Unidad de práctica para optar al título de Químico Farmacéutico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas

En esta Memoria se estudió la reactividad de tres nuevas 1,4-dihidropiridinas (1,4-DHP) frente al anión radical superóxido (O2 .-), y se evaluó la influencia de los sustituyentes en posición 4 del anillo dihidropiridínico. Estas moléculas también se caracterizaron electroquímicamente mediante Voltamperometría de pulso diferencial (VPD), Voltamperometría cíclica (VC), electrólisis a potencial controlado (EPC) y Voltamperometría de barrido lineal con electrodo de disco rotatorio (DR). Los estudios electroquímicos demuestran que en medio acuoso las 1,4-dihidropiridinas son más fáciles de oxidar a pHs básicos, mostrando el siguiente orden en cuanto a la facilidad de oxidación: 4-HIDROXIFENIL-DHP (4-OH-DHP) > 3-HIDROXIFENIL-DHP (3-OH-DHP) > 4-FENIL-DHP (DHP). Este mismo orden se observó en medio no acuoso. La oxidación de las 1,4-DHPs en ambos medios correspondió a un proceso irreversible, en que la corriente fue controlada por difusión. La cinética de reacción fue seguida mediante espectroscopía UV-Visible con arreglo de diodos. Las constantes de formación del anión dihidropiridínico se calcularon usando un equipo de flujo retenido. El orden para la constante fue: NADH > 4-OH-DHP > 3-OH-DHP > DHP. Por otra parte, las constantes cinéticas para la reacción entre el anión radical superóxido y las DHPs fueron calculadas a través de cinética continua. Claramente, las DHPs que tienen un grupo hidroxifenilo en la posición 4 del anillo dihidropiridínico presentaron constantes cinéticas significativamente mayores que las 1,4-DHP comerciales estudiadas con el siguiente orden: 3-OH-DHP > 4-OHDHP > DHP > AMLODIPINO > NISOLDIPINO > NIMODIPINO. La reactividad entre el anión superóxido y las 1,4-DHPs ocurriría a través de un mecanismo que incluye en una primera etapa la rápida formación del anión dihidropiridínico, el que se forma como resultado de un equilibrio ácido-base entre anión radical superóxido que actúa como base de Brönsted, y la 1,4-dihidropiridina, posteriormente, el anión dihidropiridínico actuaría como reservorio para reponer la 1,4-dihidropiridina que se está oxidando a piridina en un proceso que duraría en total 6 horas aproximadamente.

Memoria para optar al Título de Químico Farmacéutico / El quillay, Quillaja saponaria Mol., perteneciente a la familia Quillajaceae, es un árbol que crece en gran parte de la zona central de Chile tanto en el litoral como en el valle. Este árbol sido usado desde la época precolombina como detergente, debido a su gran cantidad de saponinas. El producto de hidrólisis del extracto acuoso obtenido de la biomasa de quillay, es rico en sapogeninas. Estudios anteriores han reportado la presencia de algunas geninas tales como ácido quillaico, ácido fitolagénico, ácido equinocístico y gipsogenina entre otras. Las sapogeninas triterpénicas pentacíclicas han demostrado tener efecto inhibitorio sobre la enzima glicógeno fosforilasa a. Para el presente trabajo se sometió a hidrólisis el extracto acuoso obtenido desde la biomasa de quillay con HCl al 18 % y calentamiento a reflujo. El producto de hidrólisis obtenido se lavó sucesivamente con dos porciones de 10 ml de NaOH 0,05 M para eliminar las trazas de compuestos fenólicos que pudiesen quedar en el producto de hidrólisis. Éste fue fraccionado mediante sucesivas columnas cromatográficas con relleno sílica gel 60, de las cuales se obtuvo 5 grupos de fracciones denominadas Pol-1, Pol-2, Pol-3, Pol-4, Pol-5. Los 5 grupos de fracciones obtenidos y el producto de hidrólisis fueron evaluados mediante el ensayo de inhibición de la enzima glicógeno fosforilasa a. Los porcentajes de inhibición obtenidos demuestran que estos grupos de fracciones no inhiben la enzima glicógeno fosforilasa a. La identificación de las geninas minoritarias del producto de hidrólisis, se realizó mediante la metodología CLAE-UV-IES-MS. Los resultados nos permiten postular la presencia de ácido quillaico y otras sapogeninas no reportadas anteriormente, como es el caso de la arjungenina y la fitolacagenina. Para estas tres sapogeninas identificadas se propuso una ruta de fragmentación, la cual al contener puntos comunes para estos núcleos triterpénicos, serían una herramienta útil en la identificación de otras sapogeninas triterpénicas pentacíclicas

