Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / O hábito de fumar induz diversas alterações ao sistema cardíaco e isso pode estar relacionado, pelo menos em parte, à excessiva formação de espécies reativas de oxigênio. Evidência recente demonstra que o acúmulo de espécies reativas está envolvido em vários processos importantes, um deles é a autofagia. Uma das moléculas envolvidas na regulação da autofagia é a AMPK. A AMPK estimula a ULK e consequentemente outras proteínas relacionadas a autofagia. No entanto, o conhecimento sobre esse processo carece de maiores investigações. Diante disso, o presente estudo avaliou o envolvimento das espécies reativas de oxigênio no processo autofágico no músculo cardíaco de camundongos expostos à fumaça de cigarro. Foram utilizados camundongos Swiss expostos à 4 cigarros comerciais com filtro por sessão, 3 sessões/dia, todos os dias da semana por 7, 15, 30 e 45 dias (n=10) e o grupo controle. Os animais sofreram eutanásia, o tecido cardíaco foi removido e realizado análises moleculares e bioquímicas. Nos grupos expostos à fumaça de cigarro por 30 e 45 dias, observou-se maiores alterações no processo autofágico no tecido cardíaco; o tempo de 30 dias de exposição foi utilizado para os experimentos posteriores (suplementação com N-acetilcisteína e cessação da fumaça de cigarro por 30 dias). Após protocolo de exposição, suplementação e cessação da fumaça de cigarro por 30 dias os animais sofreram eutanásia, o tecido cardíaco foi removido e realizado análises bioquímicas e moleculares. Os resultados demonstraram que a exposição à fumaça de cigarro por diferentes dias aumentou a produção de espécies reativas de oxigênio, fosforilação de AMPK e ULKser317, níveis proteicos de sestrina 2, Atg5 e LC3 II e diminuiu a fosforilação de mTOR. Após o uso de antioxidante e a cessação da fumaça de cigarro por 30 dias, a produção de espécies reativas de oxigênio foi significamente menor nos grupos suplementados e cessados por 30 dias em relação aos animais expostos por 30 dias. Em adição, a fosforilação de AMPK e ULKser317 e os níveis proteicos de sestrina 2, Atg5 e LC3 II foram menores nesses grupos. Além disso, a fosforilação de mTOR foi aumentada nos grupos suplementados com n-acetilcisteína e no grupo com cessação da fumaça. Os resultados demonstraram que a exposição da fumaça de cigarro aumenta a autofagia mediada pelas espécies reativas de oxigênio no tecido cardíaco de camundongos Swiss.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / A esquizofrenia é um transtorno psiquiátrico crônico e incapacitante que afeta aproximadamente 1% da população mundial. Pesquisas com tratamentos preventivos se tornam necessárias, incluindo o uso de nutrientes, como o ácido fólico cujo metabolismo está implicado no desenvolvimento do transtorno. No presente estudo foi avaliado o efeito do ácido fólico sobre os parâmetros de metabolismo energético em ratos submetidos ao modelo de esquizofrenia induzido pela administração de cetamina. Ratos Wistar adultos foram suplementados durante 14 dias com ácido fólico (5, 10 ou 50mg/kg) ou água via oral e a partir do 9º dia de experimento foi administrada cetamina (25mg/kg) ou salina via intraperitoneal durante 7 dias. No 15º dia do experimento, os animais foram mortos por decapitação e as estruturas cerebrais, córtex frontal, hipocampo e estriado, dissecadas para as análises bioquímicas. Foi avaliada a atividade dos complexos I, II, II-III e IV da cadeia respiratória mitocondrial e da enzima creatina quinase. Nossos achados, de modo geral, indicaram que a administração repetida de cetamina não foi capaz de alterar os parâmetros analisados. No complexo I, o ácido fólico (10mg/kg) associado à cetamina reduziu a atividade deste complexo em relação ao grupo controle no córtex frontal, hipocampo e estriado. Além disso, o ácido fólico (10mg/kg) per se diminuiu a atividade do complexo I no hipocampo e no estriado quando comparado ao grupo controle. O ácido fólico (50mg/kg) associado à cetamina aumentou a atividade do complexo I em relação ao grupo controle no estriado. No complexo II, o ácido fólico (5mg/kg) em associação com a cetamina elevou a atividade deste complexo apenas no córtex frontal. Ainda houve um aumento na atividade do complexo II-III no hipocampo pelo ácido fólico (5mg/kg) associado à cetamina em relação ao grupo controle. Observou-se no complexo IV, apenas no estriado, um efeito do ácido fólico (5mg/kg) per se aumentando a atividade deste complexo comparado ao grupo controle. A administração de ácido fólico (10mg/kg e 50mg/kg) per se aumentou significativamente a atividade da creatina quinase no córtex frontal. Sabe-se o importante papel que o ácido fólico desempenha na fisiopatologia da esquizofrenia, porém o mecanismo exato pelo qual esta relação ocorre permanece desconhecido. Dessa forma, estudos adicionais baseados em modelos animais de esquizofrenia devem ser realizados, visando uma maior compreensão das propriedades terapêuticas e profiláticas do ácido fólico, bem como a dose mais adequada e o melhor tempo de tratamento neste transtorno.

