RIOS, Emiliano Ricardo Vasconcelos. Efeito antinociceptivo do acetato de citronelila : estudo dos possíveis mecanismos de ação. 2014. 115 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-07-17T16:12:34Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_ervrios.pdf: 1164250 bytes, checksum: 2756bc3785e62013839fa6a7e0ed57f0 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-07-17T16:14:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_ervrios.pdf: 1164250 bytes, checksum: 2756bc3785e62013839fa6a7e0ed57f0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-17T16:14:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_ervrios.pdf: 1164250 bytes, checksum: 2756bc3785e62013839fa6a7e0ed57f0 (MD5) Previous issue date: 2014 / This work shows for the first time the antinociceptive effect of the citronellyl acetate (CAT) and aimed to characterize the profile of effect and identify possible antinociceptive mechanisms of the cat, in models of acute nociception in mice. The CAT was testeed standardized animal models of pain using mice Swiss (24-32g). The CAT was administered at doses of 25, 50, 75, 100 or 200 mg/kg, by gavage. It was used in the tests of abdominal writhings by acetic acid; hot plate; formalin test; mechanic sensitivity; inflamatory hipernociception induced by carrageennan; Nociception test induced by capsaicin, cinnamaldeide, menthol, acid saline, PMA, 8-Br-cAMP, bradykinin or glutamate, as well as in behavioural models (open field and rota rod tests) that allowed to exclude the possibility of a muscle relaxant action or to induce false-positive result in the earlier models. The results showed that the CAT have antinociceptive effect in the visceral nociception model induced by acetic acid (in the 100 or 200 mg/kg doses, with ED50 of 74.42 mg/kg), this effect was verified after 30 minutes of aplication and continued until 240 minutes (200 mg/kg). Pretreatment with CAT showed antinociceptive effect in licking model induced by intraplantar formalin application and in the thermal nociception model (hot plate). CAT showed the decreasing of mechanical sencibility using the von Frey hair. In the antinociceptive mechanism investigation, CAT showed effect related with K+ATP channels, TRPV1, TRPM8, ASIC, glutamatergics receptors, bradykinin receptors, PKA and PKC. IN the investigation of neurotramitters pathways involved in antinociceptive effect of CAT, we can suggest the involvement of serotonergics system (5-HT1A, 5-HT2A/C receptors) and muscarinic, dopaminergic and α2-adrenergics receptors. With the results showed, we can conclude the CAT have antinociceptive effect in mice, and as possible mechanism the modulation of intracellular mediators PKC and/or PKA, relacted with moleculars mechanisms of K+ATP channels, TRPV1, TRPM8, ASIC, glutamatergics receptors, bradykinin receptors, serotonergics system (5-HT1, 5-HT2A/C receptors) and muscarinic, dopaminergic and α2-adrenergics receptors. / Esse trabalho, até onde se sabe, mostra pela primeira vez o efeito antinociceptivo do acetato de citronelila (CAT) e teve como objetivo caracterizar o perfil do efeito e identificar possíveis mecanismos antinociceptivos do CAT, em modelos de nocicepção aguda em camundongos. O CAT foi testado em modelos animais padronizados de dor utilizando camundongos Swiss (24-32g). O CAT foi administrado nas doses de 25, 50, 75, 100 ou 200 mg/kg, por via oral. Foram utilizados os testes de contorções abdominais induzidas por ácido acético; placa quente; teste da formalina; nocicepção mecânica, hipernocicepção inflamatória induzida pela carragenina; teste da nocicepção induzida por capsaicina, cinamaldeído, mentol, salina ácida, PMA, 8-Br-cAMP, bradicinina ou glutamato, bem como em modelos comportamentais (testes do campo aberto e rota Rod) que permitiram excluir a possibilidade de uma atividade relaxante muscular ou induzir resultados falso-positivos nos modelos anteriores. Os resultados mostraram que o CAT possui efeito antinociceptivo no modelo de nocicepção visceral induzida por ácido acético (nas doses de 100 ou 200 mg/kg, com DE50 de 74,42 mg/kg), esse efeito foi verificado após 30 minutos da aplicação e persistiu por até 240 minutos (200 mg/kg). O pré-tratamento com o CAT mostrou efeito antinociceptivo no modelo de lambedura induzida pela aplicação intraplantar de formalina e no modelo de nocicepção térmica (placa quente). O CAT mostrou diminuição da sensibilidade mecânica utilizando o filamento de von Frey. Na investigação do mecanismo antinociceptivo, o CAT mostrou efeito relacionado com os canais K+ATP, TRPV1, TRPM8, ASIC, receptores glutamatérgicos, receptores de bradicinina, PKA e PKC. Na investigação das vias de neurotransmissão envolvidas no efeito antinociceptivo do CAT, podemos sugerir o envolvimento dos receptores α2-adrenérgicos, sistema serotonérgico (receptores 5-HT1A, 5-HT2A/C), receptores muscarínicos e dopaminérgicos. Com os resultados mostrados, podemos concluir que o CAT possui efeito antinociceptivo em camundongos, e como possíveis mecanismos a modulação de mediadores intracelulares PKA e/ou PKC, relacionados com os mecanismos moleculares dos canais K+ATP, TRPV1, TRPM8, ASIC, receptores glutamatérgico, receptores de bradicinina, receptores α2-adrenérgico, sistema serotonérgico (receptores 5-HT1, 5-HT2A/C), receptores muscarínicos e dopaminérgicos.