Este estudo foi elaborado com o objetivo de elucidar os mecanismos de resistência às quinolonas presentes em enterobactérias isoladas de pacientes de duas regiões metropolitanas brasileiras. Foram avaliadas possíveis alterações nas proteínas relacionadas com o sítio de ação das quinolonas, bem como a presença de plasmídeos e integrons que carregam determinantes gênicos que codificam resistência às quinolonas. A associação destes com mecanismos plasmideais de resistência aos antibióticos -lactâmicos também foi analisada. Foram avaliadas 257 enterobactérias resistentes ao ácido nalidíxico isoladas de pacientes hospitalizados e da comunidade no período de 2000 a 2005. Por PCR e seqüenciamento, foram analisadas as mutações presentes nos genes cromossômicos gyrA e parC e as estruturas gênicas associadas com determinantes plasmideais de resistência às quinolonas, Qnr, e aos -lactâmicos de amplo espectro. Foram determinados os perfis plasmideais e a transferabilidade dos plasmídeos que carrearam estes determinantes. A extração e a análise das proteínas de membrana externa foi realizada para avaliar uma possível perda ou diminuição da expressão de porinas, também relacionada com os mecanismos de resistência avaliados. Todas as amostras foram resistentes ao ácido nalidíxico, apresentando concentração inibitória mínima (CIM) superior a 16 g/mL, e em média, 70% apresentaram diminuição de sensibilidade às fluoroquinolonas testadas. De 257 enterobactérias resistentes ao ácido nalidíxico, em seis enterobactérias (2,3%), incluindo 3 E. coli, 2 K. pneumoniae e 1 C. freundii foi encontrado o gene qnrB. Cinco linhagens apresentaram suas seqüências idênticas ao gene qnrB2, e uma linhagem, C. freundii JF79, apresentou uma seqüência idêntica ao gene qnrB8. Em uma linhagem de E. cloacae foi detectado o gene qnrA1 (0,37%). Os genes qnrA e qnrB apresentaram-se localizados em plasmídeos que apresentaram de 55 a 180 kilobases. A análise da estrutura gênica indicou que os genes qnrA1 e qnrB2 estavam associados com um integron classe 1 e localizados entre o elemento ISCR1 e a segunda cópia do segmento conservado 3. Na coleção bacteriana avaliada, as principais mutações observadas foram nos códons 83 e 87 em gyrA, e nos códons 80 e 84 em parC. Todas as enterobactérias que exibiram unicamente mutações no gene gyrA apresentaram CIM 16 µg/mL para o ácido nalidíxico. A diferença encontrada nos valores da CIM de fluoroquinolonas em enterobactérias que apresentaram as mesmas substituições em GyrA e ParC foi explicada pela ausência ou diminuição da expressão de porinas. Em relação à produção de -lactamase de espectro ampliado (ESBL), sua presença foi comprovada em 24 (9,3%) enterobactérias. O seqüenciamento de blaCTX-M identificou 18 determinantes: CTX-M-2 (n=13), incluindo dois novos variantes, CTX-M-8 (n=2) e CTX-M-9 (n=3) mediados por plasmídeos de 48 a 180 kilobases, não conjugativos, em maioria. O gene blaSHV-5 foi detectado em seis enterobactérias. Todos os determinantes do grupo 2 apresentaram-se associados com um elemento ISCR1, enquanto que aqueles do grupo 9 estiveram relacionados com ISEcp1. Concluindo, o principal mecanismo de resistência às quinolonas detectado foi a presença de substituições em GyrA e ParC, apesar de outros mecanismos, como a diminuição da expressão de porinas estarem envolvidos nas enterobactérias avaliadas. A associação da produção de ESBL foi significativa devido ao encontro de uma grande diversidade de genótipos circulando na comunidade, com uma predominância de enterobactérias produtoras de CTX-M. Quanto aos determinantes Qnr descritos neste estudo, que notoriamente foram os primeiros relatos no Brasil, somente dois deles apresentaram-se relacionados com a produção de ESBL. / The aim of this study was to investigate the main mechanisms of quinolone resistance among enterobacterial isolates recovered from hospitalized patients and outpatients in Brazil. The modification of the quinolone targets with changes of DNA gyrase and of topoisomerase IV genes and the presence of determinants codifying plasmid- mediated quinolone and oxymino- cephalosporins resistance were investigated. Two hundred fifty seven non-duplicate nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates recovered from January 2000 to May 2005 were analysed. Mutations in the topoisomerases gyrA and parC genes and the genetic structures surrounding Qnr and CTX-M determinants were recognized by PCR and sequencing. Conjugation experiments were performed to determine whether the qnr- and blaCTX-M carrying plasmids were self transferable. Also, decrease in the level of porin expression related to quinolone resistance was assessed. All enterobacterial isolates were resistant to nalidixic-acid, showing minimal inhibitory concentrations (MIC) 16 g/mL and 70% of these isolates showed decreased susceptibility to fluoroquinolone. Six qnrB-positive (2.3%) out of 257 nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates, were identified, including 3 Escherichia coli, 2 Klebsiella pneumoniae and 1 Citrobacter freundii. Five isolates had an identical qnrB2 sequence and one isolate, C. freundii 79, possessed the qnrB8. A single Enterobacter cloacae carrying a plasmid encoding qnrA gene was identified (0.37%). All isolates were negative for the qnrS genes. Plasmid-mediated quinolone resistance ranged from 55- to 180-kb in size. Sequence analysis of the genetic structures surrounding of the qnrA and qnrB genes identified an ISCR1 element at the left-hand boundary and a partial copy of the 3-end segment of class 1 integrons. Concerning the changes of DNA gyrase and topoisomerase IV, the most common modification in the enterobacterial isolates analyzed were present at codons 83 and 87 in GyrA and in ParC at codons 80 and 84. All isolates that exhibited mutations in gyrA gene showed nalidixic-acid MIC 16 µg/mL. The finding of different MIC values to fluoroquinolones in enterobacterial isolates with the same GyrA and ParC modification was explained by a decreasing in the level of porin expression. Regarding -lactam resistance mechanisms, twenty four (9.3%) ESBL-producing enterobacterial isolates were detected. Sequencing of the CTX-M-encoding genes identified 18 determinants belonging to CTX-M-2 (n=13), CTX-M-8 (n=2) and CTX-M-9 (n=3) groups. CTX-M-2 group determinants included blaCTX-M-2 and the two novel variants. Plasmids harboring blaCTX-M genes ranged from 48- to 180- kb in size and were not transferable, in their majority. The blaSHV-5 genes were detected in all the 6 blaCTX-M negative isolates. All alleles belonging to the group 2 were associated with ISCR1 element, while all blaCTX-M-9 genes were related to ISEcp1 element. In conclusion, alterations in the targets of quinolones, GyrA and ParC was the main mechanism of quinolone resistance identified in this study, although a decreasing of the porins expression had been identified among nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates. In the surveyed area, the prevalence of ESBL producers was important (9.3%), provided that this finding was related to a large diversity of genotypes circulating in the community, mainly CTX-M-producing isolates. This study constituted the first epidemiological survey of QnrA and QnrB determinants among Brazilian isolates. Interestingly, the qnrB2 gene was identified in non ESBL producers isolates and qnrS genes were not found.