Orientador: Rosângela Gonçalves Peccinini / Coorientador: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Anselmo Gomes de Oliveira / Banca: Thalita Pedroni Formariz Pilon / Resumo: A doxorrubicina (DOX) é o antineoplásico mais utilizado na terapêutica no tratamento de tumores sólidos e leucemias, porém sua cardiotoxicidade limita, muitas vezes, a continuidade do tratamento. Neste contexto, Formariz (2008) desenvolveu uma microemulsão (ME) contendo DOX (DOX-ME) que apresentou cardiotoxicidade reduzida - avaliada através da atividade da enzima MB da creatinina quinase (CKMB) - em relação ao produto comercial (pó liofilizado na forma de cloridrato). A DOX incorporada nessa nova ME apresentou aumento da DL50 em ratos Wistar e camundongos com manutenção da DE50, com consequente aumento da sua margem de segurança. Em estudos de farmacocinética pré-clínica foi observado que a DOX incorporada a esta microemulsão lipídica teve seus parâmetros farmacocinéticos modificados, apresentando menor volume de distribuição e diminuição da cardiotoxicidade, fato que sugere menor captação do fármaco pelo miocárdio. Neste estudo investigou-se a distribuição da DOX em tecido cardíaco e tumoral em camundongos Swiss fêmeas, nas quais foi inoculado e desenvolvido o tumor de Ehrlich. Esses animais foram distribuidos em dois grupos (n=7 cada) que receberam, por via intraperitoneal e em dose única (10 mg/kg), a DOX veiculada por microemulsão (DOX-ME) ou na forma de cloridrato (DOX-Cl). Quinze minutos após a administração os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e a massa tumoral total e o coração foram coletados. Após a coleta as amostras foram processadas e analisadas em um sistema UPLC Waters® com detecção por fluorescência (ƛ exc = 480 nm; ƛ em= 560 nm), utilizando coluna Acquity CSH C18 1,7 μm (2,1 x 100 mm), protegida por coluna de guarda Vanguard C18 1,7 μm (2,1 x 50 mm). A fase móvel foi constituída de acetonitrila : ácido fórmico 0,1% (40:60), em modo isocrático, em fluxo de 0,4 mL/min. O volume de injeção foi de 10 μL de amostra no sistema cromatográfico. O método ... / Abstract: Doxorubicin (DOX) is the most used antineoplastic in the therapy for the treatment of solid tumors and leukemias but its cardiotoxicity often limits the continuity of the treatment. In this context, Formariz (2008) developed a microemulsion (ME) containing DOX (DOX-ME) that showed reduced cardiotoxicity - assessed by the activity of the enzyme creatine kinase MB (CK-MB) - in relation to the commercial product (in the form of hydrochloride lyophilized powder). The DOX incorporated into the new ME showed an increase of LD50 in rats and mice with the maintaining of the ED50, consequently increasing its safety margin. In preclinical pharmacokinetic studies was observed that the DOX lipid microemulsion had its pharmacokinetic parameters modified, with smaller volume of distribution and reduced cardiotoxicity, which suggests less drug uptake by the myocardium. In this study was investigated the distribution of DOX in cardiac tissue and tumor in female Swiss mice, which were inoculated and developed Ehrlich tumor. These animals were divided in two groups (n = 7) that received intraperitoneal dose (10 mg / kg) of DOX microemulsion (ME DOX) or hydrochloride (DOX-Cl) . Fifteen minutes after the administration, the animals were sacrificed by cervical dislocation and the total tumor mass and heart were collected. After collecting, the samples were processed and analyzed on a Waters ® UPLC System with fluorescence detection (ƛ exc = 480 nm; ƛ em = 560 nm) using column Acquity CSH C18 1.7 micrometre (2.1 x 100 mm) protected by guard column C18 Vanguard 1.7 micrometre (2.1 x 50 mm). The mobile phase consisted of acetonitrile: 0.1% formic acid (40:60) in isocratic flow at 0.4 ml / min. The injection volume was 10 uL of sample into the chromatographic system. The bioanalytical method was validated in accordance with resolutions of ANVISA and the guidance of the FDA, and demonstrated