir de determinantes antigénicos asociadas a reacciones alérgicas a ß-lactámicos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/191429 / Compendio

Se desarrolló cinco sistemas automatizados utilizando análisis por inyección secuencial (SIA) y análisis por inyección en flujo multijeringa (MSFIA). Se desarrolló un SI-analizador para la determinación de formaldehído utilizando la reacción de Hantzsch. El analizador fue aplicado a la monitorización en un cultivo de P. pastoris. Se desarrolló un SI-analizador para la determinación de glicerol y sorbitol. Se utilizó periodato para la reacción de Malaprade. El formaldehído generado fue cuantificado con la reacción de Hantzsch. El sistema incluyó la dilución de la muestra y procedimientos seleccionado por decisión inteligente del programa o por el usuario. Se lo aplicó a la monitorización en cultivos de P. pastoris.Se desarrolló un sistema de electroforesis capilar (CE) acoplado a un SIA aplicado a la separación de nitrofenoles. Se acopló por primera vez MSFIA con CE para pre-concentración en fase sólida y separación de nitrofenoles. Ambos sistemas mostraban recuperaciones satisfactorias para aguas ambientales. / Five analytical systems using Sequential Injection Analysis (SIA) and Multisyringe Flow Injection Analysis (MSFIA) were developed and applied with satisfactory analytical performance. A SI-analyzer for formaldehyde was developed automating Hantzsch reaction. It was successfully applied to formaldehyde monitoring in continuous medium filtrate of P. pastoris cultivation. A second SI-analyzer was developed for the determination of glycerol and sorbitol. Periodate was used as additional reagent to carry out Malaprade reaction and formaldehyde generated by polyalcohol oxidation was quantified. The system included automated sample dilution and procedures for two working ranges, selected by smart software decision or user-input. It was applied to monitoring of P. pastoris cultivations.A capillary electrophoresis (CE) system was developed and coupled to SIA. It was applied to the determination of nitrophenols. MSFIA and CE were coupled for the first time. Solid phase concentration and separation of nitrophenols were automated. The systems were applied to environmental water samples.

[ES] La presente tesis doctoral, titulada "Microportadores inteligentes para la liberación controlada de sustancias de interés nutracéutico", se centra en el diseño y evaluación de sistemas híbridos orgánico-inorgánicos para proteger y liberar controladamente compuestos bioactivos. Dichos sistemas están basados en (i) materiales de sílice, principalmente partículas mesoporosas, como soporte inorgánico para almacenar y proteger la carga bioactiva; y (ii) una capa externa de biomoléculas como puerta molecular, que regula la liberación de la carga ante ciertos estímulos. En el primer capítulo de la tesis se describe el ácido oleico como puerta molecular. Este capítulo se subdivide en tres artículos diferentes, con distintos objetivos. En el primer artículo se emplea por primera vez el ácido oleico como puerta molecular de un soporte mesoporoso, cargado con la molécula modelo rodamina B. El material preparado es capaz de proteger la carga en las condiciones presentes en la boca y en el estómago, e inducir su liberación en el intestino con la acción surfactante de las sales biliares. El sistema se ha empleado para la liberación de vitamina B2, demostrando así la utilidad del diseño para la protección y liberación controlada de nutracéuticos. El segundo artículo evalúa la efectividad de esta puerta molecular en diferentes tipos de partículas mesoporosas de sílice, con diversos tamaños y estructuras de poro (MCM-41, MCM-48, SBA-15 y UVM-7). En todos los sistemas estudiados, la puerta molecular es capaz de mantener protegidas las moléculas cargadas, y liberarlas ante la presencia de sales biliares. El sólido basado en la estructura de UVM-7 se validó in vivo, observándose un retraso en la absorción intestinal de la rodamina gracias a su encapsulación. Por último, el tercer artículo incluido en este capítulo ha estudiado la posibilidad de incorporar puertas moleculares en filosilicatos. Se ha conseguido la protección y liberación controlada de biomoléculas de gran tamaño implicadas en el metabolismo humano (vitamina B12 y hematina) empleando filosilicatos funcionalizados con ácido oleico como puerta molecular. El segundo capítulo describe por primera vez el uso de la proteína zeína (prolamina de maíz) como puerta molecular. La presencia de la prolamina de maíz inhibe la salida de los compuestos antimicrobianos encapsulados (timol, carvacrol y cinamaldehído) liberándolos en presencia de las enzimas proteolíticas excretadas durante el crecimiento bacteriano. De todos los materiales desarrollados, el sistema cargado con cinamaldehído ha demostrado una inhibición del crecimiento de E. coli superior a la del compuesto libre. Finalmente, el tercer capítulo estudia la efectividad de la lactosa como puerta molecular para proteger aceites esenciales y liberarlos solo en las condiciones presentes en el intestino. Se han preparado tres materiales diferentes basados en MCM-41, cargados con timol, eugenol y cinamaldehído, y funcionalizados con lactosa para inhibir la salida de los compuestos. La acción enzimática de la lactasa secretada en el intestino es capaz de hidrolizar la puerta molecular en los correspondientes monosacáridos, liberando la carga a lo largo del lumen intestinal. Los microdispositivos diseñados han sido validados in vitro con células Caco-2, donde se ha observado el aumento de la capacidad citotóxica del cinamaldehído y la disminución de la permeabilidad a través del modelo de membrana intestinal gracias a su encapsulación. Finalmente, el microdispositivo cargado con cinamaldehído se ha validado in vivo ratificándose la disminución de la permeabilidad del compuesto y su mayor permanencia en el lumen intestinal. Así, la presente tesis doctoral ha demostrado la posibilidad de emplear biomoléculas sencillas de grado alimentario como puertas moleculares sobre diversos materiales de sílice. Estos nuevos sistemas han permitido proteger y liberar control / [CA] La present tesi doctoral, titulada "Microportadors intel·ligents per a l'alliberament controlat de substàncies d'interès nutracèutic", se centra en el disseny i avaluació de sistemes híbrids orgànic-inorgànics per a la protecció i alliberament controlat de compostos bioactius. Aquests sistemes estan basats en (i) materials de sílice, principalment partícules mesoporoses, com a suport inorgànic per emmagatzemar i protegir la càrrega bioactiva; i (ii) una capa externa de biomolècules com a porta molecular, que regula l'alliberament d'aquesta càrrega davant de determinats estímuls. En el primer capítol de la tesi es descriu l'àcid oleic com a porta molecular. Aquest capítol se subdivideix en tres articles diferents, amb objectius diferents. En el primer article s'empra per primera vegada l'àcid oleic com a porta molecular d'un suport mesoporós, carregat amb la molècula model rodamina B. El material preparat és capaç de protegir la càrrega en les condicions presents a la boca i a l'estómac, i induir el seu alliberament a l'intestí amb l'acció surfactant de les sals biliars. El sistema s'ha emprat per a l'alliberament de vitamina B2, demostrant així la utilitat del disseny per a la protecció i alliberament controlat de nutracèutics. El segon article avalua l'efectivitat d'aquesta porta molecular en diferents tipus de partícules mesoporoses de sílice, amb diverses mides i estructures de porus (MCM-41, MCM-48, SBA-15 i UVM-7). En tots els sistemes estudiats, la porta molecular és capaç de mantindre protegides les molècules carregades, i alliberar-les davant la presència de sals biliars. El sòlid basat en l'estructura de UVM-7 es validà in vivo, observant-se un retard en l'absorció intestinal de la rodamina gràcies a la seua encapsulació. Finalment, en el tercer article inclòs en aquest capítol s'ha estudiat la possibilitat d'incorporar portes moleculars en fil·losilicats. S'ha aconseguit la protecció i alliberament controlat de biomolècules de grans dimensions implicades en el metabolisme humà (vitamina B12 i hematina) emprant fil·losilicats funcionalitzats amb àcid oleic com a porta molecular. El segon capítol descriu per primera vegada l'ús de la proteïna zeïna (prolamina de dacsa) com a porta molecular. La presència de la prolamina de dacsa inhibeix la sortida dels compostos antimicrobians encapsulats (timol, carvacrol i cinamaldèhid) alliberant-los en presència dels