El objetivo del presente trabajo es estudiar el encapsulamiento de ciprofloxacina en matrices de alginato y su liberación empleando diversas condiciones experimentales. En particular: 1) Estudiar las condiciones ambientales de encapsulamiento de ciprofloxacina, a través de la modificación de los principales efectores: pH y calcio(II). 2) Caracterización morfológica de las microesferas de alginato conteniendo la ciprofloxacina. 3) Estudiar las características de liberación controlada de ciprofloxacina en las siguientes condiciones experimentales, a saber: • pH estomacal (1.2 ) y pH intestinal (7.4) • temperatura (30 ºC) • fuerza iónica (10 a 200 mM NaCl)

A diferenciação entre processos infecciosos e inflamatórios representa um grande desafio na área de diagnóstico. A complexação do antimicrobiano ciprofloxacino (CIP) com o tecnécio (99mTc-CIP) vem sendo estudada com objetivo de desenvolver um radiofármaco com alta especificidade no diagnóstico de infecções, baseado em seu amplo espectro de atividade antibacteriana. O mecanismo de ação do fármaco consiste na ligação deste com a enzima ADN-girase da bactéria, permitindo sua ligação à bactéria ativa e a obtenção de imagens devido a fótons emitidos pelo 99mTc. Tendo em vista que o local de formação do complexo envolve os mesmos grupos funcionais responsáveis pela ligação do fármaco à enzima, sua eficácia pode ser prejudicada. A diferenciação entre processos infecciosos e inflamatórios representa um grande desafio na área de diagnóstico. A complexação do antimicrobiano ciprofloxacino (CIP) com o tecnécio (99mTc-CIP) vem sendo estudada com objetivo de desenvolver um radiofármaco com alta especificidade no diagnóstico de infecções, baseado em seu amplo espectro de atividade antibacteriana. O mecanismo de ação do fármaco consiste na ligação deste com a enzima ADN-girase da bactéria, permitindo sua ligação à bactéria ativa e a obtenção de imagens devido a fótons emitidos pelo 99mTc. Tendo em vista que o local de formação do complexo envolve os mesmos grupos funcionais responsáveis pela ligação do fármaco à enzima, sua eficácia pode ser prejudicada. O objetivo deste trabalho foi avaliar as condições ideais para ligação do 99mTc a duas quinolonas (CIP e pefloxacino), utilizando diferentes agentes redutores (SnCl2 e FSA), pH da solução e temperatura de incubação. A complexação dos fármacos ao radioisótopo 99mTc foi avaliada através do controle radioquímico, utilizando cromatografia em camada delgada. Posteriormente, testou-se sua atividade antimicrobiana in vitro utilizando diferentes microorganismos. O agente redutor FSA não foi eficiente na formação do complexo, resultando em uma concentração alta de Tc livre (37%). A formulação com Sn aumentou a formação de colóide com aquecimento (100 ºC). A complexação dos antimicrobianos ao Tc impediu sua ligação à ADN-girase. A taxa de ligação variou de 10% (filtração) a 16% (centrigugação). Além disso, verificou-se boa correlação entre a formação de colóide e quantidade de radiação ligada à bactéria em ambos os testes. Esta perda de atividade vem de encontro a alguns estudos clínicos relatados na literatura, que revelam a não diferenciação entre processos infecciosos e processos inflamatórios pelas quinolonas marcadas com 99mTc. / Differentiation between inflammation and infection represents a major challenge in clinical diagnostics. Several studies using ciprofloxacin (CIP), a broad spectrum antimicrobial agent, complexed with technetium (99mTc) have been reported in order to evaluate its capacity to diagnose infections. CIP mechanism of action involves its binding with bacterial DNA-gyrase during the growth phase and the acquisition of images due to 99mTc radioactivity. The fact that the sites of complexation are the same as those involved in bacterial binding it may affect its antimicrobial activity. The objective of the present work was to evaluate the ideal conditions for the complexation of CIP and pefloxacin with 99mTc using stannous chloride and formamidinesulfinic acid (FSA) as reducing agents, different pH and temperatures. The efficiency of complexation was monitored using radiochemical control as well as thin layer chromatography. Furthermore the antimicrobial activity of both complexes was evaluated in vitro. FSA was not adequate as a reducing agent and SnCl2 was better at room temperature than using heat (100 oC). The complexes did not bound well to the bacterias with binding efficiencies ranging from 10 (filtration method) to 16% (centrifugation method). Besides that, a good correlation between colloid formation (impurity) and radioactivity bound to bacterias was found. This decrease in bacterial activity was previously reported in some articles suggesting that quinolones complexed with 99mTc are not suitable to diagnose infections in the presence of inflammation.

