Les Sémaphorines constituent une grande famille de protéines sécrétées et membranaires, qui ont été initialement impliquées dans le guidage axonal au cours du développement du système nerveux, mais qui jouent aussi un rôle important dans la cancérogenèse. Ainsi, les Sémaphorines agissent via leurs récepteurs, qui font partie de la famille des Neuropilines et des Plexines, pour réguler des fonctions multiples qui contribuent au développement des cancers et à la progression métastatique, telles que l'adhésion cellulaire, la motilité, la survie, l'angiogenèse et la réponse immunitaire. Mon travail de thèse a visé à mieux comprendre le rôle de la signalisation induite par la Sémaphorine-3E (Sema3E) et son récepteur Plexine-D1 dans le cancer du sein. Il a été proposé récemment, que la signalisation autocrine induite par le couple Sema3E/Pleixne-D1 dans les cellules tumorales, favorise l’apparition de métastases via l’augmentation de leurs capacités de migration et d’intravasation/extravasation.Dans ce travail de recherche, nous avons trouvé qu’une nouvelle signalisation autocrine induite par Sema3E/Plexine-D1 régit à la fois la tumorigenèse et la formation de métastases. Ainsi, la sécrétion de Sema3E par les cellules tumorales favorise leur survie grâce à l’inhibition d’une voie de mort induite par le récepteur à dépendance Plexine-D1. Bloquer l’interaction entre Sema3E et son récepteur Plexine-D1, via l’utilisation d’un ligand TRAP dans des modèles murins de cancer du sein, permet de tuer spécifiquement les cellules tumorales et exerce une action anti-tumorale et anti-métastatique. Des données préliminaires sur la voie de mort induite par le récepteur Plexine-D1, suggèrent un rôle important du clivage de son domaine intracellulaire par les Caspases et/ou une translocation nucléaire. Ensemble, ces résultats indiquent que l’expression de Sema3E dans les cancers du sein chez la femme, permet un avantage sélectif pour la survie des cellules tumorales. Bloquer l’interaction entre Sema3E/Plexine-D1 apparaît donc comme une stratégie thérapeutique prometteuse pour traiter ces cancers. De plus, ces données permettent une nouvelle approche dans l’étude des fonctions du couple Sema3E/Plexine-D1 dans d’autres contextes physiologiques et pathologiques. / The Semaphorins constitute a large family of secreted and membrane-bound proteins, which have initially been implicated in axon guidance during development of the nervous system, but also have an important role in cancer. Semaphorins signal through Neuropilin and Plexin receptors to regulate multiple functions contributing to cancer development and progression, including cell adhesion and motility, cell survival, angiogenesis and immune response. My work is aimed at better understanding the role of the secreted glycoprotein Semaphorin 3E (Sema3E) and its binding receptor PlexinD1 in breast cancer. It has been recently proposed that Sema3E/PlexinD1 autocrine signaling in tumor cells promotes metastasis by enhancing cancer cell migration and intravasation/extravasion steps. Here we found another mechanism by which Sema3E/PlexinD1 autocrine signaling regulates both tumorigenesis and metastasis. We show that release of Sema3E by tumor cells promoted their survival through inhibition of an endogenous cell death pathway triggered by the unbound PlexinD1 “dependence receptor”. Interrupting Sema3E/PlexinD1 binding using a ligand-TRAP for PlexinD1 receptor specifically increased tumor cell death and exerted anti-tumoral and anti-metastatic activities in animal models of breast cancers. Preliminary investigations of the underlying cell death pathway suggested a crucial role of PlexinD1 intracellular domain via its cleavage by caspases or its possible translocation to the nucleus. Together, the results indicate that up-regulation of Sema3E in human breast cancers provides a selective advantage for tumor cell survival and that antagonizing Sema3E binding to PlexinD1 may represent a promising therapeutic strategy. Moreover, these data may provide new insight into the functions of Sema3E/PlexinD1 in other physiological and pathological contexts.