enzims proteolítics excretades durant el creixement bacterià. De tots els materials desenvolupats, el sistema carregat amb cinamaldèhid ha demostrat una inhibició de l'creixement d'E. coli superior a la del compost lliure. Finalment, el tercer capítol estudia l'efectivitat de la lactosa com a porta molecular per protegir olis essencials i alliberar-los només en les condicions presents a l'intestí. S'han preparat tres materials diferents basats en MCM-41, carregats amb timol, eugenol i cinamaldèhid, i funcionalitzats amb lactosa per inhibir l'eixida dels compostos. L'acció enzimàtica de la lactasa secretada a l'intestí és capaç d'hidrolitzar la porta molecular en els corresponents monosacàrids, alliberant la càrrega al llarg del lumen intestinal. Els microdispositius dissenyats s'han validat in vitro amb cèl·lules Caco-2, on s'observà l'augment de la capacitat citotòxica del cinamaldèhid i la disminució de la permeabilitat a través del model de membrana intestinal gràcies a la seua encapsulació. Finalment, el microdispositiu carregat amb cinamaldèhid s'ha validat in vivo ratificant la disminució de la permeabilitat del compost i la seua major permanència al lumen intestinal. Així, la present tesi doctoral ha demostrat la possibilitat d'emprar biomolècules senzilles de grau alimentari com portes moleculars sobre diversos materials de sílice. Aquests nous sistemes han permès protegir i alliberar controladament diferents nutracèutics, millorant així la seua biodisponibilitat. / [EN] This PhD thesis, entitled "Smart microdevices for nutraceutical-delivery", is focused on the design and evaluation of organic-inorganic hybrid systems for the protection and controlled release of bioactive molecules. These systems are based on (i) silica materials, mainly mesoporous particles, as inorganic support to store and protect the bioactive cargo; and (ii) an outer layer of biomolecules that regulate the payload release triggered by certain stimuli. In the first chapter of the thesis oleic acid is described as a molecular gate. This chapter is subdivided into three different articles, with different objectives. In the first article, oleic acid is used for the first time as molecular gate of a mesoporous support, loaded with the rhodamine B model molecule. The designed material is capable of protecting the cargo under the conditions present in the mouth and stomach, and inducing its release in the small intestine with the surfactant action of bile salts. The system has been used for the release of vitamin B2, thus demonstrating the validity of the design for the protection and controlled release of nutraceuticals. The second article evaluates the effectiveness of this molecular gate in different types of mesoporous silica particles, with different sizes and pore structures (MCM-41, MCM-48, SBA-15 and UVM-7). In all the systems studied, the molecular gate is capable of keeping cargo molecules protected and releasing them in the presence of bile salts. The solid based on the structure of UVM-7 was validated in vivo, observing a delay in the intestinal absorption of rhodamine thanks to its encapsulation. Lastly, the third article included in this chapter has studied the possibility of incorporating molecular gates onto phyllosilicates. The protection and controlled release of large biomolecules involved in human metabolism (vitamin B12 and hematin) have been achieved using phyllosilicates functionalized with oleic acid as molecular gate. The second chapter describes for the first time the use of the protein zein (corn prolamine) as a molecular gate. The presence of corn prolamine inhibits the release of encapsulated antimicrobial compounds (thymol, carvacrol and cinnamaldehyde) releasing them in the presence of the proteolytic enzymes excreted during bacterial growth. Among all the materials developed, the cinnamaldehyde-loaded system has shown greater inhibition of E. coli growth than the free compound. Finally, the third chapter studies the effectiveness of lactose as a molecular gate to protect essential oils and release them only under the conditions present in the intestine. Three different materials based on MCM-41 loaded with thymol, eugenol, and cinnamaldehyde, and functionalized with lactose to inhibit the release of the compounds have been