confidence limits appropriate for their application in the ... / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-01-30Bitstream added on 2014-06-13T18:09:18Z : No. of bitstreams: 1 avaca_js_me_araiq.pdf: 1586941 bytes, checksum: 07a6c5702a63cebb17218e18a8aa2449 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Neste trabalho foi realizado o isolamento do cDNA e do gene que codifica a proteína semelhante à Pho85p de Saccharomyces cerevisiae, em Neurospora crassa. Um fragmento de 1,1 kb correspondendo à seqüência nucleotídica do gene em N. crassa foi amplificado e confirmado por sequenciamento, o qual foi utilizado no rastreamento de uma biblioteca de cDNA de N. crassa, resultando em um plasmídeo contendo a ORF que codifica a Ncpho85 e as seqüências upstream e downstream à ORF. Este inserto foi seqüenciado, a ORF isolada apresentou 1014 bp, a região upstream contém 304 bp e a downstream 561 nucleotídeos. Após sequenciamento do cDNA, a seqüência polipeptídica da proteína foi comparada com outras proteínas semelhantes à Pho85p de fungos miceliares, leveduriformes além de S. cerevisiae. Esta ORF isolada foi utilizada no rastreamento de uma biblioteca genômica de N. crassa, possibilitando o isolamento de um plasmídeo contendo a seqüência genômica, o qual foi submetido a sequenciamento. No inserto foi possível confirmar a presença do intron (de 89 bp) no nucleotídeo 69, confirmando os dados existentes no banco de dados de N. crassa. A expressão do gene foi analisada ao longo do crescimento do fungo, em diferentes meios de cultivo, através de experimentos de Northern blot. A presença de duas bandas de hibridização, uma de 2,2 kb e uma 2,7 kb foi observada em todos os experimentos realizados. Um pico de expressão dos dois transcritos ocorreu no tempo de 12 horas, sendo mais evidente para o transcrito de menor tamanho, o qual seria o transcrito do cDNA isolado anteriormente. Resultados preliminares da expressão da proteína ao longo do crescimento do fungo foram obtidos por Western blot. Apenas uma banda da proteína foi observada, a qual apresentou o tamanho aproximado de 40 kDa, próximo ao tamanho da proteína NcPHO85, deduzida a partir da seqüência do cDNA. / In this study we performed the isolation of the cDNA and the gene that codes for the Pho85p-like protein from Saccharomyces cerevisiae in Neurospora crassa. A fragment of 1.1 kb corresponding to the nucleotide sequence of the gene from N. crassa was amplified by PCR and confirmed by DNA sequencing. This fragment was used to screen a N. crassa cDNA library resulting in a plasmid containing the ORF plus and the upstream and downstream regions. The insert from the plasmid was sequenced and the ORF showed to have 1014 bp, whereas the upstream and downstream regions had 304 bp and 561 bp, respectively. After sequencing the cDNA, the polypeptide sequence was compared to the same protein from mycelial fungi and yeasts. The isolated ORF was used to screen a N. crassa genomic library leading to the isolation of a plasmid containing the genomic sequence. After DNA sequencing the insert showed the presence of an intron (89 bp) starting at nucleotide 69. This result was in agreement with the information from the N. crassa database. Gene expression analysis during the vegetative growth in different media was performed by Northern blot. Two hybridization bands were observed in the experiments, one of 2.2 kb and another one of 2.7 kb. The maximum expression of both transcripts happened at 12 h of growth, this was more pronounced for the smaller transcript, which probably is the transcript of the isolated cDNA. Preliminary results of protein expression during vegetative growth were obtained by Western blot analysis. Only one band with approximately 40 kDa was observed, the expected size for the NcPHO85 protein sequence deduced from the cDNA sequence. In order to evaluate the role of this protein in glycogen metabolism and in other cellular functions in N. crassa we started the gene inactivation.