Les récepteurs membranaires sont des acteurs majeurs des interactions entre la cellule et son environnement. Ils peuvent être à l'origine des signaux de survie, de différentiation, de migration ou bien de mort cellulaire. Les travaux de ce manuscrit ont été faits sur une famille de récepteurs nommés "récepteurs à dépendance". Ils sont caractérisés par leur fonctionnement dans la cellule plutôt que par leur structure: en présence de leurs ligands ces récepteurs induisent un signal de survie et en l'absence de ces mêmes ligands ils induisent un signal actif de mort cellulaire. Deux nouveaux récepteurs à dépendance ont été étudiés: Notch3 et Kremen1 dans le contexte du contrôle de l'homéostasie et plus particulièrement dans le contrôle de la tumorigenèse du cancer du sein. Nous montrons que le récepteur à dépendance Notch3 est perdu dans le cancer du sein, dû à un gain significatif de méthylation, entre le tissu normal et le tissu tumoral dans les patients. Notch3 a également un rôle pro-apoptotique dans les cellules endothéliales dans le cancer du poumon. Des études effectuées sur des cohortes de cancer nous ont permis de voir que le ligand Dickkopf1 (Dkk1), qui lie le récepteur Kremen1, est sur-exprimé dans plusieurs cancers tandis que le récepteur il est perdu dans les cancers. Rétablir l'expression de Kremen1 ou invalider Dkk1 dans la lignée de cancer du sein de type basal MDA-MB 231 conduit à une forte mort cellulaire de type autophagique. En ce qui concerne les enjeux thérapeutiques de ces travaux, nous avons pu sélectionner plusieurs anticorps dirigés contre le domaine extracellulaire de Kremen1, qui induisent la mort des cellules cancéreuses / Membrane receptors are major actors of the interaction between a cell and its environment. They are able to trigger different types of signals such as survival, differentiation, migration or cell death. The work presented in this manuscript has been done on a particular family of receptors called dependence receptors. They are characterized by their function rather than by their structure. In the presence of their ligand they induce a survival signal whereas in the absence of the ligand they induce an active signal of cell death. Two new dependence receptors have been studied: Notch3 and Kremen1, in the context of homeostasis control, and more particularly in the control of breast cancer tumorigenesis. We show that Notch3 dependence receptor is lost in breast cancer, because of a significant gain of methylation observed between the normal tissu and the tumoral tissue within the same patient. Notch3 plays also a pro-apoptotic role in endothelial cells of lung cancer. Experiences carried on cancer cohorts have allowed us to notice that the Dickkopf (Dkk1) ligand, which links the Kremen1 receptor, is over-expressed in several cancers whereas the receptor is lost in different cancers. Restoring Kremen1 expression or disabling Dkk1 in breast cancer basal type MDA-MB 231 cells, leads to large autophagic cell death. Concerning therapeutic approaches, we selected several antibodies against Kremen1 extra-cellular domain, which induce the death of cancer cells

La pluripotence est la capacité d'une cellule à s'auto-renouveler et à donner toutes les cellules somatiques ainsi que les cellules germinales. Les cellules pluripotentes peuvent être aussi reprogrammées à partir de cellules somatiques, ouvrant ainsi de nouvelles opportunités pour l'utilisation thérapeutique des cellules souches dans le traitement des maladies dégénératives. La connaissance des mécanismes moléculaires, en particulier des voix de signalisation qui contrôlent la pluripotence, est cruciale pour l'amélioration de notre compréhension de l'embryogenèse précoce et l'utilisation des iPSC (cellules souches pluripotentes induites) dans la médicine régénérative. Ici, je donne la première description de la Nétrine-1 en tant que régulateur de la reprogrammation et de la pluripotence. La Nétrine-1 et ses récepteurs ont été initialement caractérisés dans le système neuronal, mais il a aussi été montré qu'ils étaient exprimés dans différents types cellulaires et impliqués dans divers processus. Dans la première partie, j'ai contribué à explorer comment Nétrine-1 empêche l'apoptose médiée par son récepteur à