prepared. The enzymatic action of the lactase secreted in the intestine is capable of hydrolyzing the molecular gate into the corresponding monosaccharides, thus releasing the cargo along the intestinal lumen. The designed microdevices have been validated in vitro with Caco-2 cells, where an increase in the cytotoxic capacity of cinnamaldehyde and a decrease in permeability through the intestinal membrane model have been observed thanks to its encapsulation. Finally, the cinnamaldehyde-loaded microdevice has been validated in vivo, confirming the decrease in the permeability of the compound and its greater permanence in the intestinal lumen. Thus, the present PhD thesis has demonstrated the possibility of using simple food-grade biomolecules as gatekeepers on various silica materials. These new systems have allowed the protection and controlled release of different nutraceuticals, thus improving their bioavailability. / The authors also thank the Electron Microscopy Service at the UPV for support. The authors also thank Prof. Pedro Amorós for his explanations and guidance on the knowledge of phyllosilicates. / Poyatos Racionero, E. (2020). Smart microdevices for nutraceutical-controlled delivery [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/159247

Tesis por compendio / [ES] La presente tesis doctoral se centra en el diseño, síntesis y caracterización de varios nanodispositivos híbridos orgánico-inorgánicos, utilizando como soporte nanopartículas de sílice mesoporosa equipadas con enzimas y puertas moleculares, los cuales muestran capacidades comunicativas además de la evaluación de diferentes estrategias de comunicación. El primer capítulo incluye un resumen de diferentes conceptos sobre los que se fundamentan los estudios realizados tales como nanotecnología, materiales de sílice mesoporosa, materiales con puertas moleculares que reaccionan a estímulos específicos, partículas Janus y biocomputación. Finalmente, se incluyen conceptos básicos acerca de la comunicación química, materiales y estrategias empleados hasta ahora y ejemplos representativos. A continuación, en el segundo capítulo, se presentan los objetivos generales de esta tesis doctoral que son abordados en los siguientes capítulos experimentales. El tercer capítulo muestra un sistema de biocomputación para liberación basado en nanopartículas Janus de oro-sílice mesoporosa capaces de comunicarse con el entorno procesando la información e imitando la función lógica booleana propia de un demultiplexer y que resulta en la liberación controlada de la carga. Se muestra que dicho nanodispositivo puede llevar a cabo sus funciones en medios complejos como en células cancerígenas. En el cuarto capítulo, se presenta un modelo circular de comunicación dentro de una red de tres nanopartículas diferentes basado en el intercambio jerárquicamente programado de mensajes químicos. La parte mesoporosa del nanodispositivo 1 (S1βgal) es cargada con la especie fluorescente [Ru(bpy)3]Cl2 y tapada con cadenas de oligo(etilenglicol) que contienen puentes disulfuro y que funcionan como puertas moleculares, mientras que la enzima β-galactosidasa es unida a la parte del oro. En la nanopartícula 2 (S2galox), la enzima galactosa oxidasa es inmovilizada en la cara del oro mientras que la sílice mesoporosa es cargada con 4-(bromometil)benzoato de metilo y los poros tapados con un derivado de arilboronato autoinmolante sensible a H2O2 que forma un complejo huéspedanfitrión con β-ciclodextrina. Finalmente, el nanodispositivo 3 (S3est) es funcionalizado con la enzima esterasa en la parte del oro, cargada con la especie reductora hidroclururo de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) en la parte mesoporosa y tapada con una nanoválvula supramolecular que responde a pH (βciclodextrina:benzimidazol). En el quinto capítulo, se muestra un modelo interactivo de comunicación química entre una nanopartícula Janus abiótica y un organismo vivo (Saccharomyces cerevisiae). En particular, el nanodispositivo está basado en nanopartículas funcionalizadas con glucosa oxidasa en la parte del oro, cargadas con el genotóxico fleomicina y tapadas con la puerta molecular sensible a pH (βciclodextrina:benzimidazol). El microorganismo usado en el estudio es una levadura modificada que expresa