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade em Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-10-24T15:21:06Z No. of bitstreams: 1 2014_RubensSantosSamuelAlmeida.pdf: 2610665 bytes, checksum: 27c9282e87024c46e2e4d9b9fff37dbe (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2014-10-24T15:50:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_RubensSantosSamuelAlmeida.pdf: 2610665 bytes, checksum: 27c9282e87024c46e2e4d9b9fff37dbe (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-24T15:50:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_RubensSantosSamuelAlmeida.pdf: 2610665 bytes, checksum: 27c9282e87024c46e2e4d9b9fff37dbe (MD5) / Muitos fatores são caracterizados como desencadeadores do câncer como os fatores genéticos e a desregulação nos processos de sinalização celular. O acúmulo de mutações em células normais está nos fatores genéticos ligados a carcinogênese e a localização dessas mutações no genoma possui um papel fundamental. Até o momento, diversas mutações têm sido descritas em genes importantes relacionados à carcinogênese mamária. Desregulação nos processos de sinalização celular levam por vezes ao amento da proliferação celular característica fundamental para o desenvolvimento do câncer. Genes da família MYLK (Miosin Light Chain Kinase) codificam proteínas do tipo serina/treonina quinase inicialmente identificados como responsáveis pela fosforilação da cadeia leve da miosina. Estudos anteriores identificaram mutações no gene MYLK4 como de grande importância no câncer de mama. Estudos mostram que um aumento da expressão dos genes MYLK1 e MYLK2 estão relacionados com a carcinogênese mamária. Os membros desta família não foram totalmente caracterizados. Este estudo buscou investigar uma possível relação entre o MYLK4 e o câncer de mama. Foi constatado que a frequência de mutações no gene MYLK4 é baixa tanto em linhagens celulares quanto em amostras clínicas de câncer de mama. Ainda, observamos uma superexpressão do gene em linhagens celulares de câncer de mama e uma maior expressão em mama quando comparado com outros tipos de tecidos normais. A análise por imunohistoquímica em amostras clínicas parafinizadas demonstrou uma maior expressão do MYLK4 no tecido tumoral e presença em tecido normal. Analisando sua expressão em um número maior de amostras clínicas tumorais pareadas com sua contra parte normal ou não, não foram observadas alterações significativas na expressão do MYLK4 apenas uma grande variância em sua expressão. Ensaio de superexpressão do MYLK4 em linhagem celular normal demonstrou um aumento na proliferação celular in vitro. Os dados em conjunto apontam para um possível envolvimento do MYLK4 no crescimento celular em tumores que apresentem superexpressão deste gene. _________________________________________________________________________ ABSTRACT / Many factors are characterized as causes of cancer such as genetic factors and deregulation of cellular signaling processes. The accumulation of mutations in normal cells is linked to genetic factors in carcinogenesis and the location of these mutations in the genome plays a key role. To date, several mutations have been described in important genes related to mammary carcinogenesis. Disruption in cellular signaling process sometimes leads to increased cell proliferation, critical to the development of cancer. The MYLK (Light Chain Kinase Miosin) gene family encodes proteins of the serine / threonine kinase family originally identified as responsible for the phosphorylation of myosin light chain. Previous studies have identified mutations in the gene MYLK4 to be important in breast cancer. Studies have shown that increased expression of genes MYLK1 and MYLK2 are related to mammary carcinogenesis. Members of this family have not been fully characterized. This study sought to investigate a possible relationship between MYLK4 and breast cancer. It has been found that the frequency of mutations in the gene MYLK4 is low in both cell lines and clinical samples of breast cancer. Also, we observed a gene overexpression in cell lines of breast cancer and increased expression in normal cells of breast cancer when compared with other types of normal tissues. Analysis by immunohistochemistry in paraffin embedded clinical samples showed an increased expression of MYLK4 in tumor tissue and its presence in normal tissue. Analyzing its expression in a larger number of clinical tumor samples paired with its counterpart normal part or not, no significant changes were observed in the expression of MYLK4 just a great variance in their expression. Assay overexpressing MYLK4 normal cell line showed increase on cell proliferation in vitro. This data together suggest a possible involvement of MYLK4 in cell growth in tumors that exhibit overexpression of this gene.