INTRODUÇAO: O câncer de cólon é a terceira neoplasia mais prevalente no país, com aumento progressivo da incidência associada ao envelhecimento populacional. Os avanços nos tratamentos local e sistêmico do câncer de cólon metastático tem aumentado significativamente o tempo de sobrevida global. Entretanto, ainda não existem biomarcadores consolidados na literatura, capazes de predizer resposta a estes tratamentos ou o prognóstico. No processo da carcinogênese, uma das importantes vias que se encontra alterada é a via de reparo do DNA. A Chk2 é uma proteína quinase com atividade no reparo celular atuando de forma supressora no processo da carcinogênese, sendo que alterações em sua expressão e/ou função têm sido associadas à progressão tumoral em outras neoplasias como no câncer de mama, pulmão, vulva, bexiga, cólon, ovário, osteossarcoma e linfomas. OBJETIVO: Avaliar a expressão imunohistoquímica do Chk2 no câncer de cólon metastático e correlacionar sua expressão com características clínico-patológicas e sobrevida. PACIENTES E MÉTODOS: Foram incluídos 58 pacientes com diagnóstico confirmado de câncer de cólon metastático, tratados em primeira linha com quimioterapia baseada em fluorouracila e oxaliplatina. O tempo mínimo de seguimento foram de 2 anos pós-diagnóstico. Para análise da expressão do Chk2 foram utilizadas as técnicas de tissue microarray e imunohistoquímica. Estes resultados foram correlacionados com características clínicas, patológicas e de sobrevida. Para análise estatística, foi utilizado o programa SPSS17 e o valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. RESULTADOS: A expressão de Chk2 foi positiva em 69% dos pacientes. Houve associação entre a expressão de Chk2 e o status linfonodal (p = 0,012) e entre a sobrevivência (p=0,034). A expressão negativa de Chk2 aumentaram as chances de envolvimento linfonodal (OR:10,2, p=0,03). O tempo de sobrevida global de pacientes Chk2 negativo foi maior (72 versus 59 meses, p=0,155), o mesmo foi observado com o tempo sobrevida livre de progressão (19 versus 13 meses, p=0,293). As curvas de sobrevida foram diferentes de acordo com a expressão do Chk2 em pacientes com ou sem envolvimento linfonodal, sendo menor nos pacientes com Chk2 positivo, p=0,028. Houveram mais óbitos em pacientes com Chk2 positivo. Análise multivariada identificou o performance status segundo a escala de ECOG (p=0,001 ); metástase sincrônica (p=0,037); diferenciação das células tumorais (p=0,029) e expressão de Chk2 (p=0,020) como fatores independentes para sobrevida global. CONCLUSÃO: A expressão positiva do Chk2 no adenocarcinoma de cólon metastático foi indicativa de maior agressividade e disseminação tumoral, impactando de forma negativa na sobrevida e desfecho dos pacientes. / INTRODUCTION: The DNA damage checkpoint pathway has been of interest to the field of cancer biology, since checkpoint defects result in the accumulation of altered genetic information, a central feature of carcinogenesis. Little is known about the role of Chk2 in colorectal cancer tumorigenesis. OBJECTIVE: The purpose of this study was to evaluate Chk2 expression in metastatic colon cancer and correlate this with clinicopathological features and patient survival. PATIENTS AND METHODS: Tissues were obtained from 58 patients with confirmed metastatic colon cancer diagnosis, treated with capecitabine and oxaliplatin chemotherapy as standard doses. Patients included had, at least, 2 years post diagnosis of clinical following. The tissue microarray immunohistochemistry was the technic to evaluate Chk2 expression. Statistics analysis used SPSS 17. A p-value <0,050 was considered to be statistically significant. Immunohistochemical expression of Chk2 and its relationship with clinical and pathological characteristics and survival data was reported. RESULTS: The expression of Chk2 was positive in 69%. There was association between expression of Chk2 and Iymph node status (p=0.012) and between survival (p=0.034). The negative expression of Chk2 enhanced the chances of linfonodal involvement (OR:10,2, p=0.03). The global survival time of Chk2 negative patients was higher (72 versus 59 months, p= 0.155); the same was observed with progression-free survival time (19 versus 13 months, p=0.293). The survival curves were different according to Chk2 expression in patients with or without Iymph node involvement, being lower in patients with Chk2 positive, p=0.028. There were more deaths in patients with Chk2 positive. Multivariate regression analysis identified performance status ECOG (p=0.001), synchronous metastasis (p=0.037), tumor cell differentiation (p=0.029) and expression of Chk2 (p=0.020) as independent factors to overall survival. CONCLUSION: This study demonstrated that the Chk2 positive expression in colon cancer indicates increased tumor spread and tumoral aggressiveness, impacting negatively on survival and outcome of patients.