dépendance DCC (Deleted in Colon Carcinoma) pendant la reprogrammation. Dans la deuxième partie, j'ai disséqué les fonctions et la régulation de cette voie dans le maintien de la pluripotence et dans l'engagement des lignages / Pluripotency is the ability of embryonic epiblast cells to self-renew and to give rise to all somatic cells as well as germ cells. Somatic cells can also be reprogrammed toward pluripotency, opening new avenues for stem cell based therapies in the treatment of degenerative diseases. Deciphering the molecular mechanisms, and in particular signaling pathways that control pluripotency is crucial to improve our understanding of early embryogenesis and the use of iPSC (inducible Pluripotent Stem Cell) in regenerative medicine.Herein, I provide the first description of Netrin-1 as a regulator of reprogramming and pluripotency. Netrin-1 and its receptors are present in many cell types and are engaged in a variety of cellular processes beyond its initial characterization in the neuronal system. In the first part, I contributed to explore how Netrin-1 prevents apoptosis mediated by its dependence receptor DCC (Deleted in Colon Carcinoma) during reprogramming. In the second part, I dissected the functions and regulation of this pathway in pluripotency maintenance and in lineage commitment

La voie de signalisation Notch est une signalisation fortement conservée chez les metazoans. Elle régule nombreux processus biologiques, y compris le développement embryonnaire, l'homéostasie tissulaire en particulier dans la décision du destin cellulaire. Largement décrit dans la tumeurigénèse, la voie Notch est aussi un régulateur clé dans l'angiogenèse. De plus en plus d'études montrent que la voie Notch joue un rôle important dans régulation d'angiogenèse tumorale. Par conséquent, divers d'efforts ont été faits pour inhiber la voie canonique de Notch. Jusqu'à aujourd'hui, appart Notch1, d'autre récepteurs Notch ont été très peu étudiés dans l'angiogenèse tumorale. Notch3 exprimé restreint dans le systèm vasculaire, n'a jamais été étudié dans le contexte de l'angiogenès tumorale. Par consequent, l'objectif de ma thèse est d'étudier le rôle de Notch3 dans l'angiogenès tumorale. Ici, nous avons montré une expression abérrant de Notch3 dans les cellules endotheliales tumorales où il présente un effect inattendu. En inhibant Noth3 dans le microenvironnement de la tumeur, nous avons montré que Notch3 limite l'angiogenèse tumorale par sa fonction pro-apoptotique dans les cellules endothéliales tumorales, ce qui entraîne une inhibition de la croissance tumorale. De plus, nous avons constaté que l'expression de JAG1 ont été argumenté dans une fraction des cancers humains. En outre, JAG1 dérivé de la tumeur favorise la survie des cellules endothéliales tumorales en inhibant l'effet pro-apoptotique de Notch3. Nous présentons ici pour la première fois que Notch3 est un récepteur de dépendance induisant une apoptose dans les cellules endothéliales tumorales qui est bloqué par JAG1. Par conséquent, nous montrons que l'effet antitumoral bien documenté médié par l'inhibition de la ?-sécrétase dépend au moins en partie de l'apoptose induite par Notch3 dans les cellules endothéliales / The Notch signalling is a highly conserved signalling which mediates numerous of biological processes, including embryonic development, tissue homeostasis especially in the cell fate decision. Widely implicating in tumorigenesis, the Notch signalling is also a key regulator of angiogenesis. Increasing number of studies showed that, the Notch signalling plays an important role in mediating tumour angiogenesis. Therefore, various efforts have been made to inhibit the canonical Notch pathway. To date, besides Notch1, other Notch receptors were few studied in tumour angiogenesis. Notch3, expressed restrictedly in vascular system, has never been studied in the tumour angiogenesis context. Therefore, the objective of my thesis is to study the role of Notch3 during tumour angiogenesis. Here, we showed that Notch3 is aberrantly expressed in tumour endothelial cells where it presents an unexpected pro-apoptotic effect. By silencing Noth3 in the tumour microenvironment, we showed that Notch3 limits tumour angiogenesis via its pro-apoptotic function in tumour endothelial cells which results in inhibition of tumour growth. In addition, we found that JAG1 is up-regulated in a fraction of human cancers. Furthermore, tumour derived JAG1 favourite the survival of tumour endothelial cells by inhibiting the pro-apoptotic effect of Notch3. We thus present here for the first time that Notch3 as a dependence receptor inducing apoptosis in tumour endothelial cells which is blocked by JAG1. Consequently, we show that the well-documented anti-tumour effect mediated by g-secretase inhibition is at least in part dependent on the apoptosis triggered by Notch3 in endothelial cells