A cistinose é uma doença genética letal causada pelo transporte deficiente de cistina para fora dos lisossomos, levando ao acúmulo intralisossomal de cistina na maioria dos tecidos, principalmente no rim. O tratamento precoce com cisteamina, um aminotiol capaz de remover a cistina acumulada nos lisossomos, retarda a evolução da doença. Embora o dano tecidual dependa do acúmulo do dissulfeto cistina, os mecanismos responsáveis por este dano ainda não estão esclarecidos. A sobrecarga de lisossomos com dimetil cistina éster tem sido usada para estudar a patogênese da cistinose. Túbulos renais proximais isolados de ratos e de coelhos, sobrecarregados com dimetil cistina éster desenvolveram deficiência na reabsorção tubular semelhante à observada na síndrome de Fanconi, a principal manifestação clínico-laboratorial da cistinose. Estudos realizados com fibroblastos de pacientes cistinóticos e com células tubulares renais sobrecarregadas com dimetil cistinal éster sugerem que a apoptose está aumentada nesta doença. O acúmulo de cistina também induz queda nos níveis intracelulares de glutationa e de ATP , mesmo com a capacidade mitocondrial geradora de ATP intacta. Considerando que a creatinaquinase é uma enzima tiólica crítica para a homeostasia energética renal e que pode ser alterada por dissulfetos, nós investigamos os efeitos in vivo e in vitro da cistina sobre a atividade desta quinase em rim de ratos Wistar jovens. Os resultados mostraram que a cistina inibiu a atividade da creatinaquinase in vivo e in vitro. A inibição foi do tipo não competitivo e dependente da concentração do inibidor e do tempo de pré-incubação, sendo prevenida e revertida por cisteamina e por glutationa, sugerindo a oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento da enzima. Com o objetivo de investigar se a inibição causada pela cistina era específica para a creatinaquinase renal ou poderia ocorrer também com outras enzimas tiólicas de outros tecidos, nós estudamos os efeitos da sobrecarga de dimetil cistina éster sobre as enzimas tiólicas creatinaquinase e piruvatoquinase, bem com sobre a enzima não tiólica lactato desidrogenase, em rim e córtex cerebral de ratos Wistar jovens. Os animais foram injetados subcutaneamente com dimetil cistina éster na dose de 1,6 μmol/g de peso corporal e/ou cisteamina na dose de 0,46 μmol/g de peso corporal do décimo sexto ao vigésimo dia de vida, tendo sido mortos por decapitação sem anestesia 12 horas após a última injeção. A administração de cistina dimetiléster diminuiu a relação tiol/dissulfeto sem alterar a atividade da lactato desidrogenase, mas inibiu a atividade das duas quinases, tanto no rim, quanto no córtex cerebral. A administração de cisteamina normalizou a relação tiol/dissulfeto e a atividade das duas quinases em ambos tecidos, reforçando a hipótese de que a cistina causa a inibição de enzimas tiólicas, provavelmente por meio da oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento destas enzimas. Considerando que a cistina é um potencial oxidante e o estresse oxidativo pode alterar a função das proteínas tiólicas e induzir apoptose, nós investigamos os efeitos da sobrecarga de cistina dimetiléster sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em rim de ratos Wistar jovens. A cistina dimetiléster induziu lipoperoxidação, carbonilação de proteínas, e estimulação da atividade da superóxido dismutase, glutationa peroxidase e catalase, provavelmente por meio da formação de ânions superoxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxilas. A administração de cisteamina preveniu, ao menos em parte, estes efeitos, sugerindo que este aminotiol aja como um “scavenger” de radicais livres. Considerando todos os resultados em conjunto, podemos presumir que a cistina induz estresse oxidativo, inibindo enzimas tiólicas com consequentes alterações metabólicas, tais como diminuição da homeostasia metabólica e redução dos níveis dos antioxidantes piruvato, creatina epossivelmente glutationa. Se estes efeitos também ocorrerem nos pacientes cistinóticos, eles poderiam contribuir para o dano celular que ocorre nesta doença. / Cystinosis is a lethal genetic disease caused by a lysosomal transport deficiency od cystine, leading to intra-lysosomal cystine accumulation in most tissues, specially in kidney. Early treatment with cysteamine, a cystine-depleting aminothiol, extends life of affected patients. Although tissue damage might depend on accumulation of the disulfide cystine, the mechanisms of tissue damage are not fully understood. Lysosomal loading with cystine dimethyl ester has been used for studying the pathogenesis of cystinosis. Isolated proximal renal tubules from rats and rabbits loaded with CDME developed defective proximal tubular reabsorption, similar to that of Fanconi syndrome in cystinosis Studies performed in fibroblasts of cystinotic patients and in kidney cells loaded with cystine dimethyl ester suggest that apoptosis is enhanced in this disease. Cystine accumulation also induces decrease of glutathione and of intracellular ATP content with intact energy generating capacity of mitochondria. Considering that creatine kinase, a thiol-containing enzyme, is critical for renal energy homeostasis and may be altered by disulfides, we investigated the in vivo and in vitro effects of cystine on this kinase in the kidney of young Wistar rats. Results showed that cystine inhibited in vivo and in vitro the enzyme activity and that this inhibition was of the non competitive type, time and concentration dependent, prevented and reversed by cysteamine and glutathione, suggesting that creatine kinase inhibition was caused by oxidation of essential sulfhydryl groups necessary for the enzyme function. Next, to investigate whether this inhibition was specific for renal creatine kinase, or might occur for other thiol-containing enzymes in other tissues, we studied the effects of cystine dimethylester load on the thiol-containing enzymes creatine kinase and pyruvate kinase, in the kidney and brain of young Wistar rats. We also studied these effects on lactate dehydrogenase, a non-containing thiol enzymae. The animals were injected twice a day with 1.6 μmol/g body weight cystine dimethylester and/or 0.46 μmol/g body weight cysteamine from the 16th to the 20th postpartum day and killed after 12 hours. Cystine dimethylester administration decreased thiol/disulfide ratio and inhibited the two enzyme activities in tissues, but not lactate dehydrogenase activity, a non-containing thiol enzyme. Co-administration of cysteamine normalized thiol/disulfide ratio and the two enzyme activities, reinforcing the hypothesis that cystine inhibits thiol containing enzymes possibly through oxidation of essential thiol groups of the enzymes. Considering that cystine is a potential oxidant and oxidative stress is known to alter the function of thiol containing proteins and induce apoptosis, we investigated the effects of cystine dimethyl ester loading on several parameters of oxidative stress in the kidney of young rats. Cystine dimethyl ester induced lipoperoxidation, protein carbonylation, and stimulated superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities, probably through the formation of superoxide anions, hydrogen peroxide, and hydroxyl radicals. Coadministration of cysteamine prevented, at least in part, those effects, possibly acting as a scavenger of free radicals. Taken together all the results, it can be presumed that cystine induces oxidative stress inhibiting thiol-containing enzymes with consequent metabolic alterations such as diminution of energy homeostasis and reduction levels of the antioxidants pyruvate, creatine, and possibly glutathione. If these effects also occur in cystinotic patients, they could contribute to tissue damage that occurs in this disease.