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / La exposición al frío, activa los nervios simpáticos periféricos y aumenta la tasa de recambio de noradrenalina en órganos con inervación simpática. Este aumento de las concentraciones de noradrenalina en una madre gestante sometida a estrés por frío de 4ºC por 3 horas diarias durante el periodo gestacional, causarían: a.- vasoconstricción a nivel placentario acompañado de una hipoxia fetal, y/o b.- proliferación de la vasculatura placentaría. Tales mecanismos adaptativos debido a la hipoxia fetal, podrían involucrar una entrega mayor de nutrientes y hormonas y gatillar mecanismos adaptativos del feto para sobrevivir a estas nuevas condiciones, especialmente en la función cardiaca. Inicialmente esta adaptación presentará un beneficio en términos de supervivencia, pero posteriormente podría gatillar hipertrofia cardiaca. Así, este estudio evaluó el efecto sobre la morfología cardiaca producida por exposición fetal a estrés por frío crónico (4°C, 3h/día, 21 días), en la descendencia de machos y la respuesta a la estimulación β-adrenérgica (Isoproterenol) en ratas adultas. Para ello, se uso ratas machos Sprague-Dawley en distintas etapas de crecimiento (neonatal, prepúberal y adultas) utilizando ratas de la misma edad- no estresadascomo control. Utilizando parámetros morfométricos (Masa cardiaca total (MCT)/ masa corporal (MC) y masa ventricular (MV)/ masa corporal), medición de área y perímetro en cardiomiocitos y marcadores bioquímicos tales como cadena pesada de β- Miosina (β-MHC) y colágeno tipo I, no se encontraron cambios en todos los grupos de estudio: neonatos, prepúberes y adultos, indicando que no hay hipertrofia ni fibrosis cardiaca. Por último, para evaluar el efecto de la estimulación β-adrenérgica in vivo de los animales, administramos por vía SC, el agonista adrenérgico Isoproterenol (1 mg/Kg peso/día/ 10 días en ratas adultas), para inducir hipertrofia y fibrosis. Las crías prenatalmente expuestas a estrés presentan una mayor respuesta al medicamento expresado como mayor respuesta hipertrófica, pero no así fibrótica en comparación a las ratas del grupo control. Además, presentaron una alta tasa de mortalidad en respuesta al tratamiento sugiriendo fuertemente una mayor sensibilidad a la droga. El conjunto de estos resultados nos sugieren que la sobreactivación simpática durante el embarazo debido al estrés, afecta la función cardíaca de la progenie de una forma que apoya fuertemente una programación de la función cardiaca y con ello, una mayor sensibilidad a una nueva estimulación adrenérgica cuando adultos

Unidad de práctica para optar al título de Químico Farmacéutico / El siguiente trabajo muestra el desarrollo de un preparado oftálmico específicamente de pilocarpina clorhidrato en forma de colirio, con el fin de ampliar el arsenal terapéutico del laboratorio Sanderson S.A. Esto se llevó a cabo en el Departamento de Desarrollo del laboratorio y se divide en las siguientes etapas: En un comienzo se realizó la formulación del colirio el cual, fue llevado a un estudio de estabilidad acelerado y de estantería controlándose las características fisicoquímicas del colirio como el pH, las características organolépticas y el control microbiológico para detectar la presencia de cualquier patógeno; además de la cuantificación del principio activo a través del análisis por cromatografía de alta eficiencia (HPLC). En una segunda etapa se realizó la validación de la metodología analítica para el producto medio cuyos valores y resultados se encuentran en las páginas siguientes