GFP bajo el control del promotor del gen RNR3; la transcripción de dicho gen es inducida con la exposición a agentes que dañan el ADN. La ruta de comunicación interactiva empieza con la adición de sacarosa (estímulo de entrada) la cual es hidrolizada en glucosa por la invertasa localizada en el espacio periplásmico de las levaduras y que difunde al nanodispositivo donde es trasformada en el correspondiente ácido por la glucosa oxidasa de la parte del oro. La bajada local de pH da lugar a la apertura de la nanoválvula sensible a pH del nanovehículo y con ello a la liberación de fleomicina (mensaje de vuelta) que induce la expresión de GFP (señal de salida) en las levaduras. En el sexto capítulo, proponemos una estrategia para establecer una comunicación lineal entre dos microorganismos diferentes que no interactúan entre ellos mediada por un nanodispositivo que actúa como traductor químico. Finalmente, las conclusiones generales de la presente tesis doctoral son expuestas en el capítulo siete. El estudio de las capacidades comunicativas de los nanodispositivos mesoporosos funcionalizados con enzimas permite la construcción de estrategias de cooperación entre diferentes entidades que permiten funcionalidades que van más allá que aquellas llevadas a cabo por agentes individuales. / [CA] La present tesi doctoral es centra en el disseny, síntesi i caracterització de diversos nanodispositius híbrids orgànic-inorgànics, utilitzant com a suport nanopartícules de sílice mesoporosa equipades amb enzims i portes moleculars, i que mostren capacitats comunicatives a més de l’avaluació de diferents estratègies de comunicació. El primer capítol inclou un resum de diferents conceptes sobre els quals es fonamenten els estudis realitzats com ara nanotecnologia, materials de sílice mesoporosa, materials amb portes moleculars que reaccionen a estímuls específics, partícules Janus i biocomputació. Finalment, s’inclouen conceptes bàsics sobre la comunicació química, materials i estratègies utilitzades fins ara i exemples representatius. A continuació, en el segon capítol, es presenten els objectius generals d’aquesta tesi doctoral que són abordats en els següents capítols experimentals. El tercer capítol mostra un sistema de biocomputació per alliberament basat en nanopartícules Janus d’or-sílice mesoporosa capaços de comunicar-se amb l’entorn processant la informació i imitant la funció lògica booleana pròpia d’un demultiplexer i que resulta en l’alliberament controlat de la càrrega. Es mostra que aquest nanodispositiu pot dur a terme les seves funcions en mitjans complexos com en cèl·lules canceroses. En el quart capítol, es presenta un model circular de comunicació dins d’una xarxa de tres nanopartícules diferents basat en l’intercanvi jeràrquicament programat de missatges químics. La part mesoporosa del nanodispositiu 1 (S1βgal) es carrega amb l’espècie fluorescent [Ru(bpy)3]Cl2 i es tapa amb cadenes d’oligo(etilenglicol) que contenen ponts disulfur i que funcionen com portes moleculars, mentre que l’enzim β-galactosidasa s’immobilitza a la part de l’or. A la nanopartícula 2 (S2galox), l’enzim galactosa oxidasa s’immobilitza a la cara de l’or mentre que la sílice mesoporosa es carrega amb 4-(bromometil)benzoat de metil i els porus són tapats amb un derivat d’arilboronat autoimmolant sensible a H2O2 que forma un complex hoste-amfitrió amb β-ciclodextrina. Finalment, el nanodispositu 3 (S3est) es funcionalitza amb l’enzim esterasa en la part de l’or, es carrega amb l’espècie reductora hidroclurur de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) a la part mesoporosa i es tapa amb una nanoválvula supramolecular que respon a pH (β-ciclodextrina:benzimidazol). En el cinqué capítol, es mostra un model interactiu de comunicació química entre una nanopartícula Janus abiòtica i un organisme viu (Saccharomyces cerevisiae). En particular, el nanodispositiu està basat en nanopartícules funcionalitzades amb glucosa oxidasa en la part de l’or, carregades amb el genotòxic fleomicina i tapades amb la porta molecular sensible a pH (βciclodextrina:benzimidazol). El microorganisme utilitzat en l’estudi és un rent modificat que expressa GFP sota el control del promotor del gen RNR3; la transcripció d’aquest gen és induïda amb l’exposició a agents que danyen