Surtos associados às micobactérias de crescimento rápido (MCR) têm sido cada vez mais relatados em todo o mundo, inclusive no Brasil. Entre as MCR, o complexo M. abscessus é o mais patogênico e relacionado a multirresistência. Considerando a importância de investigar as cepas de MCR presentes em nosso Estado, este estudo teve como objetivos avaliar o perfil molecular e de suscetibilidade caracterizando os isolados de MCR encaminhados para o Centro de Referência em Micobactérias do Estado (Instituto de Pesquisas Biológicas - Laboratório Central de Saúde Pública, IPB-LACEN/RS). Além disso, foram avaliados os mecanismos de resistência à FQ conferido pelos genes gyrA e gyrB. Foram encaminhadas para o IPB-LACEN/RS, entre 2007 a 2012, 74 isolados clínicos. No total, 43 isolados relacionados a surto e 31 isolados de MCR não relacionados a surtos foram analisados. Pela técnica de PRA-hsp65 foi possivel identificar 43 isolados como M. abscessus tipo 2, 21 isolados como M. fortuitum tipo 1 e 10 isolados como M. abscessus tipo 1. Através do sequenciamento parcial do gene rpoB, foi confirmada a identificação de M. abscessus tipo 2 como M. abscessus subsp. bolletii, M. abscessus tipo 1 como M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum tipo 1 como M. fortuitum subsp. fortuitum. Pela técnica de tipagem PFGE todos os isolados de M. abscessus subsp. bolletii apresentaram o mesmo perfil clonal o qual pertence ao clone BRA100, já descrito mundialmente. Os isolados de M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum subsp. fortuitum apresentaram perfis distintos de PFGE. O perfil de suscetibilidade aos antibióticos foi avaliado por microdiluição em caldo de acordo com CLSI (2011) e, todos os isolados foram sensíveis a amicacina e todos foram resistentes a doxiciclina e sulfametoxazol-trimetoprima. Para M. abscessus subsp. bolletii todos os isolados foram resistentes à ciprofloxacino, moxifloxacino e tobramicina e um padrão de susceptibilidade variável foi observado para cefoxitina (Sensível - 28%, Intermediário - 72%) e claritromicina (Sensível - 86%, Resistentes - 14%). Cabe mencionar que este é o primeiro relato de resistência a claritromicina para o clone BRA100. Para M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum subsp. fortuitum todos os isolados foram resistentes a claritromicina; já para a cefoxitina e tobramicina um padrão de susceptibilidade variável foi observado. Todos os isolados de M. fortuitum subsp. fortuitum foram sensíveis à ciprofloxacino, em contraste aos isolados de M. abscessus subsp. abscessus que apresentaram 70% de resistência. Todas MCR, resistentes (ou intermediárias) para ciprofloxacino apresentaram uma Ala-83 em GyrA, em contraste com uma Ser-83 em todos os isolados de M. fortuitum subsp. fortuitum sensíveis a ciprofloxacino, mas com perfil de resistência variável a moxifloxacino. Nenhuma diferença foi encontrada em GyrB independentemente do perfil de sensibilidade de MCR. Em conclusão, nosso estudo relata a persistência de um único clone M. abscessus subsp. bolletii BRA100 relacionado aos surtos, altamente resistente, mesmo após a implementação nacional das medidas de controle de infecção para contenção de surtos por MNTs. Também foi possível correlacionar que mutações no aminoácido Ala-83 de GyrA estão diretamente relacionados com a resistência à ciprofloxacino em M. abscessus subsp. abscessus e M. abscessus subsp. bolletii. / Outbreaks associated with rapidly growing mycobacteria (RGM) have been increasingly reported worldwide, including in Brazil. Among RGM, the M. abscessus complex is consider the most pathogenic, besides being related to multidrug resistance. Considering the importance of investigating the RGM strains present in our state, this study aimed to characterize the molecular and susceptibility profile of RGM isolates referred to the Reference Center for Mycobacteria State (Instituto de Pesquisas Biológicas - Laboratório Central de Saúde Pública, IPB-LACEN/RS). Furthermore, the mechanisms of quinolone resistance conferred by gyrA and gyrB genes were evaluated. A total of 74 isolates was sent to IPB-LACEN/RS between 2007 and 2012. Forty-three of the analyzed isolates were related to outbreak and 31 isolates of RGM were unrelated to outbreaks. The technique of PRA- hsp65 identified 43 isolates as M. abscessus type 2, 21 isolates as M. fortuitum type 1 and 10 isolates as M. abscessus type 1. The partial sequencing of the rpoB gene confirmed the identification of M. abscessus type 2 as M. abscessus subsp. bolletii, M. abscessus type 1 as M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum type 1 and M. fortuitum subsp. fortuitum. PFGE typing technique showed the same clonal profile for all isolates of M. abscessus subsp. bolletii which belongs to clone BRA100, already described worldwide. Isolates of M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum subsp. fortuitum showed distinct PFGE profiles. The antibiotic susceptibility profile was evaluated by broth microdilution according to CLSI (2011), and all isolates were susceptible to amikacin and resistant to doxycycline and trimethoprimsulfamethoxazole. All isolates of M. abscessus subsp. bolletii were resistant to ciprofloxacin, moxifloxacin and tobramycin and presented variable susceptibility pattern to cefoxitin (Susceptible - 28%, Intermediate - 72%) and clarithromycin (Susceptible - 86%, Resistant - 14%). It is important to mention that this is the first report of clarithromycin resistance for clone BRA100. Strains of M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum subsp. fortuitum were all resistant to clarithromycin, and presented a variable susceptibility profile to cefoxitin and tobramycin. All isolates of M. fortuitum subsp. fortuitum were susceptible to ciprofloxacin, in contrast to isolates of M. abscessus subsp. abscessus that showed a resistance rate of 70%. All RGM ciprofloxacin non-susceptible presented an Ala-83 in GyrA, contrasting to a Ser-83 in all isolates of M. fortuitum subsp. fortuitum susceptible to ciprofloxacin, however, with a variable resistance profile to moxifloxacin. No difference was found in GyrB, regardless of the RGM susceptible profile. In conclusion, our study reports the persistence of a single clone of M. abscessus subsp. bolletii BRA100 related to outbreak, highly resistant, even after national implementation of infection control measures to contain outbreaks by NTM. It was also possible to correlate that mutations in the amino acid Ala-83 of GyrA are directly related to ciprofloxacin and moxifloxacin resistance in M. abscessus subsp. abscessus and M. abscessus subsp. bolletii.