Les récepteurs à dépendance ont la particularité d’induire deux signalisations différentes en fonction de la disponibilité de leur ligand. En présence de leur ligand, ils initient une signalisation positive favorisant notamment la survie cellulaire tandis qu’en leur absence, ils induisent la mort de la cellule par apoptose. Ils créent donc un état de dépendance de la cellule vis-à-vis du ligand pour survivre. Cette dualité fonctionnelle leur confère un rôle central dans le maintien de l’homéostasie tissulaire chez l’adulte et particulièrement dans l’intestin et le colon. En ce sens, l’apoptose induite par les récepteurs à dépendance serait un mécanisme de sauvegarde limitant l’échappement tumoral en permettant l’élimination des cellules proliférant ou migrant dans un environnement dépourvu d’une quantité suffisante de ligand. Un avantage sélectif potentiel pour une cellule tumorale serait donc de perdre cette induction de la mort cellulaire, soit via l’altération des récepteurs soit via un gain excessif d’expression du ligand. Ainsi, les travaux présentés montrent qu’un gain d’expression du ligand netrine-1 par la cellule tumorale elle-même caractérisée une fraction des tumeurs colorectales dérivées de pathologies inflammatoires chroniques et que la perte de l’expression des récepteurs à dépendance fixant la nétrine- 1 est observée dans le reste des cancers colorectaux. En particulier, nous avons montré que l’expression du gène qui code pour le récepteur de la netrin-1 UNC5C est altérée par méthylation dans 70% des cancers colorectaux, et que ce gène comporte également des mutations ponctuelles germinales dans des formes familiales de cancer colorectal, chez lesquels aucune autre mutation n’avait été décrite. Nous avons ainsi montré que les récepteurs à dépendance agissent comme des suppresseurs de tumeur conditionnels à l’absence de nétrine-1 et que l’altération de leur signalisation apoptotique constitue un avantage sélectif qui favorise la progression des cancers colorectaux / Dependence receptors share the common property of inducing two types of signaling according to their ligand availability. In the presence of their ligand, they induce a positive signal allowing cell survival whereas in its absence, they induce cell death by apoptosis. These receptors thus create cellular states of dependence on the ligands. Dependence receptors dual functionality plays a major role both during the embryonic development and in the regulation of tissue homeostasis in adult, particularly in intestine and colon. Indeed, apoptosis induced by dependence receptors would be a safeguard mechanism that restricts tumor escape by eliminating cells that would proliferate or migrate in settings of limited ligand availability. A potential selective advantage for a tumor cell would then be to loose this apoptotic signaling, either through a loss of the receptor apoptotic function or through an autocrine gain of the ligand expression. We show here than an over-expression of the ligand netrin-1 by a tumoral cell characterize a fraction of colorectal tumor derived from chronic inflammatory pathology, while the others tumors have lost the expression of netrin-1 dependence receptors. In particular, we have shown that the expression of UNC5C gene is down-regulated due to methylation of the promoter in 70% of cases, and different variants of the gene are associated with a familial form of colorectal cancer. Dependence receptors behave as conditional tumor suppressors in absence of their ligand, and the alteration of their apoptotic signaling is a selective advantage for tumoral cells and favors cancer progression