l’ADN. La ruta de comunicació interactiva comença amb l’addició de sacarosa (estímul d’entrada) la qual és hidrolitzada en glucosa per la invertasa localitzada en l’espai periplasmàtic dels rents i que difon al nanodispositiu on és transformada en el corresponent àcid per la glucosa oxidasa de la part de l’or. La baixada local de pH dona lloc a l’obertura de la nanoválvula sensible a pH del nanovehicle i amb això l’alliberament de fleomicina (missatge de tornada) que indueix l’expressió de GFP (senyal de sortida) en el rent. En el sisé capítol, proposem una estratègia per establir una comunicació lineal entre dos microorganismes diferents que no interactuen entre ells facilitada per un nanodispositiu que actua com a traductor químic. Finalment, les conclusions generals de la present tesi doctoral són exposades en el capítol set. L’estudi de les capacitats comunicatives dels nanodispositius mesoporosos funcionalitzats amb enzims permet la construcció d’estratègies de cooperació entre diferents entitats que permeten funcionalitats que van més enllà que aquelles dutes a terme per agents individuals. Esperem que els resultats obtinguts inspiren aplicacions futures en diferents àrees com ara biomedicina, nanorobots, materials que imiten la naturalesa i tecnologies de la informació. / [EN] This PhD Thesis is focused on the design, synthesis and characterization of several hybrid organic-inorganic nanodevices using mesoporous silica nanoparticles equipped with enzymes and molecular gates which display communication capabilities as well as the design and evaluation of different communication strategies. The first chapter includes an overview of the different concepts which lay the foundations of the presented studies such as nanotechnology, mesoporous silica materials, stimuli-responsive gated materials, Janus particles and biocomputing. Basic concepts of chemical communication, materials and enabling technologies employed so far and representative examples in this field are also included. Next, in the second chapter, the general objectives of this PhD Thesis that are addressed in the following experimental chapters are presented. The third chapter shows a biocomputing delivery system based on Janus gold-mesoporous silica nanoparticles capable of chemically communicating with the environment and processing the information mimicking a demultiplexer Boolean logic function which results in a programmed cargo release. Finally, it is shown that such nanodevice is operative in complex media such as cancer cells. In the fourth chapter, it is presented a circular model of communication within a network of three different nanoparticles based on the hierarchically programmed exchange of chemical messages. The mesoporous face of nanodevice 1 (S1βgal) is loaded with the fluorescent dye [Ru(bpy)3]Cl2 and capped with disulfidecontaining oligo(ethylene glycol) chains acting as gatekeepers, whereas the enzyme β-galactosidase is attached to the gold face. In nanoparticle 2 (S2galox), the enzyme galactose oxidase is immobilized on the Au face, while the mesoporous silica is loaded with methyl 4-(bromomethyl)benzoate and the mesopores capped with a H2O2-sensitive self-immolative arylboronate derivative which forms a host-guest complex with β-cyclodextrin. Finally, the nanodevice 3 (S3est) is functionalized with the enzyme esterase on the Au face, loaded with the reductive species tris(2- carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) in the mesoporous face and capped with a pH-responsive supramolecular nanovalve (β-cyclodextrin:benzimidazole). In the fifth chapter, it is showed an interactive model of chemical communication between an abiotic Janus nanoparticle and a living organism (Saccharomyces cerevisiae). In particular, the nanodevice is based on Janus goldmesoporous silica nanoparticles functionalized with glucose oxidase on the Au face, loaded with the genotoxin phleomycin and capped with a pH-responsive (βcyclodextrin:benzimidazole) gatekeeper. The microorganism used in the studies is an engineered budding yeast that expresses GFP under the control of the RNR3 promoter; RNR3 gene transcription is induced upon exposure to DNA-damaging agents. The interactive communication pathway starts with the addition of sucrose (input) which