Base teórica: Tuberculose (TB) e infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) são as principais causas de mortalidade relacionada a doenças infecciosas no mundo. A associação de TB com HIV e Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) adicionou morbidade e mortalidade a cada uma das pandemias; ambas expuseram as fragilidades dos sistemas de saúde pública e dos sistemas médicos e sociais, assim como disparidades em recursos e direitos sociais. A estratégia para controle da tuberculose consiste em diagnóstico e tratamento rápidos para interromper a cadeia de transmissão da doença e obter dsfechos favoráveis. Apesar disso, situações como monoterapia, prescrição inadequada e má adesão levam a emergência de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes. A resistência às drogas anti- TB foi descrita logo após a introdução da estreptomicina em 1944 e, atualmente, é a maior ameaça ao controle da tuberculose. Cepas resistentes causam maiores taxas de mortalidade, falha e recidiva, e o tratamento é mais tóxico, caro e prolongado. Objetivos: Determinar o padrão de resistência do M. tuberculosis isolado em pacientes HIV-positivos e os fatores de risco a ela associados. Métodos: Através de um estudo retrospectivo de coorte revisaram-se os prontuários de todos pacientes com HIV/AIDS e tuberculose do Hospital de Clínicas de Porto Alegre entre 2000 e 2005. Resultados: Foram incluídos 236 pacientes, selecionados a partir de dados do laboratório de microbiologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Resistência a pelo menos uma das drogas anti-TB foi detectada em 28 isolados (13,6%). Multirresistência (MDR), ou seja, resistência a pelo menos isoniazida e rifampicina, ocorreu em quatro (1,9%) pacientes. Uso prévio de quinolonas (por pelo menos cinco dias nos últimos 6 meses) foi relacionado com resistência à rifampicina (OR 16,54; IC95% 2,15 a 125,21; P<0,001), à isoniazida (OR 3,94; IC95% 1,02 a 15,79; P=0,04), à estreptomicina (OR 4,3; IC95% 1,06 a 17,11; P=0,02), ao etambutol (OR 33,27; IC95% 2,82 a 387,61; P<0,001) e à TB MDR (OR 16,15; IC95% 2,1 a 124; P<0,001), mas não com resistência à pirazinamida (OR 2,66; IC95% 0,29 a 23,57; P=0,36). Na análise multivariada, tratamento prévio com rifampicina, isoniazida, estreptomicina ou quinolona se relacionou com resistência a qualquer droga. Tratamentos contendo rifampicina foram protetores para mortalidade intra-hospitalar (OR 0,18; IC95% 0,02 to 1,01; P=0,02). Conclusão: Atualmente não há evidência de resistência cruzada entre quinolonas e outras drogas utilizadas no tratamento da tuberculose. Apesar disso, em nosso estudo, houve correlação entre uso prévio de quinolonas e resistência a drogas de primeira linha para tratamento da TB. Com isso, o uso de quinolonas em áreas de alta endemicidade da tuberculose deve ser evitado. / Background: Tuberculosis (TB) and human immunodeficiency virus (HIV) disease are the two leading causes of infectious disease-associated mortality worldwide. The harmful interaction of TB and HIV/AIDS has added greatly to the suffering and loss of life caused by each pandemic; together, the diseases expose underlying weakness in public health, medical, and social systems, as well as disparities in resources and human rights. The strategies to control tuberculosis consist in diagnosis and treatment as fast as possible to interrupt the transmission of the disease and to provide better outcomes. Even though, situations like monotherapy, bad prescription or lack of compliance lead to emergence of resistant M. tuberculosis. Resistance to antituberculosis drugs was first described soon after the introduction of streptomycin in 1944 and is currently one of the most important threats to global tuberculosis control. Drug resistant strains cause much higher rates of mortality, failure and relapse, and treatment is more toxic, expensive and lengthy. Objectives: This study was performed to determine the resistance profile of M. tuberculosis isolated from HIV-infected patients and factors that could be associated with resistance in southern Brazil. Methods: A retrospective cohort study was conducted at Hospital de Clínicas de Porto Alegre. From august 2000 to august 2005 all patients with the diagnosis of HIV infection and tuberculosis were included. Results: Tuberculosis was diagnosed in 236 patients. Resistance to at least one drug was seen in 28 (13.6%) isolates. Multi-drug resistance (resistance to isoniazid and rifampin) tuberculosis was seen in 4 (1.9%) isolates. Previous treatment with quinolones was related to resistance to rifampin (OR 16.54; CI 95% 2.15 to 125.21), to isoniazid (OR 3.94; CI 95% 1.02 to 15.79), to streptomycin (OR 4.3; CI 95% 1.06 to 17.11), to ethambutol (OR 33.27; CI 95% 2.82 to 387.61) and to multidrug-resistance (OR 16.15; CI 95% 2.1 to 124.0), but not with resistance to pyrazinamide (OR 2.66; CI 95% 0.29 to 23.57). In multivariate analysis, risk factors for any drug resistance were: previous rifampicin (P<0.001), isoniazid (P<0.001) and streptomycin (P<0.001) use. Previous quinolone use was also related to any drug resistance (P=0.006). Treatments containing rifampin were protective for in-hospital all-cause mortality rate (OR 0.18; CI 95% 0.02 to 1.01; P=0.02). Conclusion: So far, there is no evidence of cross-resistance between quinolones and anti-TB agents. The quinolones and first line TB drugs do not share similar mechanisms of resistance and there is lack of data referring to this cause-effect relation. Although, we found a correlation between previous use of quinolones and first-line TB drugs resistance and we believe that quinolones should not be used as first-line antibiotics to treat pneumonia in settings were TB is endemic.