A pré-eclâmpsia (PE) é causa importante de mortalidade fetal e materna em todo mundo e existem evidências que a resistência à insulina esteja implicada em sua fisiopatologia. A via Akt/PKB é estimulada pela insulina e exerce várias funções vitais como crescimento, sobrevivência e metabolismo celular. Objetivo: investigar a expressão basal da Akt/PKB, proteínas que regulam sua atividade e de seus substratos em placenta, músculo esquelético e adipócitos de parturientes normais e com pré-eclâmpsia. Método: amostras de 17 pacientes normais e 17 pacientes com PE foram coletadas, preparadas e analisadas por Western blot para quantificação da expressão de proteínas envolvidas na cascata de sinalização da Akt/PKB. Resultados: em placentas a expressão basal da P85 foi 1,12 (0,83 – 1,62 mediana e percentils 25 - 75), para normais e 1,29 (0,89 – 1,96) para PE com p = 0,42; a expressão da Akt/PKB total foi 1,85 (1,07 - 3,12) para normais e 1,53 (1,27-3,08) com p = 1,00. A atividade dos substratos da Akt/PKB fosforilados em serina e treonina foi semelhante entre placentas de parturientes normais e PE, e a expressão da HSP90 também se mostrou semelhante entre os dois grupos. No músculo esquelético a expressão da P85 foi de 1,41 (1,20 - 6,29) para normais e 1,63 (1,32- 1,90) para PE com p = 0,91. A expressão de Akt/PKB total foi de 0,96 (0,84 - 1,31) para normais e 1,55 (0,87 - 1,86), p = 0,41. A atividade dos substratos da Akt/PKB fosforilados em serina e treonina foi semelhante nesse tecido entre normais e PE, e a expressão da HSP90 também se mostrou semelhante entre os dois grupos no músculo esquelético. No tecido adiposo a expressão de Akt/PKB total foi 1,10 (0,53 - 1,73) em normais e 1,66 (0,83 - 2,00) em PE com p = 0,37 e a expressão do IRß; 1,58 (0,56 - 3,23) para normais e 2,00 (0,91 - 6,65) para PE com p = 0,53. Conclusões: Não houve diferença na via da Akt/PKB, em estado basal, em placenta e músculo esquelético de pacientes com PE e normais. Contudo, não podemos descartar defeitos nessa via de sinalização como fisiopatologia da PE, pois ainda é necessária a análise dessa via estimulada. / Preeclampsia (PE) is important cause of fetal and maternal mortality around the world and there are evidences that insulin resistance has been implicated in the pathophysiology of preeclampsia. Akt/PKB via is stimulated by insulin and perform several vital functions as growth, survival and cellular metabolism. Objective: to investigate the basal expression of Akt/PKB, proteins that regulate Akt/PKB activity and Akt/PKB substrate in the placenta, skeletal muscle and adipocytes of normal and preeclampsia parturient. Method: samples were collected from 17 normal patients and 17 PE patients, prepared and analyzed by Western blot to quantify the proteins expression involved in signaling cascade of Akt/PKB. Results: the basal expression of P85 in normal placentas was 1.12 (0.83 – 1.62 median and percentiles 25 - 75), and for PE 1.29 (0.89 – 1.96) with p = 0.42; total Akt/PKB expression for normal was 1.85 (1.07 – 3.12) and 1.53 (1.27-3.08) with p = 1.00. The Akt/PKB phospho(ser/thr) substrates activity was not different in placentas of the normal and PE groups and the HSP90 also showed no difference between the groups. In the skeletal muscle the expression of P85 of normal placentas was 1.41 (1.20 – 6.29) and for PE 1.63 (1.32- 1.90) with p = 0.91. Total Akt/PKB expression for normal was 0.96 (0.84 – 1.31) and 1.55 (0.87 – 1.86), p = 0.41. The Akt/PKB phospho(ser/thr) substrates activity was not different in skeletal muscle of the normal and PE groups and the HSP90 also showed no difference between the groups. Total Akt/PKB expression in the adipose tissue of normal placentas was 1.10 (0.53 – 1.73) and for PE 1.66 (0.83 – 2.00) with p = 0.37 and the expression of IRß of normal placentas was 1.58 (0.56 – 3.23) and for PE 2.00 (0.91 – 6.65) with p = 0.53. Conclusions: there was no difference in Akt/PKB via, in basal state, in placentas and skeletal muscle of normal and PE patients. However, we cannot discard defects in this signaling via as pathophysiology of PE, because it is still necessary to analyze this via during stimulation.