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Insulina y su receptor (RI) regulan el metabolismo de ácidos grasos y carbohidratos en el corazón. La activación de este receptor por su ligando endógeno desencadena una serie de eventos reguladores de la homeostasis energética del cardiomiocito. Se desconoce el efecto de insulina sobre los niveles de [Ca2+]i, un importante regulador de la contracción y de la transducción de señales en el cardiomiocito. Nuestro objetivo consistió en investigar el mecanismo mediante el cual insulina regula los niveles de [Ca2+]i en cultivos primarios de cardiomiocitos neonatos. Los resultados de inmunofluorescencia y microscopía confocal mostraron que el RI esta presente en la membrana plasmática, citoplasma y región perinuclear en cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas, mientras que en cardiomiocitos adultos sólo se localizó en la membrana plasmática y sus inmediaciones. Los análisis Western blot revelaron que el RI está presente en extractos totales de cardiomiocitos y que al estimularlos con insulina 1 nM se activó la proteína kinasa ERK, un blanco río abajo conocido para el RI. Usando fluo-3AM y microscopía confocal se estableció que insulina aumentó en forma rápida (tiempo máximo: 1s) y transitoria (28 ± 6 seg) los niveles [Ca2+]i, alcanzando una respuesta máxima de 214 ± 31% [(ΔF/F)*100] (n=10) y dependiente de la concentración (0.1-1000 nM). Esta señal fue completamente bloqueada por genisteina (inhibidor inespecífico de tirosinas kinasas). Nifedipino (inhibidor del canal Ca2+ VLtype) bloqueó la señal rápida de Ca2+, dejando en evidencia una segunda señal mas lenta y de menor intensidad. Por otro lado, rianodina (inhibidor del canal de Ca2+ RyR) produjo un efecto similar al de nifedipino, sugiriendo una entrada de Ca2+ desde el espacio extracelular. La inhibición de PI3-K (LY294002), de PLC (U-73122) y la expresión adenoviral de un péptido secuestrador de subunidades βγ de proteína G heterotrimérica (Ad-βARKct), modificaron la cinética de la señal producida por insulina 1nM, registrándose señales rápidas de 1 seg de duración para cualquiera de estas condiciones. La inhibición de la proteína Gi/o con toxina pertussis solo modificó parcialmente el perfil cinético de la señal. De esta forma, nuestros resultados sugieren que aumenta los niveles de [Ca2+]i, a través de un mecanismo que involucra, en una primera etapa a la vía de transducción: IR-Ca2+ VLtype-RyR-Ca2+, y luego a la vía: IR-Gβγ-PI3K-PLC-IP3-Ca2+ / Insulin and its receptor (IR) regulate lipid and carbohydrate metabolism in the cardiac tissue. IR activation triggers a series of regulatory signaling events for cardiomyocyte energy homeostasis. Whether insulin changes intracellular calcium levels, an important second messeger for myocardial contraction remains unknown. Our aim was to investigate the mechanism by which insulin could regulate intracellular calcium levels in cultured neonatal rat cardiomyocytes. Inmunofluorescence and confocal microscopy studies showed that the IR was detected in cytoplasmic membrane, cytoplasm and perinuclear region in primary cultured neonatal cardiomyocytes while in cultured adult rat cardiomyocytes was only located on or nearby the cytoplasmic membrane. Western blots analisis also revealed the presence of IR and the activation of ERK, a target in IR signaling molecule downstream of the IR, in total extract obtained from cardiomyocyte treated with insulin. Using Fluo3-AM and confocal microscopy, we detected that insulin increases fast (maximum after 1 sec) and transient (28 ± 6 sec) intracellular Ca2+ levels, reaching a maximum of 214 ± 1% [(ΔF/F)*100] (n=10). This effect was also concentration-dependent (0.1–1000 nM). This signal was completely blocked by genistein (a general tyrosine kinase inhibitor). Nifedipine (a Ca2+ V L-type channel inhibitor) blocked the first and fast signal of [Ca2+]i, revealing a more slower and smaller second component of the signal. Ryanodine (RyR channel Ca2+ blocker) produced an similar effect than nifedipine, suggesting a Ca2+ entry from the extracellular space. The inhibition of PI3K by LY- 294002, phosphoplipase C by U-73122 and the G protein βγ subunits by adenoviral expresion of a sequestering peptide (Adβarkct), modified the time-course of the insulin-induced signal, detecting fast increases in calcium levels for any of the studied experimental conditions. The inhibition of the αi/o subunit of G protein with pertussis toxin only modified partially the calcium kinetic pattern. Our results collectivelly suggest that insulin increases the [Ca2+]i levels by two signaling pathway, a first one involving the IR-Ca2+ VLtype-RyR-Ca2+ and a second conformed by IR-Gβγ-PI3K-PLC-IP3-Ca2+