A cistinose é uma doença genética letal causada pelo transporte deficiente de cistina para fora dos lisossomos, levando ao acúmulo intralisossomal de cistina na maioria dos tecidos, principalmente no rim. O tratamento precoce com cisteamina, um aminotiol capaz de remover a cistina acumulada nos lisossomos, retarda a evolução da doença. Embora o dano tecidual dependa do acúmulo do dissulfeto cistina, os mecanismos responsáveis por este dano ainda não estão esclarecidos. A sobrecarga de lisossomos com dimetil cistina éster tem sido usada para estudar a patogênese da cistinose. Túbulos renais proximais isolados de ratos e de coelhos, sobrecarregados com dimetil cistina éster desenvolveram deficiência na reabsorção tubular semelhante à observada na síndrome de Fanconi, a principal manifestação clínico-laboratorial da cistinose. Estudos realizados com fibroblastos de pacientes cistinóticos e com células tubulares renais sobrecarregadas com dimetil cistinal éster sugerem que a apoptose está aumentada nesta doença. O acúmulo de cistina também induz queda nos níveis intracelulares de glutationa e de ATP , mesmo com a capacidade mitocondrial geradora de ATP intacta. Considerando que a creatinaquinase é uma enzima tiólica crítica para a homeostasia energética renal e que pode ser alterada por dissulfetos, nós investigamos os efeitos in vivo e in vitro da cistina sobre a atividade desta quinase em rim de ratos Wistar jovens. Os resultados mostraram que a cistina inibiu a atividade da creatinaquinase in vivo e in vitro. A inibição foi do tipo não competitivo e dependente da concentração do inibidor e do tempo de pré-incubação, sendo prevenida e revertida por cisteamina e por glutationa, sugerindo a oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento da enzima. Com o objetivo de investigar se a inibição causada pela cistina era específica para a creatinaquinase renal ou poderia ocorrer também com outras enzimas tiólicas de outros tecidos, nós estudamos os efeitos da sobrecarga de dimetil cistina éster sobre as enzimas tiólicas creatinaquinase e piruvatoquinase, bem com sobre a enzima não tiólica lactato desidrogenase, em rim e córtex cerebral de ratos Wistar jovens. Os animais foram injetados subcutaneamente com dimetil cistina éster na dose de 1,6 μmol/g de peso corporal e/ou cisteamina na dose de 0,46 μmol/g de peso corporal do décimo sexto ao vigésimo dia de vida, tendo sido mortos por decapitação sem anestesia 12 horas após a última injeção. A administração de cistina dimetiléster diminuiu a relação tiol/dissulfeto sem alterar a atividade da lactato desidrogenase, mas inibiu a atividade das duas quinases, tanto no rim, quanto no córtex cerebral. A administração de cisteamina normalizou a relação tiol/dissulfeto e a atividade das duas quinases em ambos tecidos, reforçando a hipótese de que a cistina causa a inibição de enzimas tiólicas, provavelmente por meio da oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento destas enzimas. Considerando que a cistina é um potencial oxidante e o estresse oxidativo pode alterar a função das proteínas tiólicas e induzir apoptose, nós investigamos os efeitos da sobrecarga de cistina dimetiléster sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em rim de ratos Wistar jovens. A cistina dimetiléster induziu lipoperoxidação, carbonilação de proteínas, e estimulação da atividade da superóxido dismutase, glutationa peroxidase e catalase, provavelmente por meio da formação de ânions superoxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxilas. A administração de cisteamina preveniu, ao menos em parte, estes efeitos, sugerindo que este aminotiol aja como um “scavenger” de radicais livres. Considerando todos os resultados em conjunto, podemos presumir que a cistina induz estresse oxidativo, inibindo enzimas tiólicas com consequentes alterações metabólicas, tais como diminuição da homeostasia metabólica e redução dos níveis dos antioxidantes piruvato, creatina epossivelmente glutationa. Se estes efeitos também ocorrerem nos pacientes cistinóticos, eles poderiam contribuir para o dano celular que ocorre nesta doença. / Cystinosis is a lethal genetic disease caused by a lysosomal transport deficiency od cystine, leading to intra-lysosomal cystine accumulation in most tissues, specially in kidney. Early treatment with cysteamine, a cystine-depleting aminothiol, extends life of affected patients. Although tissue damage might depend on accumulation of the disulfide cystine, the mechanisms of tissue damage are not fully understood. Lysosomal loading with cystine dimethyl ester has been used for studying the pathogenesis of cystinosis. Isolated proximal renal tubules from rats and rabbits loaded with CDME developed defective proximal tubular reabsorption, similar to that of Fanconi syndrome in cystinosis Studies performed in fibroblasts of cystinotic patients and in kidney cells loaded with cystine dimethyl ester suggest that apoptosis is enhanced in this disease. Cystine accumulation also induces decrease of glutathione and of intracellular ATP content with intact energy generating capacity of mitochondria. Considering that creatine kinase, a thiol-containing enzyme, is critical for renal energy homeostasis and may be altered by disulfides, we investigated the in vivo and in vitro effects of cystine on this kinase in the kidney of young Wistar rats. Results showed that cystine inhibited in vivo and in vitro the enzyme activity and that this inhibition was of the non competitive type, time and concentration dependent, prevented and reversed by cysteamine and glutathione, suggesting that creatine kinase inhibition was caused by oxidation of essential sulfhydryl groups necessary for the enzyme function. Next, to investigate whether this inhibition was specific for renal creatine kinase, or might occur for other thiol-containing enzymes in other tissues, we studied the effects of cystine dimethylester load on the thiol-containing enzymes creatine