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4996_1.pdf: 368944 bytes, checksum: 8bd95b0fde9736f57f5f1b1e06fe2b78 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2002 / O propranolol, utilizado frequentemente na patologia cardíaca por seu efeito bloqueador &#946;-adrenérgico, está freqüentemente associado com efeitos sexuais colaterais. Esses efeitos não parecem estar relacionados ao bloqueio &#946;-adrenérgico. O efeito do propranolol sobre o metabolismo dos fosfolipídios e do diacilglicerol tem sido referido na literatura. No presente trabalho foi estudado o envolvimento da via de tradução do sinal do diacilglicerol/proteína quinase C (DAG/PK-C) na ação do propranolol sobre a secreção de testosterona em células intersticiais testiculares de rato. O tratamento agudo com propranolol estimulou a secreção de testosterona in vitro com concentrações da droga variando de 1&#956;M a 100 &#956;M. O H-7 (20 &#956;M), inibidor da PK-C, reduziu esse efeito em aproximadamente 50%. Na concentração de 75 &#956;M o S-propranolol reduziu 50% da ligação do [3H]12,13-dibutirato de forbol ([3H]PDBu) às células enquanto que no homogeneizado dessas células a redução da ligação foi de apenas 5%. Esses resultados sugerem que o efeito do S-propranolol sobre a ligação do [3H]PDBu poderia ser indireto, possivelmente por aumentar a concentração de um mediador químico que interage com o domínio regulatório da PK-C. Em concentrações ainda mais baixas (1 nM a 100 nM), o S- ou R-propranolol adicionado diretamente à mistura de reação com PK-C parcialmente purificada das células intersticiais aumentou a fosforilação da histona. Essa fosforilação foi comparável àquela obtida com (25 &#956;M) fosfatidilserina, não ocorreu em ausência de Ca2+ e foi revertida com 20 &#956;M H-7. O tratamento crônico com propranolol por via intraperitoneal (30 mg/Kg/8 dias) bloqueou o efeitoestimulatório do S-propranolol e dos ativadores da PK-C (PDBu e LHRH) sobre a secreção de testosterona em células intersticiais testiculares in vitro, sugerindo a dessensibilização da via do DAG/PK-C nessas células. Contudo, a atividade da PK-C não foi modificada. O tratamento mais prolongado, por via oral, com propranolol (500 mg/L/5 semanas) produziu uma dessensibilização mais suave na resposta secretória das células, não modificou a ligação do [3H]PDBu e não modificou a atividade, em valores absolutos, da PK-C. Esses resultados sugerem que a PK-C não está envolvida na dessensibilização da resposta secretória. A especificidade dessa dessensibilização é sugerida pela não modificação (redução) do efeito inibitório do propranolol sobre a secreção de testosterona estimulada pelo hCG e dbAMPc, ativadores indireto e direto da PK-A. Concluindo, os resultados sugerem que a PK-C pode ser a quinase putativa envolvida no efeito agudo estimulatório do propranolol sobre a secreção de testosterona pelas células intersticiais testiculares e que a dessensibilização dessas células após tratamento crônico com propranolol não envolve diminuição da atividade ou de concentração dessa enzima

Orientador: Sara Terezinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T12:26:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Borges_Luciene_D.pdf: 3990737 bytes, checksum: 7c865de830ecbe5f830e992e6c69fb2c (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Estímulo mecânico é um dos principais eventos envolvidos na hipertrofia cardíaca que afeta vários componentes de vias de sinalização do miocárdio. Recentemente, um novo transcrito altamente expresso em músculo cardíaco, denominado de ARHGAP21, foi descrito como um membro da família de proteínas Rho GAP, que demonstrou atividade catalítica sobre Cdc42 e interação com ARF1, ARF6 e a-catenina, proteínas importantes do remodelamento do citoesqueleto e junções aderentes. No presente estudo, tivemos como objetivo analisar a expressão da ARHGAP21 em resposta ao estresse mecânico agudo em corações de ratos adultos, e sua associação com FAK e PKC?. Utilizando-se fracionamento subcelular, microscopia confocal e eletrônica, demonstramos que ARHGAP21 relocaliza-se das regiões nucleares e miofilamentos para linhas Z, discos intercalares e costâmeros de cardiomiócitos submetidos à sobrecarga de pressão, sugerindo que esta roteína pode desenvolver uma importante função no remodelamento cardíaco. Além do mais, ensaio de imunoprecipitação mostrou que ARHGAP21 interage com PKC? e FAK em ratos controle, submetidos à coarctação da aorta e espontaneamente hipertensos (SHR). Três diferentes regiões de FAK, contendo cauda de GST acoplada, foram utilizadas em ensaio de ligação in vitro, demonstrando que ARHGAP21 se liga à porção carboxi terminal de FAK. Além disso, ARHGAP21 associa-se à PKC? fosforilada em Thr410 em o-imunoprecipitados de extratos protéicos de ratos controle e SHR. Entretanto, ARHGAP21 associa-se apenas à FAK fosforilada em Tyr925 em SHR. Também foi verificado que PKC? é fosforilada por estímulo mecânico. Estes resultados sugerem que ARHGAP21 pode atuar como uma molécula sinalizadora ou proteína adaptadora das vias de sinalização de FAK e PKC? em cardiomiócitos, provavelmente desempenhando