A diferenciação entre processos infecciosos e inflamatórios representa um grande desafio na área de diagnóstico. A complexação do antimicrobiano ciprofloxacino (CIP) com o tecnécio (99mTc-CIP) vem sendo estudada com objetivo de desenvolver um radiofármaco com alta especificidade no diagnóstico de infecções, baseado em seu amplo espectro de atividade antibacteriana. O mecanismo de ação do fármaco consiste na ligação deste com a enzima ADN-girase da bactéria, permitindo sua ligação à bactéria ativa e a obtenção de imagens devido a fótons emitidos pelo 99mTc. Tendo em vista que o local de formação do complexo envolve os mesmos grupos funcionais responsáveis pela ligação do fármaco à enzima, sua eficácia pode ser prejudicada. A diferenciação entre processos infecciosos e inflamatórios representa um grande desafio na área de diagnóstico. A complexação do antimicrobiano ciprofloxacino (CIP) com o tecnécio (99mTc-CIP) vem sendo estudada com objetivo de desenvolver um radiofármaco com alta especificidade no diagnóstico de infecções, baseado em seu amplo espectro de atividade antibacteriana. O mecanismo de ação do fármaco consiste na ligação deste com a enzima ADN-girase da bactéria, permitindo sua ligação à bactéria ativa e a obtenção de imagens devido a fótons emitidos pelo 99mTc. Tendo em vista que o local de formação do complexo envolve os mesmos grupos funcionais responsáveis pela ligação do fármaco à enzima, sua eficácia pode ser prejudicada. O objetivo deste trabalho foi avaliar as condições ideais para ligação do 99mTc a duas quinolonas (CIP e pefloxacino), utilizando diferentes agentes redutores (SnCl2 e FSA), pH da solução e temperatura de incubação. A complexação dos fármacos ao radioisótopo 99mTc foi avaliada através do controle radioquímico, utilizando cromatografia em camada delgada. Posteriormente, testou-se sua atividade antimicrobiana in vitro utilizando diferentes microorganismos. O agente redutor FSA não foi eficiente na formação do complexo, resultando em uma concentração alta de Tc livre (37%). A formulação com Sn aumentou a formação de colóide com aquecimento (100 ºC). A complexação dos antimicrobianos ao Tc impediu sua ligação à ADN-girase. A taxa de ligação variou de 10% (filtração) a 16% (centrigugação). Além disso, verificou-se boa correlação entre a formação de colóide e quantidade de radiação ligada à bactéria em ambos os testes. Esta perda de atividade vem de encontro a alguns estudos clínicos relatados na literatura, que revelam a não diferenciação entre processos infecciosos e processos inflamatórios pelas quinolonas marcadas com 99mTc. / Differentiation between inflammation and infection represents a major challenge in clinical diagnostics. Several studies using ciprofloxacin (CIP), a broad spectrum antimicrobial agent, complexed with technetium (99mTc) have been reported in order to evaluate its capacity to diagnose infections. CIP mechanism of action involves its binding with bacterial DNA-gyrase during the growth phase and the acquisition of images due to 99mTc radioactivity. The fact that the sites of complexation are the same as those involved in bacterial binding it may affect its antimicrobial activity. The objective of the present work was to evaluate the ideal conditions for the complexation of CIP and pefloxacin with 99mTc using stannous chloride and formamidinesulfinic acid (FSA) as reducing agents, different pH and temperatures. The efficiency of complexation was monitored using radiochemical control as well as thin layer chromatography. Furthermore the antimicrobial activity of both complexes was evaluated in vitro. FSA was not adequate as a reducing agent and SnCl2 was better at room temperature than using heat (100 oC). The complexes did not bound well to the bacterias with binding efficiencies ranging from 10 (filtration method) to 16% (centrifugation method). Besides that, a good correlation between colloid formation (impurity) and radioactivity bound to bacterias was found. This decrease in bacterial activity was previously reported in some articles suggesting that quinolones complexed with 99mTc are not suitable to diagnose infections in the presence of inflammation.