kinase and pyruvate kinase, in the kidney and brain of young Wistar rats. We also studied these effects on lactate dehydrogenase, a non-containing thiol enzymae. The animals were injected twice a day with 1.6 μmol/g body weight cystine dimethylester and/or 0.46 μmol/g body weight cysteamine from the 16th to the 20th postpartum day and killed after 12 hours. Cystine dimethylester administration decreased thiol/disulfide ratio and inhibited the two enzyme activities in tissues, but not lactate dehydrogenase activity, a non-containing thiol enzyme. Co-administration of cysteamine normalized thiol/disulfide ratio and the two enzyme activities, reinforcing the hypothesis that cystine inhibits thiol containing enzymes possibly through oxidation of essential thiol groups of the enzymes. Considering that cystine is a potential oxidant and oxidative stress is known to alter the function of thiol containing proteins and induce apoptosis, we investigated the effects of cystine dimethyl ester loading on several parameters of oxidative stress in the kidney of young rats. Cystine dimethyl ester induced lipoperoxidation, protein carbonylation, and stimulated superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities, probably through the formation of superoxide anions, hydrogen peroxide, and hydroxyl radicals. Coadministration of cysteamine prevented, at least in part, those effects, possibly acting as a scavenger of free radicals. Taken together all the results, it can be presumed that cystine induces oxidative stress inhibiting thiol-containing enzymes with consequent metabolic alterations such as diminution of energy homeostasis and reduction levels of the antioxidants pyruvate, creatine, and possibly glutathione. If these effects also occur in cystinotic patients, they could contribute to tissue damage that occurs in this disease.

A cistinose é uma doença genética letal causada pelo transporte deficiente de cistina para fora dos lisossomos, levando ao acúmulo intralisossomal de cistina na maioria dos tecidos, principalmente no rim. O tratamento precoce com cisteamina, um aminotiol capaz de remover a cistina acumulada nos lisossomos, retarda a evolução da doença. Embora o dano tecidual dependa do acúmulo do dissulfeto cistina, os mecanismos responsáveis por este dano ainda não estão esclarecidos. A sobrecarga de lisossomos com dimetil cistina éster tem sido usada para estudar a patogênese da cistinose. Túbulos renais proximais isolados de ratos e de coelhos, sobrecarregados com dimetil cistina éster desenvolveram deficiência na reabsorção tubular semelhante à observada na síndrome de Fanconi, a principal manifestação clínico-laboratorial da cistinose. Estudos realizados com fibroblastos de pacientes cistinóticos e com células tubulares renais sobrecarregadas com dimetil cistinal éster sugerem que a apoptose está aumentada nesta doença. O acúmulo de cistina também induz queda nos níveis intracelulares de glutationa e de ATP , mesmo com a capacidade mitocondrial geradora de ATP intacta. Considerando que a creatinaquinase é uma enzima tiólica crítica para a homeostasia energética renal e que pode ser alterada por dissulfetos, nós investigamos os efeitos in vivo e in vitro da cistina sobre a atividade desta quinase em rim de ratos Wistar jovens. Os resultados mostraram que a cistina inibiu a atividade da creatinaquinase in vivo e in vitro. A inibição foi do tipo não competitivo e dependente da concentração do inibidor e do tempo de pré-incubação, sendo prevenida e revertida por cisteamina e por glutationa, sugerindo a oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento da enzima. Com o objetivo de investigar se a inibição causada pela cistina era específica para a creatinaquinase renal ou poderia ocorrer também com outras enzimas tiólicas de outros tecidos, nós estudamos os efeitos da sobrecarga de dimetil cistina éster sobre as enzimas tiólicas creatinaquinase e piruvatoquinase, bem com sobre a enzima não tiólica lactato desidrogenase, em rim e córtex cerebral de ratos Wistar jovens. Os animais foram injetados subcutaneamente com dimetil cistina éster na dose de 1,6 μmol/g de peso corporal e/ou cisteamina na dose de 0,46 μmol/g de peso corporal do décimo sexto ao vigésimo dia de vida, tendo sido mortos por decapitação sem anestesia 12 horas após a última injeção. A administração de cistina dimetiléster diminuiu a relação tiol/dissulfeto sem alterar a atividade da lactato desidrogenase, mas inibiu a atividade das duas quinases, tanto no rim, quanto no córtex cerebral. A administração de cisteamina normalizou a relação tiol/dissulfeto e a atividade das duas quinases em ambos tecidos, reforçando a hipótese de que a cistina causa a inibição de enzimas tiólicas, provavelmente por meio da oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento destas enzimas. Considerando que a cistina é um potencial oxidante e o estresse oxidativo pode alterar a função das proteínas tiólicas e induzir apoptose, nós investigamos os efeitos da sobrecarga de cistina dimetiléster sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em rim de ratos Wistar jovens. A cistina dimetiléster induziu lipoperoxidação, carbonilação de proteínas, e estimulação da atividade da superóxido dismutase, glutationa peroxidase e catalase, provavelmente por meio da formação de ânions superoxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxilas. A administração de cisteamina preveniu, ao menos em parte, estes efeitos, sugerindo que este aminotiol aja como um “scavenger” de radicais livres. Considerando todos os resultados em conjunto, podemos presumir que a cistina induz estresse oxidativo, inibindo enzimas tiólicas com consequentes alterações metabólicas, tais como diminuição da homeostasia metabólica e redução dos níveis dos antioxidantes piruvato, creatina epossivelmente glutationa. Se estes efeitos também ocorrerem nos pacientes cistinóticos, eles poderiam contribuir para o dano celular que ocorre nesta