Le récepteur Patched-1 (Ptc1), le principal récepteur au morphogène Sonic Hedgehog (Shh) a été décrit comme faisant partie de la famille fonctionnelle des récepteurs à dépendance. Ces récepteurs ont la particularité d’induire deux types de signalisation en fonction de la disponibilité en ligand. En présence de leur ligand, ils initient une signalisation positive telle que la survie ou la différenciation des cellules alors qu’en absence de leur ligand, ces récepteurs ne restent pas inactifs ; ils induisent la mort de la cellule par apoptose. Ainsi, les cellules exprimant ces récepteurs sont donc dépendantes de la présence de leur ligand pour leur survie. L’étude de la voie pro-apoptotique induite par le récepteur à dépendance Ptc1 a conduit à l’identification d’un complexe d’activation des caspases, « le dépendosome », composé des protéines DRAL, TUCAN et de la caspase9. Plus récemment, un crible double hybride nous a permis d’identifier Nedd4-1, une ubiquitine E3 ligase, et de mettre en évidence que Nedd4-1 interagit avec Ptc1 et le « dépendosome » en absence de Shh. Nous avons également montré que Nedd4-1 est impliqué dans la voie de signalisation proapoptotique induite par Ptc1 en activant directement la caspase9 par sa polyubiquitination. Ainsi, tout en élucidant les mécanismes d’induction de mort par le récepteur Ptc1, notre étude a permis de mettre en évidence un nouveau mécanisme d’activation de la caspase9. Par ailleurs, il est connu que le ligand Shh est surexprimé dans de nombreux cancers. Le récepteur Ptc1, quant à lui, a été décrit comme gène suppresseur de tumeur. Ainsi, notre hypothèse est que le couple Shh/Ptc1 serait impliqué dans la tumorigenèse en contrôlant la balance survie/mort des cellules. Nous avons donc cherché à savoir si la mort induite par Ptc1 permettrait une régression tumorale, in vivo. Ainsi, grâce à des modèles de xénogreffes, nous avons mis en évidence que l’interférence avec la boucle autocrine de Shh ralentie la progression tumorale par l’induction de la voie pro-apoptotique de Ptc1. Ces résultats montrent donc l’importance du contrôle apoptotique exercé par le couple Shh/Ptc1 dans l’échappement tumoral et pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies anti-tumorales ciblant spécifiquement Shh / Patched-1 (Ptc1) receptor, the main receptor of the morphogen Sonic Hedgehog (Shh) belongs to the dependence receptors family. These receptors are able to induce two opposite signaling pathways depending on the availability of their ligand. Indeed in the presence of its ligand, a dependence receptor induces a positive signaling cascade such as cell survival or differentiation whereas in the absence of its ligand, it triggers apoptotic cell death. Thus, cells that express these receptors are dependent of the presence of their ligands for their survival. The study of the Ptc1 pro-apoptotic pathway has allowed the identification of a caspases activating complex, called “dependosome”, and formed by DRAL, TUCAN and caspase9. More recently, we identified in a two-hybrid screen Nedd4-1, an E3 ubiquitin ligase. We have shown that Nedd4-1 interacts with Ptc1 and the “dependosome” in the absence of Shh. Moreover, we have observed that Nedd4-1 is required for Ptc1 proapoptotic pathway and that Nedd4-1 activates directly the caspase9 through its polyubiquitination. Thus, as we are starting to better understand the mechanism of cell death induction by the dependence receptor Ptc1, our study also allowed us to identify a new mechanism for caspase9 activation. Besides, it is known that Shh is overexpressed in several cancers. In addition, Ptc1 receptor has been described as a tumor suppressor gene. Thus, we raised the hypothesis that the couple Shh/Ptc1 could be involved in tumorigenesis by controlling the balance between cell survival and cell death. We investigated whether Ptc1-induced cell death could lead to tumor regression in vivo. Thanks to xenograft models we have shown that interfering with Shh autocrine loop inhibits tumor growth in a Ptc1-induced cell death dependent manner. These results highlight the importance of the apoptotic control exerted by the couple Shh/Ptc1 in tumoral escape and could provide novel insights in current anti-cancer drug development based on Shhtargeting