Base teórica: Tuberculose (TB) e infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) são as principais causas de mortalidade relacionada a doenças infecciosas no mundo. A associação de TB com HIV e Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) adicionou morbidade e mortalidade a cada uma das pandemias; ambas expuseram as fragilidades dos sistemas de saúde pública e dos sistemas médicos e sociais, assim como disparidades em recursos e direitos sociais. A estratégia para controle da tuberculose consiste em diagnóstico e tratamento rápidos para interromper a cadeia de transmissão da doença e obter dsfechos favoráveis. Apesar disso, situações como monoterapia, prescrição inadequada e má adesão levam a emergência de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes. A resistência às drogas anti- TB foi descrita logo após a introdução da estreptomicina em 1944 e, atualmente, é a maior ameaça ao controle da tuberculose. Cepas resistentes causam maiores taxas de mortalidade, falha e recidiva, e o tratamento é mais tóxico, caro e prolongado. Objetivos: Determinar o padrão de resistência do M. tuberculosis isolado em pacientes HIV-positivos e os fatores de risco a ela associados. Métodos: Através de um estudo retrospectivo de coorte revisaram-se os prontuários de todos pacientes com HIV/AIDS e tuberculose do Hospital de Clínicas de Porto Alegre entre 2000 e 2005. Resultados: Foram incluídos 236 pacientes, selecionados a partir de dados do laboratório de microbiologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Resistência a pelo menos uma das drogas anti-TB foi detectada em 28 isolados (13,6%). Multirresistência (MDR), ou seja, resistência a pelo menos isoniazida e rifampicina, ocorreu em quatro (1,9%) pacientes. Uso prévio de quinolonas (por pelo menos cinco dias nos últimos 6 meses) foi relacionado com resistência à rifampicina (OR 16,54; IC95% 2,15 a 125,21; P<0,001), à isoniazida (OR 3,94; IC95% 1,02 a 15,79; P=0,04), à estreptomicina (OR 4,3; IC95% 1,06 a 17,11; P=0,02), ao etambutol (OR 33,27; IC95% 2,82 a 387,61; P<0,001) e à TB MDR (OR 16,15; IC95% 2,1 a 124; P<0,001), mas não com resistência à pirazinamida (OR 2,66; IC95% 0,29 a 23,57; P=0,36). Na análise multivariada, tratamento prévio com rifampicina, isoniazida, estreptomicina ou quinolona se relacionou com resistência a qualquer droga. Tratamentos contendo rifampicina foram protetores para mortalidade intra-hospitalar (OR 0,18; IC95% 0,02 to 1,01; P=0,02). Conclusão: Atualmente não há evidência de resistência cruzada entre quinolonas e outras drogas utilizadas no tratamento da tuberculose. Apesar disso, em nosso estudo, houve correlação entre uso prévio de quinolonas e resistência a drogas de primeira linha para tratamento da TB. Com isso, o uso de quinolonas em áreas de alta endemicidade da tuberculose deve ser evitado. / Background: Tuberculosis (TB) and human immunodeficiency virus (HIV) disease are the two leading causes of infectious disease-associated mortality worldwide. The harmful interaction of TB and HIV/AIDS has added greatly to the suffering and loss of life caused by each pandemic; together, the diseases expose underlying weakness in public health, medical, and social systems, as well as disparities in resources and human rights. The strategies to control tuberculosis consist in diagnosis and treatment as fast as possible to interrupt the transmission of the disease and to provide better outcomes. Even though, situations like monotherapy, bad prescription or lack of compliance lead to emergence of resistant M. tuberculosis. Resistance to antituberculosis drugs was first described soon after the introduction of streptomycin in 1944 and is currently one of the most important threats to global tuberculosis control. Drug resistant strains cause much higher rates of mortality, failure and relapse, and treatment is more toxic, expensive and lengthy. Objectives: This study was performed to determine the resistance profile of M. tuberculosis isolated from HIV-infected patients and factors that could be associated with resistance in southern Brazil. Methods: A retrospective cohort study was conducted at Hospital de Clínicas de Porto Alegre. From august 2000 to august 2005 all patients with the diagnosis of HIV infection and tuberculosis were included. Results: Tuberculosis was diagnosed in 236 patients. Resistance to at least one drug was seen in 28 (13.6%) isolates. Multi-drug resistance (resistance to isoniazid and rifampin) tuberculosis was seen in 4 (1.9%) isolates. Previous treatment with quinolones was related to resistance to rifampin (OR 16.54; CI 95% 2.15 to 125.21), to isoniazid (OR 3.94; CI 95% 1.02 to 15.79), to streptomycin (OR 4.3; CI 95% 1.06 to 17.11), to ethambutol (OR 33.27; CI 95% 2.82 to 387.61) and to multidrug-resistance (OR 16.15; CI 95% 2.1 to 124.0), but not with resistance to pyrazinamide (OR 2.66; CI 95% 0.29 to 23.57). In multivariate analysis, risk factors for any drug resistance were: previous rifampicin (P<0.001), isoniazid (P<0.001) and streptomycin (P<0.001) use. Previous quinolone use was also related to any drug resistance (P=0.006). Treatments containing rifampin were protective for in-hospital all-cause mortality rate (OR 0.18; CI 95% 0.02 to 1.01; P=0.02). Conclusion: So far, there is no evidence of cross-resistance between quinolones and anti-TB agents. The quinolones and first line TB drugs do not share similar mechanisms of resistance and there is lack of data referring to this cause-effect relation. Although, we found a correlation between previous use of quinolones and first-line TB drugs resistance and we believe that quinolones should not be used as first-line antibiotics to treat pneumonia in settings were TB is endemic.