is hydrolyzed into glucose by invertase located in periplasmic space of yeasts and diffuses to the nanodevice where it is transformed into the corresponding acid by glucose oxidase on the Au face. The local drop in pH leads to uncapping of the pH-sensitive nanovalve in the nanocarrier and the release of phleomycin (feedback messenger) that induces GFP expression (output) in yeasts. In the sixth chapter, we propose a strategy to establish linear communication between two different non-interacting microorganisms mediated by a nanodevice which acts as a chemical “nanotranslator”. Finally, the general conclusions from this PhD Thesis are presented in chapter seven. The study of communication capabilities of enzyme-functionalized mesoporous nanodevices enables the construction of strategies of cooperation between different entities allowing sophisticated functionalities that go beyond those carried out by individual agents. We hope that the obtained results inspire future applications in different areas such as biomedicine, nanorobots, life-like materials and information technologies. / The authors wish to thank the Spanish Government (projects RTI2018-100910-B-C41 and RTI2018-101599-B-C22 (MCUI/AEI/FEDER, UE), CTQ2017-87954-P), the Generalitat Valenciana (PROMETEO 2018/024), the Comunidad de Madrid (IND2017/BMD7642) and CIBER-BBN (NANOCOMMUNITY project) for support. / De Luis Fernández, B. (2021). Development of enzyme-functionalized hybrid mesoporous nanodevices for advanced chemical communication [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/171506 / Compendio

[ES] El cuidado de la salud es un campo en el que la detección precoz de enfermedades está cobrando cada vez más importancia. Hoy en día, profesionales y ciudadanos demandan que las técnicas de diagnóstico sean de alta calidad, tanto para el sistema de sanidad privado como para el público. Cuando se utilizan técnicas de diagnóstico de manera inadecuada, eso puede acarrear bastantes consecuencias, tales como un serio peligro sobre la salud y la sobrecarga técnica y económica de los servicios de salud. Eso es debido a que las técnicas de diagnóstico disponibles hoy en día son demasiado costosas, centralizadas en laboratorios y necesitan profesionales altamente cualificados para poder llevar a cabo dichas tareas, lo que conllevaría una demora en el tiempo, siendo este muchas veces vital para los enfermos. Es muy necesario, por lo tanto, reflexionar sobre la necesidad y emergencia de tales prácticas preventivas, especialmente para enfermedades de alto riesgo como el cáncer, el Alzheimer o la primera causa de muerte en el mundo, las enfermedades cardiovasculares. En este contexto, el objetivo principal del trabajo realizado durante esta Tesis Doctoral es ayudar a superar estos problemas mediante la exploración de la posibilidad de utilizar tecnología fotónica para el desarrollo de sistemas de análisis que puedan ser utilizados para el diagnóstico y pronóstico de las enfermedades cardiovasculares. Este objetivo se ha abordado mediante la combinación de la tecnología nanofotónica, consistiendo en la nanofabricación de las estructuras PBG de sensado que ofrece varios beneficios, como una alta sensibilidad, una extrema reducción de tamaño y un proceso de fabricación compatible con el de la industria microelectrónica, con un método de biofuncionalización obteniendo una capa de bioreconocimiento estable y selectiva mediante el uso de la reacción TEC asistida por luz capaz de proporcionar unas capas de bio-reconocimiento extremadamente finas con una inmovilización espacialmente selectiva. / [CA] L'atenció a la salut és un camp en què la detecció precoç de malalties està cobrant cada vegada més importància. Hui en dia, professionals i ciutadans demanen que les tècniques de diagnòstic siguin d'alta qualitat, tant per al sistema de sanitat privat com per al públic. Quan s'utilitzen tècniques de diagnòstic de manera inadequada, això pot comportar bastants conseqüències, com ara, un seriós perill sobre la salut i la sobrecàrrega tècnica i econòmica dels serveis de salut. Això és degut al fet que les tècniques de diagnòstic disponibles hui en dia són molt costoses, centralitzades en laboratoris i necessiten professionals altament qualificats per poder realitzar aquestes tasques, lo