doença. / Cystinosis is a lethal genetic disease caused by a lysosomal transport deficiency od cystine, leading to intra-lysosomal cystine accumulation in most tissues, specially in kidney. Early treatment with cysteamine, a cystine-depleting aminothiol, extends life of affected patients. Although tissue damage might depend on accumulation of the disulfide cystine, the mechanisms of tissue damage are not fully understood. Lysosomal loading with cystine dimethyl ester has been used for studying the pathogenesis of cystinosis. Isolated proximal renal tubules from rats and rabbits loaded with CDME developed defective proximal tubular reabsorption, similar to that of Fanconi syndrome in cystinosis Studies performed in fibroblasts of cystinotic patients and in kidney cells loaded with cystine dimethyl ester suggest that apoptosis is enhanced in this disease. Cystine accumulation also induces decrease of glutathione and of intracellular ATP content with intact energy generating capacity of mitochondria. Considering that creatine kinase, a thiol-containing enzyme, is critical for renal energy homeostasis and may be altered by disulfides, we investigated the in vivo and in vitro effects of cystine on this kinase in the kidney of young Wistar rats. Results showed that cystine inhibited in vivo and in vitro the enzyme activity and that this inhibition was of the non competitive type, time and concentration dependent, prevented and reversed by cysteamine and glutathione, suggesting that creatine kinase inhibition was caused by oxidation of essential sulfhydryl groups necessary for the enzyme function. Next, to investigate whether this inhibition was specific for renal creatine kinase, or might occur for other thiol-containing enzymes in other tissues, we studied the effects of cystine dimethylester load on the thiol-containing enzymes creatine kinase and pyruvate kinase, in the kidney and brain of young Wistar rats. We also studied these effects on lactate dehydrogenase, a non-containing thiol enzymae. The animals were injected twice a day with 1.6 μmol/g body weight cystine dimethylester and/or 0.46 μmol/g body weight cysteamine from the 16th to the 20th postpartum day and killed after 12 hours. Cystine dimethylester administration decreased thiol/disulfide ratio and inhibited the two enzyme activities in tissues, but not lactate dehydrogenase activity, a non-containing thiol enzyme. Co-administration of cysteamine normalized thiol/disulfide ratio and the two enzyme activities, reinforcing the hypothesis that cystine inhibits thiol containing enzymes possibly through oxidation of essential thiol groups of the enzymes. Considering that cystine is a potential oxidant and oxidative stress is known to alter the function of thiol containing proteins and induce apoptosis, we investigated the effects of cystine dimethyl ester loading on several parameters of oxidative stress in the kidney of young rats. Cystine dimethyl ester induced lipoperoxidation, protein carbonylation, and stimulated superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities, probably through the formation of superoxide anions, hydrogen peroxide, and hydroxyl radicals. Coadministration of cysteamine prevented, at least in part, those effects, possibly acting as a scavenger of free radicals. Taken together all the results, it can be presumed that cystine induces oxidative stress inhibiting thiol-containing enzymes with consequent metabolic alterations such as diminution of energy homeostasis and reduction levels of the antioxidants pyruvate, creatine, and possibly glutathione. If these effects also occur in cystinotic patients, they could contribute to tissue damage that occurs in this disease.

A Doença do Xarope do Bordo é uma alteração metabólica hereditária caracterizada bioquimicamente pelo acumulo dos aminoácidos de cadeia ramificada e seus respectivos aminoácidos no sangue e nos tecidos destes pacientes. Os mecanismos patogênicos das alterações neurológicas presentes nos pacientes ainda são pouco conhecidos. Há evidências de que o metabolismo energético esteja alterado no cérebro dos pacientes. A creatinaquinase, enzima chave no metabolismo energético, está envolvida transporte e manutenção da energia cerebral. Neste trabalho investigamos a inibição da creatinaquinase pelos aminoácidos de cadeia ramificada in vitro em cérebro de ratos em desenvolvimento, nas concentrações semelhantes as encontradas no plasma destes pacientes. O mesmo efeito não foi verificado com os cetoácidos de cadeia ramificada. Verificamos ainda que este efeito também ocorreu em ratos tratados com leucina de forma crônica do 60 ao 210 dia, e de forma aguda quando tratados por 12 horas com intervalos de três horas. Os parâmetros cinéticos estudados mostraram um Km baixo (0,8 – 1,4 mM) para a fosfocreatina como substrato, cuja variação no cérebro oscila entre 4 a 8 mM. Assim nas condições fisiopatológicas a enzima estaria saturada em ralação à fosfocreatina, sendo difícil a competição com os aminoácidos de cadeia ramificada, principalmente devido ao alto Ki encontrado (6 a 26 mM), exceto em situações de baixas concentrações deste substrato. Entretanto, o Km encontrado para o ADP como substrato (0,3 ± 0,1 mM) é semelhante à concentração do ADP do cérebro (0,2 – 0.4 mM). Como o Ki encontrado também é alto (14 – 30 mM), é possível que a competição entre o ADP como substrato e os aminoácidos de cadeia ramificada diminua a atividade da enzima alterando a homeostasia energética do cérebro, contribuindo para o dano neurológico encontrado nos pacientes com a Doença do Xarope de Bordo. Os dados deste trabalho propõem um novo mecanismo fisiopatológico para as alterações neurológicas encontradas na Doença do Xarope do Bordo. Os aminoácidos de cadeia ramificada, acumulados no cérebro destes pacientes, ocasionando a inibição da creatinaquinase estariam competindo com o ADP, produzindo deste modo um desequilíbrio energético e conseqüentemente o dano neurológico.