Memoria de Título para optar al título de Química Farmacéutica / Los extractos herbales deben ser evaluados en cuanto a eficacia y seguridad. Estudios de toxicidad aguda in vivo deben considerar los diferentes mecanismos por los cuales los principios activos pueden producir toxicidad. Por consiguiente, se desarrolló una metodología para examinar parámetros generales relacionados con la respuesta de toxicidad aguda. Para ello se utilizaron ratas Sprague-Dawley machos las cuales fueron tratadas con dos dosis de Saw Palmetto, Serenoa repens W. Bartram HiPower® (la dosis recomendada para humanos y una dosis 10 veces mayor) durante 10 días. Se evaluaron los parámetros generales homeostáticos (hemograma y perfil bioquímico), así como características morfológicas de tejidos involucrados en la respuesta a xenobióticos (hígado, timo, bazo y ganglios linfáticos). Todos los parámetros analizados no fueron significativamente diferentes en el grupo control como en los tratados con ambas dosis de Saw Palmetto, HiPower®, sugiriendo que este preparado comercial presenta un buen perfil de seguridad durante el periodo de tratamiento evaluado. La diferencia en las dosis utilizadas fue un orden de magnitud y a pesar de ello, no se observaron alteraciones en los parámetros medidos. El protocolo utilizado en este estudio podría ser utilizado para ensayar la toxicidad aguda in vivo de diferentes extractos herbales. / Herbal extracts must be evaluated for their efficacy and safety. In vivo acute toxicity studies must consider the different mechanisms by which active compounds may elicit toxicological outcomes. Thus, a methodology to test general parameters related to acute toxicity responses in a murine model was developed, using a Saw Palmetto, Serenoa repens W. Bartram extract (HiPower®): adult male Sprague-Dawley rats were treated orally with two doses of Saw Palmetto (the recommended dose for humans and a dose 10-fold higher) for 10 days, to examine general homeostatic parameters (hemogram and clinical chemistry) as well as morphological features of tissues involved in the response to xenobiotics (liver, timus, spleen, and lymphatic ganglia). All the parameters assayed did not undergo significant changes during treatment, suggesting that the commercial extract of Saw Palmetto HiPower® displays a good safety profile for the period tested. The doses assayed spanned over one order of magnitude in the drug concentration and we did not observe differences in the parameters assayed. This method may be adopted for testing the in vivo acute toxicity of any herbal extracts

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El objetivo de este trabajo fue el de desarrollar films de Quitosano, Alginato y de Complejo Polielectrolito Quitosano – Alginato (CPEQA), evaluar sus propiedades físicas y mecánicas y seleccionar los films mas adecuados para su uso como apósitos en el tratamiento de quemaduras. Con este propósito, se preparan films de quitosano de camarón y de cangrejo, de alginato de diferentes pesos moleculares y CPEQA con los quitosanos de distintas fuentes y los alginatos de diferentes pesos moleculares. Se evaluó el efecto de la fuente de quitosano y del peso molecular del alginato en las propiedades de permeabilidad, mecánicas, bioadhesivas y biológicas de los films preparados. Las propiedades mecánicas y bioadhesivas se estudiaron en un analizador de texturas de acuerdo con la Norma Chilena Oficial NCh1151.Of76 y la ASTM D 5458-95 respectivamente. El grado de transmisión de vapor de agua (TVA) fue analizado con el método de la copa húmeda propuesto por la Norma Chilena Oficial NCh2098.Of2000. Las evaluaciones biológicas de irritación primaria dérmica e intracutánea se hicieron de acuerdo con las especificaciones de la ASTM F 719-81 y USP 24, respectivamente. Los films de quitosano de