que comportaria a una demora en el temps que moltes vegades es vital pels malalts. És molt necessari, per tant, reflexionar sobre la necessitat i emergència de tals practiques preventives, especialment per a malalties d'alt risc com el càncer, l'Alzheimer o la primera causa de mort al món, les malalties cardiovasculars. En aquest context, l'objectiu principal del treball realitzat durant aquesta Tesi Doctoral és ajudar a superar aquests problemes mitjançant l'exploració de la possibilitat d'utilitzar tecnologia fotònica per al desenvolupament de sistemes d'anàlisis que puguin ser utilitzats per al diagnòstic i pronòstic de les malalties cardiovasculars. Aquest objectiu s'ha abordat mitjançant la combinació de la tecnologia nanofotònica, consistint en la nanofabricació de les estructures de detecció de PBG fotòniques que ofereix diversos beneficis, com una alta sensibilitat, una extrema reducció de mida i un procés de fabricació compatible amb el de la indústria microelectrònica, amb un mètode de biofuncionalització obtenint una capa de bio-reconeixement estable i selectiva mitjançant l'ús de la reacció TEC assistida per llum capaç de proporcionar unes capes de bioreconeixement extremadament fines amb una immobilització espacialment selectiva. preventives, especialment per a malalties d'alt risc com el càncer, l'Alzheimer o la primera causa de mort al món, les malalties cardiovasculars. En aquest context, l'objectiu principal del treball realitzat durant aquesta Tesi Doctoral és ajudar a superar aquests problemes mitjançant l'exploració de la possibilitat d'utilitzar tecnologia fotònica per al desenvolupament de sistemes d'anàlisis que puguin ser utilitzats per al diagnòstic i pronòstic de les malalties cardiovasculars. Aquest objectiu s'ha abordat mitjançant la combinació de la tecnologia nanofotònica, consistint en la nanofabricació de les estructures de detecció de PBG fotòniques que ofereix diversos beneficis, com una alta sensibilitat, una extrema reducció de mida i un procés de fabricació compatible amb el de la indústria microelectrònica, amb un mètode de biofuncionalització obtenint una capa de bio-reconeixement estable i selectiva mitjançant l'ús de la reacció TEC assistida per llum capaç de proporcionar unes capes de bioreconeixement extremadament fines amb una immobilització espacialment selectiva. / [EN] Healthcare is a field where the early detection of diseases is becoming more and more important. Nowadays, professionals and citizens demand high quality diagnosis techniques offered by both private and public health systems. When the application of diagnostic tests is not adequate, different consequences can be observed such as health hazard and technical and economic overload of health services. This is due to the fact that the diagnostic techniques available are expensive, centralized in laboratories and with the need for highly qualified professionals to carry out these tasks, what can fundamentally lead to delays in time, being critical for the patient's health. It is very necessary, therefore, to reflect on the need and emergency of such preventive practices, especially for high-risk diseases such as cancer, Alzheimer or the first cause of death in the world, the cardiovascular diseases. Within this context, the main objective of the work done during this PhD Thesis is to help on overcoming these problems by exploring the possibility of using photonic technology for the development of analysis devices which might be used for the early diagnosis and prognosis of cardiovascular diseases. This objective has been addressed by combining nanophotonic technology, by the nanofabrication of the photonic PBG sensing structures, which provides several benefits such as a high sensitivity, an extreme size reduction and a fabrication process being compatible with that from the microelectronics industry, with a light-assisted biofunctionalization method forming a stable and selective biorecognition layer using TEC reaction able to provide extremely thin biorecognition layers with a spatially-selective immobilization. / Sabek, J. (2019). Combination of nanophotonic biosensors and light-assisted immobilization procedures for the detection of cardiac biomarkers [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/124821