A Doença do Xarope do Bordo é uma alteração metabólica hereditária caracterizada bioquimicamente pelo acumulo dos aminoácidos de cadeia ramificada e seus respectivos aminoácidos no sangue e nos tecidos destes pacientes. Os mecanismos patogênicos das alterações neurológicas presentes nos pacientes ainda são pouco conhecidos. Há evidências de que o metabolismo energético esteja alterado no cérebro dos pacientes. A creatinaquinase, enzima chave no metabolismo energético, está envolvida transporte e manutenção da energia cerebral. Neste trabalho investigamos a inibição da creatinaquinase pelos aminoácidos de cadeia ramificada in vitro em cérebro de ratos em desenvolvimento, nas concentrações semelhantes as encontradas no plasma destes pacientes. O mesmo efeito não foi verificado com os cetoácidos de cadeia ramificada. Verificamos ainda que este efeito também ocorreu em ratos tratados com leucina de forma crônica do 60 ao 210 dia, e de forma aguda quando tratados por 12 horas com intervalos de três horas. Os parâmetros cinéticos estudados mostraram um Km baixo (0,8 – 1,4 mM) para a fosfocreatina como substrato, cuja variação no cérebro oscila entre 4 a 8 mM. Assim nas condições fisiopatológicas a enzima estaria saturada em ralação à fosfocreatina, sendo difícil a competição com os aminoácidos de cadeia ramificada, principalmente devido ao alto Ki encontrado (6 a 26 mM), exceto em situações de baixas concentrações deste substrato. Entretanto, o Km encontrado para o ADP como substrato (0,3 ± 0,1 mM) é semelhante à concentração do ADP do cérebro (0,2 – 0.4 mM). Como o Ki encontrado também é alto (14 – 30 mM), é possível que a competição entre o ADP como substrato e os aminoácidos de cadeia ramificada diminua a atividade da enzima alterando a homeostasia energética do cérebro, contribuindo para o dano neurológico encontrado nos pacientes com a Doença do Xarope de Bordo. Os dados deste trabalho propõem um novo mecanismo fisiopatológico para as alterações neurológicas encontradas na Doença do Xarope do Bordo. Os aminoácidos de cadeia ramificada, acumulados no cérebro destes pacientes, ocasionando a inibição da creatinaquinase estariam competindo com o ADP, produzindo deste modo um desequilíbrio energético e conseqüentemente o dano neurológico.

A Doença do Xarope do Bordo é uma alteração metabólica hereditária caracterizada bioquimicamente pelo acumulo dos aminoácidos de cadeia ramificada e seus respectivos aminoácidos no sangue e nos tecidos destes pacientes. Os mecanismos patogênicos das alterações neurológicas presentes nos pacientes ainda são pouco conhecidos. Há evidências de que o metabolismo energético esteja alterado no cérebro dos pacientes. A creatinaquinase, enzima chave no metabolismo energético, está envolvida transporte e manutenção da energia cerebral. Neste trabalho investigamos a inibição da creatinaquinase pelos aminoácidos de cadeia ramificada in vitro em cérebro de ratos em desenvolvimento, nas concentrações semelhantes as encontradas no plasma destes pacientes. O mesmo efeito não foi verificado com os cetoácidos de cadeia ramificada. Verificamos ainda que este efeito também ocorreu em ratos tratados com leucina de forma crônica do 60 ao 210 dia, e de forma aguda quando tratados por 12 horas com intervalos de três horas. Os parâmetros cinéticos estudados mostraram um Km baixo (0,8 – 1,4 mM) para a fosfocreatina como substrato, cuja variação no cérebro oscila entre 4 a 8 mM. Assim nas condições fisiopatológicas a enzima estaria saturada em ralação à fosfocreatina, sendo difícil a competição com os aminoácidos de cadeia ramificada, principalmente devido ao alto Ki encontrado (6 a 26 mM), exceto em situações de baixas concentrações deste substrato. Entretanto, o Km encontrado para o ADP como substrato (0,3 ± 0,1 mM) é semelhante à concentração do ADP do cérebro (0,2 – 0.4 mM). Como o Ki encontrado também é alto (14 – 30 mM), é possível que a competição entre o ADP como substrato e os aminoácidos de cadeia ramificada diminua a atividade da enzima alterando a homeostasia energética do cérebro, contribuindo para o dano neurológico encontrado nos pacientes com a Doença do Xarope de Bordo. Os dados deste trabalho propõem um novo mecanismo fisiopatológico para as alterações neurológicas encontradas na Doença do Xarope do Bordo. Os aminoácidos de cadeia ramificada, acumulados no cérebro destes pacientes, ocasionando a inibição da creatinaquinase estariam competindo com o ADP, produzindo deste modo um desequilíbrio energético e conseqüentemente o dano neurológico.