importante função durante estresse cardíaco / Abstract: Mechanical stimulus is one of the major events involved in cardiac hypertrophy, and affects components of essential myocardium signaling pathways. Recently, we described a highly expressed mRNA in the cardiac muscle as a member of the RhoGAP family of proteins, ARHGAP21, which demonstrated GAP activity over Cdc42 and interacted with ARF1, ARF6 and a-catenin important proteins of the cytoskeleton assembly and adherent junctions. In the present work, we aimed to analyze the expression of ARHGAP21 in response to acute mechanical stress in the adult rat heart and its association with FAK and PKC? proteins. By subcellular fractionation, confocal and immunoelectron microscopy, we demonstrated that ARHGAP21 is relocated from the nucleus to the plasma membrane, Z-lines and costameres of cardiomyocytes submitted to pressure overload conditions, suggesting that this protein may develop a role in cardiac remodeling. Furthermore, immunoprecipitation assay showed that ARHGAP21 interacted with PKC? and FAK in control rats, rats submitted to aortic clamping and spontaneously hypertensive rats (SHR). Using three different GST-tagged regions of FAK, we found that ARHGAP21 binds to the carboxyl terminal portion of FAK. Moreover, ARHGAP21 binds to PKC? phosphorylated on Thr410 in co-immunoprecipitates of protein extracts from sham control rats and SHR. However, ARHGAP21 only binds to FAK phophorylated on Tyr925 of SHR. We have also shown that PKC? is phosphorylated by mechanical stimuli. Altogether, these results suggest that ARHGAP21 may act as a signaling molecule or scaffold protein of FAK and PKC? signaling pathways in cardiomyocytes, probably developing an important function during cardiac stress / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-18T14:50:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Nilma S. Fernandes.pdf: 6082028 bytes, checksum: de37a4a2f24939ff1f4b11c41513d404 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-18T14:50:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Nilma S. Fernandes.pdf: 6082028 bytes, checksum: de37a4a2f24939ff1f4b11c41513d404 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-18T14:50:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Nilma S. Fernandes.pdf: 6082028 bytes, checksum: de37a4a2f24939ff1f4b11c41513d404 (MD5) Previous issue date: 2017-05-29 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Lauraceae family species are rich in bioactive compounds, including alkaloids, with high pharmaceutical potential, such as activities against Leishmania amazonensis and Trypanosoma cruzi. These protozoa are, respectively, etiological agents of cutaneous Leishmaniasis and Chagas’ disease, which affect millions of people in underdeveloped and developing countries. Current therapeutic options available for treatment of these infections have severe side effects and low efficacy, for this reason, the development of effective and less toxic chemotherapeutic agents is extremely important. In order to find bioactive plant compounds with potential against these parasites, we performed an in vitro screening with ethanolic extracts of 12 species of Lauraceae against T. cruzi and L. amazonensis. Furthermore, a new molecular approach had been proposed to identify molecular drug targets in L. mexicana. The most active extracts were submitted to acid-base partition and the fractions have been evaluated. The bioguided assay led to isolation of 6 alkaloids. A new indole alkaloid isolated from A. panurensis, 3-methoxy-2-oxa-4,10b-diaza-1,3,6a,10c-tetrahydrofluoranthene-3,5-diol, had moderate activity against the three forms of T. cruzi and Leishmania amazonensis promastigotes. It was also shown that this alkaloid induces morphological and biochemical modifications in L. amazonensis promastigotes, impairing cytokinesis and generating cells with multiple nuclei and flagella. The compounds tested in this thesis show potential for modifications to its structure to improve activity and could potentially be tested in other parasites. The second chapter of the thesis aims to validate an inducible overexpression approach for L. mexicana, which could be used to generate an overexpression library. The results demonstrated for the first time the expression of an endogenous L. mexicana kinase (CRK3). Furthermore, a new system to inducible overexpression had been produced. This new molecular tool is suitable for all life cycle stages and could be used as a tool for drug discovery and to understand the complex biology of the parasite. The phytochemical and molecular approaches used here resulted in original