camarón mostraron menor resistencia mecánica, elasticidad y bioadhesión comparados con los de quitosano de cangrejo, pero tuvieron mayor permeabilidad y produjeron menor irritación. Debido a que los estudios biológicos con los films de quitosano de ambas fuentes mostraron baja y mediana irritación, fueron neutralizados con una solución de NaOH para obtener films con pH cercanos a 5,7, parecidos a los de la piel humana. Los films de quitosano tratados con NaOH mostraron mayor resistencia y menor elasticidad comparado a los films de quitosano no tratados. Los films de alginato también mostraron diferencias en sus propiedades: los de menor peso molecular fueron más elásticos que los de mayor peso molecular, pero mostraron menor resistencia y bioadhesión aunque la permeabilidad fue semejante, además de causar menor irritación dérmica e intracutánea. En comparación con los films de quitosano, tuvieron mayor resistencia y elasticidad, pero menor bioadhesión, permeabilidad y capacidad irritante. Los films de CPEQA mostraron propiedades mecánicas pobres y propiedades bioadhesivas y de irritación intermedias entre los films de quitosano y alginato. Los films de quitosano, alginato y de CPEQA presentaron propiedades fisicoquímicas y biológicas diferentes, sin embargo, todos presentaron una adecuada permeabilidad para ser utilizados como apósitos debido a que garantizan la mantención de un ambiente húmedo que promueve la curación de quemaduras

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Memoria para optar al Título de Químico Farmacéutico / Los estudios de bioequivalencia permiten demostrar si un principio activo tiene el mismo desempeño farmacocinético en el medicamento genérico como en el innovador o de referencia establecido por la autoridad sanitaria del país. La clorfenamina maleato, es el primer fármaco seleccionado por el Instituto de Salud Pública (ISP) para optar a bioexención en Chile, ya que por su alta solubilidad y baja permeabilidad clasifica en el grupo 3 del Sistema de Clasificación Biofarmacéutica (SCB), lo que le permite establecer bioequivalencia a través de ensayos in vitro en los medios de disolución determinados por la Organización Mundial de la Salud (OMS). En esta investigación se efectúo un estudio preliminar de bioequivalencia in vitro de clorfenamina maleato en comprimidos de 4 mg, de 4 laboratorios nacionales. Se realizaron los controles de calidad de las formas farmacéuticas sólidas, los cuales estuvieron dentro de los rangos aceptados por The United States Pharmacopeia 30 (USP30). Se validó la metodología a utilizar tanto en la valoración como en la cinética de disolución de los comprimidos a evaluar. La validación se realizó de acuerdo a los criterios estipulados en la USP 30. La valoración de los productos de los distintos laboratorios a analizar se realizó según lo señalado en la USP30, cuantificando los comprimidos a través de espectrofotometría UV a 265 nm. La validación de la metodología estuvo dentro de los límites aceptados, cumpliendo así con las exigencias que establece la USP30. Los perfiles de disolución fueron cuantificadas a través de la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Estos perfiles se compararon a través de un método estadístico modelo independiente, factor de diferencia (f1)y de similitud (f2), y a través de un programa estadístico ANOVA, los cuales revelaron que las curvas de disolución son distintas entre los productos del laboratorio de referencia y los laboratorios analizados, ya que f1 y f2 estuvieron fuera de los rangos establecidos en ambos medios estudiados. Sin embargo, para los efectos de demostrar bioequivalencia, estas diferencias no serían relevantes, ya que el proceso de disolución desde la forma farmacéutica es muy rápida, en un tiempo menor al necesario para que se produzca el vaciamiento gástrico, lo que no afectaría el proceso de absorción. Este es un estudio preliminar que sentó las bases y resolvió las dificultades para acometer en un futuro un estudio según lo establece la norma chilena, que estipula que el análisis debe hacerse sobre 3 lotes de fabricación del producto en estudio.