AIG, CFL, SM, JR participaron en la concepción y diseño del estudio; AIG, CFL, MM, TJO y JR en el aporte de pacientes o material de estudio; CFL, TJO y JR en la obtención del financiamiento; TJO, SM, MJP, JR, y LJdV participaron el análisis e interpretación de los datos. Todos los autores participaron de la recolección de resultados, revisión crítica del manuscrito, aprobación de su versión final. / The main aim of this study was to establish the resistance levels to antimicrobial agents, in 222 non-pathogenic E. Coli strains of fecal origin in Peru. The proportion of resistance found to the evaluated antimicrobials was ampicillin (62.6%), cotrimoxazole (48,6%), tetracycline (43,0%) and chloramphenicol (15,8%). We emphasize the high resistance levels found for quinolones: 32% for nalidixic acid (NAL) and 12% for ciprofloxacin (CIP). These high levels of quinoloneresistance in non-pathogenic strains isolated from children in this age group highlight the extensive use and the impact of the intake of this kind of antimicrobials in the community, showing the potential risk of the loss of their utility in the area. / Este trabajo fue parcialmente financiado por Agència Catalana de Cooperació al Desenvolupament proyecto U2006 (LJdV), Centre de Cooperació per al Desenvolupament - Universitat Politècnica de Catalunya (LJdV), Agencia Española de Cooperación Internacional al Desarrollo proyectos numero A/4892/06 (LJdV), D/019499/08 y D/024648/09 (JR), Fogarty International Center, National Institute of Health, USA, proyecto 1K01TW007405 (TJO) Sanofi Pasteur y fondos de investigación del Dr. Lanata, Instituto de Investigación Nutricional, Lima, Perú. La investigación de JR es financiado por el proyecto CP05/0130 del FIS (Fondo de Investigaciones Sanitarias, España). / Revisión por pares.

Surtos associados às micobactérias de crescimento rápido (MCR) têm sido cada vez mais relatados em todo o mundo, inclusive no Brasil. Entre as MCR, o complexo M. abscessus é o mais patogênico e relacionado a multirresistência. Considerando a importância de investigar as cepas de MCR presentes em nosso Estado, este estudo teve como objetivos avaliar o perfil molecular e de suscetibilidade caracterizando os isolados de MCR encaminhados para o Centro de Referência em Micobactérias do Estado (Instituto de Pesquisas Biológicas - Laboratório Central de Saúde Pública, IPB-LACEN/RS). Além disso, foram avaliados os mecanismos de resistência à FQ conferido pelos genes gyrA e gyrB. Foram encaminhadas para o IPB-LACEN/RS, entre 2007 a 2012, 74 isolados clínicos. No total, 43 isolados relacionados a surto e 31 isolados de MCR não relacionados a surtos foram analisados. Pela técnica de PRA-hsp65 foi possivel identificar 43 isolados como M. abscessus tipo 2, 21 isolados como M. fortuitum tipo 1 e 10 isolados como M. abscessus tipo 1. Através do sequenciamento parcial do gene rpoB, foi confirmada a identificação de M. abscessus tipo 2 como M. abscessus subsp. bolletii, M. abscessus tipo 1 como M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum tipo 1 como M. fortuitum subsp. fortuitum. Pela técnica de tipagem PFGE todos os isolados de M. abscessus subsp. bolletii apresentaram o mesmo perfil clonal o qual pertence ao clone BRA100, já descrito mundialmente. Os isolados de M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum subsp. fortuitum apresentaram perfis distintos de PFGE. O perfil de suscetibilidade aos antibióticos foi avaliado por microdiluição em caldo de acordo com CLSI (2011) e, todos os isolados foram sensíveis a amicacina e todos foram resistentes a doxiciclina e sulfametoxazol-trimetoprima. Para M. abscessus subsp. bolletii todos os isolados foram resistentes à ciprofloxacino, moxifloxacino e tobramicina e um padrão de susceptibilidade variável foi observado para cefoxitina (Sensível - 28%, Intermediário - 72%) e claritromicina (Sensível - 86%, Resistentes - 14%). Cabe mencionar que este é o primeiro relato de resistência a claritromicina para o clone BRA100. Para M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum subsp. fortuitum todos os isolados foram resistentes a claritromicina; já para a cefoxitina e tobramicina um padrão de susceptibilidade variável foi observado. Todos os isolados de M. fortuitum subsp. fortuitum foram sensíveis à ciprofloxacino, em contraste aos isolados de M. abscessus subsp. abscessus que apresentaram 70% de resistência. Todas MCR, resistentes (ou intermediárias) para ciprofloxacino apresentaram uma Ala-83 em GyrA, em contraste com uma Ser-83 em todos os isolados de M. fortuitum subsp. fortuitum sensíveis a ciprofloxacino, mas com perfil de resistência variável a moxifloxacino. Nenhuma diferença foi encontrada em GyrB independentemente do perfil de sensibilidade de MCR. Em conclusão, nosso estudo relata a persistência de um único clone M. abscessus subsp. bolletii BRA100 relacionado aos surtos, altamente resistente, mesmo após a implementação nacional das medidas de controle de infecção para contenção de surtos por MNTs. Também foi possível correlacionar que mutações no aminoácido Ala-83 de GyrA estão diretamente relacionados com a resistência à ciprofloxacino em M. abscessus subsp. abscessus e M. abscessus subsp. bolletii. / Outbreaks associated with rapidly growing mycobacteria (RGM) have been increasingly reported worldwide, including in Brazil. Among RGM, the M. abscessus complex is consider the most pathogenic, besides being related to multidrug resistance. Considering the importance of investigating the RGM strains present in our state, this study aimed to characterize the molecular and susceptibility profile of RGM isolates referred to the Reference Center for Mycobacteria State (Instituto de Pesquisas Biológicas - Laboratório Central de Saúde Pública, IPB-LACEN/RS). Furthermore, the mechanisms of quinolone resistance conferred by gyrA and gyrB genes were evaluated. A total of 74 isolates was sent to IPB-LACEN/RS between 2007 and 2012. Forty-three of the analyzed isolates were related to outbreak and 31 isolates of RGM were unrelated to outbreaks. The technique of PRA- hsp65 identified 43 isolates as M. abscessus type 2, 21 isolates as M. fortuitum type 1 and 10 isolates as M. abscessus type 1. The partial sequencing of the rpoB gene confirmed the identification of M. abscessus type 2 as