data wich will help the discovery for new molecules against the trypanosomatids. / Espécies pertencentes à família Lauraceae são ricas em alcaloides e outras substâncias bioativas com alto potencial farmacêutico, inclusive atividades contra os tripanosomatídeos Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi. Esses são, respectivamente, protozoários agentes etiológicos de leishmaniose e doença de Chagas, doenças que afetam milhões de pessoas em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento. As opções terapêuticas disponíveis atualmente para o tratamento de infecções causadas por esses parasitos têm severos efeitos colaterais e baixa eficácia, sedo a busca por novos fármacos de extrema importância. No sentido de buscar substâncias bioativas de plantas com potencial farmacêutico, foi realizada triagem in vitro utilizando extratos etanólicos de 12 espécies de Lauraceae contra T. cruzi e L. amazonensis a fim de encontrar os extratos mais promissores. Ainda, foi proposto a geração de uma ferramenta molecular para utilização na busca por substâncias ativas frente a L. mexicana. Os extratos mais ativos foram submetidos à partição ácido-base e as frações alcaloídicas avaliadas. A partir desse ensaio bioguiado, 6 alcaloides forem isolados e a atividade in vitro frente aos tripanosomatídeos avaliada. O alcaloide indólico 3-metoxi-2-oxa-4,10b-diaza-1,3,6a,10c-tetrahidrofluorantano-3,5-diol foi ativo contra T. cruzi e L. amazonensis. Este alcaloide induz alterações morfológicas e bioquímicas em promastigotas de L. amazonensis, atuando na divisão celular, com bloqueio na citocinese, processo autofágico e consequente colapso celular e morte. Já os resultados obtidos na parte final, com foco na ferramenta molecular para busca por substâncias, foi demonstrado pela primeira vez a superexpressão induzida de proteína endógena neste protozoário. Ainda, foi gerado modelo de superexpressão de proteínas que poderá ser utilizado para analisar as alterações fenotípicas, inferir funções de proteínas, ensaios para busca de fármacos, bem como compreender a complexa biologia de L. mexicana. As duas abordagens utilizadas resultaram em dados inéditos que permitem a continuação tanto dos trabalhos fitoquímicos quanto os moleculares, a fim de buscar novos fármcos frente aos tripanosomatídeos utilizados.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:01:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo7056_1.pdf: 2400536 bytes, checksum: 015771d94ec8f8e0629d6c5d29fdaf2d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Quando submetidas a condições de estresse as células respondem a partir da indução de genes e ativação de proteínas em mecanismos regulados por cascatas de eventos metabólicos. Na levedura Saccharomyces cerevisiae muitos desses sinais externos são recebidos e amplificados por vias das chamadas MAP quinases. Em estudos anteriores mostramos a eficácia do biocida catiônico polihexametileno biguanida (PHMB) no combate a leveduras que contaminam o processo de fermentação alcoólica industrial. Entretanto, foi observado que certas linhagens de S. cerevisiae são sensíveis a esse biocida. Portanto, para que se possa propor o uso deste composto no controle de contaminações industriais é necessário que conheçam os mecanismos moleculares envolvidos na resposta à ação biológica do PHMB e dos mecanismos de resistência celular a este composto. Trabalhos da literatura mostraram que células de E. coli respondem a este composto a partir da expressão de genes envolvidos na manutenção da integridade da parede celular (CWI). A partir da identificação desses homólogos em Saccharomyces cerevisiae realizamos uma série de experimentos de análise da expressão gênica e da avaliação de linhagens mutantes dessa levedura. Os experimentos mostraram que a cascata regulatória da via da proteína quinase C (PKC) regula a expressão dos genes do mecanismo CWI que respondem às lesões na parede celular induzidas pelo PHMB, causando um estresse osmótico que é sentido e restaurado pelos genes da via HOG. O efeito protetor da trealose, a geração de desequilíbrio redox e a natureza do efeito tóxico sugerem que PHMB dispara o mesmo sinal molecular que é sentido pelas células quando submetidas a estresse etanólico. Além disso, a proteína Yap1, principal regulador da transcrição dos genes de resposta a estresse oxidativo, parece ser crucial para a resistência ao PHMB, embora neste caso a função desse fator de transcrição estaria relacionada com um efeito protetor sobre a parede celular. Com isso, estamos propondo uma nova função biológica para a proteína Yap1 na resposta a estresse industrial em Saccharomyces cerevisiae