Orientador: André Sampaio Pupo / Banca: Fernando Maurício Francis Abdalla / Banca: Carlos Allan Cândido Dias Júnior / Banca: Maria de Fátima Magalhães Lázari / Banca: Flávia Heberler-Barbosa Trovão / Resumo: As catecolaminas endógenas adrenalina e noradrenalina controlam importantes funções fisiológicas através da ativação de 1A-ARs, que são receptores com 7 domínios transmembrana os quais ativam proteínas G. Muitos agonistas de 1-ARs são utilizados na terapêutica, principalmente por conta de seu efeito vasoconstritor, porém, a taquifilaxia observada com a oximetazolina, um agonista de 1-ARs da classe das imidazolinas, é um efeito adverso importante e pode ser observado principalmente com a utilização de descongestionantes nasais por períodos de tempo prolongado. No presente estudo, investigamos a participação de PKC e GRK2 nos processos de fosforilação, dessensibilização e internalização de 1A-ARs induzidos pelos agonistas noradrenalina e oximetazolina. Segundo os resultados obtidos, a oximetazolina, mas não a fenilefrina, induziu taquifilaxia nas contrações de artéria caudal de rato. Além disso, 1A-ARs ativados pela oximetazolina são fosforilados principalmente pela GRK2, seguida de rápida dessensibilização e internalização. Já 1A-ARs ativados pela noradrenalina são fosforilados principalmente pela PKC, sem dessensibilização nem rápida internalização. Esses resultados em conjunto demonstram que a oximetazolina e a noradrenalina regulam os 1A-ARs através de diferentes mecanismos, envolvendo diferentes quinases / Abstract: The endogenous cathecolamines epinephrine and norepinephrine control important physiological functions through activation of 1A-ARs, which are 7-transmembrane receptors that activate G proteins. Several 1-ARs agonists are therapeutically useful in reason of its vasoconstrictor effects; however, tachyphylaxis in the vasoconstrictor effects of nasal decongestant containing oxymetazoline, an imidazoline 1-ARs agonist, is an important adverse effect observed after prolonged treatment. On the present study, we investigated the roles of PKC and GRK2 on the 1A-AR phosphorylation, desensitization and internalization process after receptor activation by norepinephrine and oxymetazoline. The results show that oxymetazoline, but not phenylephrine, induce tachyphylaxis in contractions of rat tail artery. Moreover, 1A-ARs activated by oxymetazoline are phosphorylated predominantly by GRK2, followed by rapid desensitization and internalization whereas 1A-ARs activated by norepinephrine are phosphorylated predominantly by PKC and not followed by desensitization or rapid internalization. These results show that norepinephrine and oxymetazoline regulate 1A-ARs through different mechanisms, involving different protein kinases / Doutor

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-12-17Bitstream added on 2014-08-13T18:00:59Z : No. of bitstreams: 1 000749422.pdf: 1687301 bytes, checksum: 450c708667024b1b39f860f1fdc18bc0 (MD5) / Contextualização: Diante da necessidade de obtenção de níveis ótimos de recuperação, utiliza-se em campo diversas estratégias. Dentre elas, usa-se com frequência a imersão em água fria (IAF). Entretanto, notam-se, ainda, lacunas no conhecimento para definir os reais efeitos destas modalidades de recuperação em condições específicas. Objetivo: analisar e comparar os efeitos da IAF durante a recuperação pós-exercício extenuante, utilizando diferentes tempos e temperaturas, sobre variáveis biológicas, clínicas e metabólicas. Materiais e Métodos: 105 indivíduos do sexo masculino com idade entre 18 e 30 anos foram divididos em cinco grupos: um de controle (GC) e quatro de recuperações (G1, G2, G3 e G4). Os voluntários foram submetidos a um protocolo de exaustão que consistiu em um programa de saltos (10 séries de 10 saltos com um minuto de intervalo entre as séries) e ao teste de Wingate. Imediatamente após o protocolo de exaustão, os voluntários foram direcionados a um tanque com água e gelo, no qual foram imersos até a altura da espinha ilíaca ântero-superior para o procedimento de recuperação (G1: 5’ a 9±1°C; G2: 5’ a 14±1ºC; G3: 15’ a 9±1°C; G4: 15’ a 14±1°C)... / Background: Given the need to obtain optimal levels of recovery uses various strategies in the field. Among them, it is used frequently cold water immersion (CWI). However, notice is also gaps in knowledge to define the real effects of these modalities recovery under specific conditions. Objective: To analyze and compare the effects of CWI during recovery after strenuous exercise, using different time and temperature on biological variables, clinical and metabolic. Materials and Methods: 105 male individuals between 18 and 30 years were divided into five groups: a control (GC) and four recoveries (G1, G2, G3 and G4). The volunteers were subjected to exhaustion protocol which consisted of a jumping program (10 sets of 10 jumps with a minute of rest between sets) and the Wingate test. Immediately after the exhaustion protocol, volunteers were directed to a tank with water and ice, which were immersed up to the height of the anterior superior iliac spine to the recovery procedure (G1: 5 ' 9 ± 1 ° C; G2: 5 ' to 14 ± 1 º C; G3: 15' to 9 ± 1 ° C; G4: 15 ' to 14 ± 1 ° C)...