M. abscessus subsp. bolletii, M. abscessus type 1 as M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum type 1 and M. fortuitum subsp. fortuitum. PFGE typing technique showed the same clonal profile for all isolates of M. abscessus subsp. bolletii which belongs to clone BRA100, already described worldwide. Isolates of M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum subsp. fortuitum showed distinct PFGE profiles. The antibiotic susceptibility profile was evaluated by broth microdilution according to CLSI (2011), and all isolates were susceptible to amikacin and resistant to doxycycline and trimethoprimsulfamethoxazole. All isolates of M. abscessus subsp. bolletii were resistant to ciprofloxacin, moxifloxacin and tobramycin and presented variable susceptibility pattern to cefoxitin (Susceptible - 28%, Intermediate - 72%) and clarithromycin (Susceptible - 86%, Resistant - 14%). It is important to mention that this is the first report of clarithromycin resistance for clone BRA100. Strains of M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum subsp. fortuitum were all resistant to clarithromycin, and presented a variable susceptibility profile to cefoxitin and tobramycin. All isolates of M. fortuitum subsp. fortuitum were susceptible to ciprofloxacin, in contrast to isolates of M. abscessus subsp. abscessus that showed a resistance rate of 70%. All RGM ciprofloxacin non-susceptible presented an Ala-83 in GyrA, contrasting to a Ser-83 in all isolates of M. fortuitum subsp. fortuitum susceptible to ciprofloxacin, however, with a variable resistance profile to moxifloxacin. No difference was found in GyrB, regardless of the RGM susceptible profile. In conclusion, our study reports the persistence of a single clone of M. abscessus subsp. bolletii BRA100 related to outbreak, highly resistant, even after national implementation of infection control measures to contain outbreaks by NTM. It was also possible to correlate that mutations in the amino acid Ala-83 of GyrA are directly related to ciprofloxacin and moxifloxacin resistance in M. abscessus subsp. abscessus and M. abscessus subsp. bolletii.

A diferenciação entre processos infecciosos e inflamatórios representa um grande desafio na área de diagnóstico. A complexação do antimicrobiano ciprofloxacino (CIP) com o tecnécio (99mTc-CIP) vem sendo estudada com objetivo de desenvolver um radiofármaco com alta especificidade no diagnóstico de infecções, baseado em seu amplo espectro de atividade antibacteriana. O mecanismo de ação do fármaco consiste na ligação deste com a enzima ADN-girase da bactéria, permitindo sua ligação à bactéria ativa e a obtenção de imagens devido a fótons emitidos pelo 99mTc. Tendo em vista que o local de formação do complexo envolve os mesmos grupos funcionais responsáveis pela ligação do fármaco à enzima, sua eficácia pode ser prejudicada. A diferenciação entre processos infecciosos e inflamatórios representa um grande desafio na área de diagnóstico. A complexação do antimicrobiano ciprofloxacino (CIP) com o tecnécio (99mTc-CIP) vem sendo estudada com objetivo de desenvolver um radiofármaco com alta especificidade no diagnóstico de infecções, baseado em seu amplo espectro de atividade antibacteriana. O mecanismo de ação do fármaco consiste na ligação deste com a enzima ADN-girase da bactéria, permitindo sua ligação à bactéria ativa e a obtenção de imagens devido a fótons emitidos pelo 99mTc. Tendo em vista que o local de formação do complexo envolve os mesmos grupos funcionais responsáveis pela ligação do fármaco à enzima, sua eficácia pode ser prejudicada. O objetivo deste trabalho foi avaliar as condições ideais para ligação do 99mTc a duas quinolonas (CIP e pefloxacino), utilizando diferentes agentes redutores (SnCl2 e FSA), pH da solução e temperatura de incubação. A complexação dos fármacos ao radioisótopo 99mTc foi avaliada através do controle radioquímico, utilizando cromatografia em camada delgada. Posteriormente, testou-se sua atividade antimicrobiana in vitro utilizando diferentes microorganismos. O agente redutor FSA não foi eficiente na formação do complexo, resultando em uma concentração alta de Tc livre (37%). A formulação com Sn aumentou a formação de colóide com aquecimento (100 ºC). A complexação dos antimicrobianos ao Tc impediu sua ligação à ADN-girase. A taxa de ligação variou de 10% (filtração) a 16% (centrigugação). Além disso, verificou-se boa correlação entre a formação de colóide e quantidade de radiação ligada à bactéria em ambos os testes. Esta perda de atividade vem de encontro a alguns estudos clínicos relatados na literatura, que revelam a não diferenciação entre processos infecciosos e processos inflamatórios pelas quinolonas marcadas com 99mTc. / Differentiation between inflammation and infection represents a major challenge in clinical diagnostics. Several studies using ciprofloxacin (CIP), a broad spectrum antimicrobial agent, complexed with technetium (99mTc) have been reported in order to evaluate its capacity to diagnose infections. CIP mechanism of action involves its binding with bacterial DNA-gyrase during the growth phase and the acquisition of images due to 99mTc radioactivity. The fact that the sites of complexation are the same as those involved in bacterial binding it may affect its antimicrobial activity. The objective of the present work was to evaluate the ideal conditions for the complexation of CIP and pefloxacin with 99mTc using stannous chloride and formamidinesulfinic acid (FSA) as reducing agents, different pH and temperatures. The efficiency of complexation was monitored using radiochemical control as well as thin layer chromatography. Furthermore the antimicrobial activity of both complexes was evaluated in vitro. FSA was not adequate as a reducing agent and SnCl2 was better at room temperature than using heat (100 oC). The complexes did not bound well to the bacterias with binding efficiencies ranging from 10 (filtration method) to 16% (centrifugation method). Besides that, a good correlation between colloid formation (impurity) and radioactivity bound to bacterias was found. This decrease in bacterial activity was previously reported in some articles suggesting that quinolones complexed with 99mTc are not suitable to diagnose infections in the presence of inflammation.