Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie autoimmune médiée par les cellules T caractérisée par l'infiltration de leucocytes inflammatoires dans le système nerveux central (SNC) aboutissant à la destruction de la gaine de myéline. Des rémissions cliniques sont fréquemment observées lors de la grossesse chez des patientes atteintes de SEP suggérant que les hormones, particulièrement les œstrogènes, pourraient jouer un rôle protecteur. En effet, l'administration d'œstrogènes (17beta-œstradiol, E2) inhibe l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE) chez la souris, le modèle animal de la SEP. Par l'utilisation de souris KO conditionnelles pour REalpha dans différentes cellules du système immunitaire, notre équipe a précédemment montré que l'inhibition de l'EAE par l'E2 était associée à une suppression de l'activation des cellules Th1 et Th17 encéphalitogènes et que cet effet était dépendant de l'expression de RE? dans les lymphocytes T. Les objectifs de ma thèse ont été d'identifier les cellules T impliquées dans l'effet protecteur de l'E2 dans l'EAE et de disséquer les mécanismes sous-jacents. Nous avons mis en évidence que de fortes doses d'E2 in vivo inhibait sélectivement la différenciation des cellules T 2D2, possédant un TCR spécifique du peptide MOG, en lymphocytes Th1 et Th17 suite à leur transfert chez des souris receveuses. En utilisant des cellules T 2D2 déficientes pour REalpha, nous avons pu mettre en évidence que l'expression de REalpha par les cellules T CD4+ spécifiques de MOG n'était pas nécessaire à l'action inhibitrice de l'E2. Ces résultats suggéraient que l'activation intrinsèque de la voie de signalisation E2/RE? dans les cellules T spécifiques de l'antigène n'avait pas d'impact sur leur différenciation en cellules T effectrices. Nous avons confirmé ces résultats par des expériences effectuées in vitro, montrant que la sensibilisation des cellules T naïves à l'E2 in vivo et in vitro n'affectait pas leur capacité à se différencier en cellules Th1, Th2, Th17 ou Treg. De plus, nous avons mis en évidence que l'E2 via REalpha agissait sur les cellules T CD4+ endogènes pour inhiber le développement des réponses Th1 et Th17 inflammatoires par un mécanisme de suppression en trans. Ensuite, nous avons montré par un modèle de transfert adoptif que les cellules T REalpha+/+, mais pas REalphaKO, sensibilisées à l'E2 conféraient une protection contre l'EAE lorsqu'elles étaient transférées avec les cellules T 2D2 naïves REalphaKO dans des souris receveuses Rag2KO REalphaKO immunisées avec MOG. De plus, en utilisant des souris déficientes pour RE? sélectivement dans les Treg Foxp3+, nous avons démontré que l'action protectrice des cellules T CD4+ bystander sensibilisées à l'E2 était non seulement maintenue mais augmentée en comparaison aux cellules contrôles exprimant RE?. Ces résultats ont donc permis de mettre en évidence que l'E2 agissait sur les cellules T CD4+ Foxp3neg pour restreindre la différenciation des cellules T encéphalitogènes en lymphocytes Th17 en trans et ainsi inhiber le développement de l'EAE. / Multiple sclerosis (MS) is a T-cell mediated autoimmune disease characterized by the inflammatory leukocytes infiltration into central nervous system (CNS) resulting in myelin damages. Clinical remissions in MS patients are frequently observed during pregnancy suggesting that steroid hormones, particularly estrogens, could be protective. Indeed, administration of estrogens (17beta-œstradiol, E2) inhibits experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice, the animal model of MS. Using ERalpha conditional KO mice, our group has shown previously that E2-mediated inhibition of EAE was associated with suppression of encephalitogenic Th1 and Th17 cell activation and that this effect required ERalpha expression in T cells. The objectives of my thesis aimed to identify the T cells implicated in E2 protective effect on EAE and to dissect the underlying mechanisms. We highlighted that pharmacological doses of E2 in vivo selectively inhibited MOG specific TCR 2D2 T cells differentiation into Th1 and Th17 lymphocytes following their transfer into recipient mice. Using ERalpha deficient 2D2 T cells, we have showed that ERalpha expression in MOG specific CD4+ T cells was not required for the E2 inhibitory action. These results suggested that intrinsic activation of E2/ERalpha signaling in antigen specific T cells didn't impact their differentiation into effector T cells. We confirmed these results by in vitro experiment, showing that in vitro and in vivo E2 treatment of naïve T cells didn't affect their differentiation capacity into Th1, Th2, Th17 or iTreg cells. Moreover, we highlighted that E2 acted through ER? in endogenous CD4+ T cells to inhibit inflammatory Th1 and Th17 responses by a suppressive mechanism in trans. Then, we have shown using an adoptive transfer model that E2 primed ER?+/+, but not ERalphaKO, CD4+ T cells conferred substantial protection against EAE when transferred together with 2D2 ERalphaKO transgenic T cells into naïve RagKO recipients lacking ERalpha prior to MOG immunization. Futhermore, using mice selectively lacking ERalpha in Foxp3+ Treg, we have demonstrated that E2-primed CD4+ T cell protective action was not only maintained but increased in comparison to ERalpha+/+ T cells. These results allowed us to conclude that E2 acts on CD4+ Foxp3neg T cells to restrict encephalitogenic Th17 cell differentiation in trans and inhibit EAE development.

Première cause de décès par cancer chez la femme, le cancer du sein développe souvent une résistance à la chimiothérapie pouvant impliquer des transporteurs ABC (ATP Binding Cassette). Ils transportent les médicaments hors de la cellule et diminuent leur efficacité thérapeutique. Nous nous sommes intéressés à la protéine ABCC11 ou MRP8 (Multidrug Resistance Protein 8), exprimée dans le sein et responsable de l'efflux de certains anticancéreux (5FdUMP et méthotrexate). Nous avons démontré que l'expression d'ABCC11 était dépendante des voies de signalisation impliquant ER (Récepteur aux œstrogènes) ou PR (Récepteurs à la Progestérone). De plus, le tamoxifène (antagoniste d'ER) et la dexaméthasone (activateur de PR), utilisés en association avec la chimiothérapie, induisent l'expression d'ABCC11 et influenceraient négativement la réponse aux traitements anticancéreux à base de substrats d'ABCC11. L'expression d'ABCC11 a été positivement corrélée à celles d'ER et PR dans des cancers du sein. En parallèle, nous avons généré 2 modèles in silico en conformation ouverte vers l'intracellulaire ou vers l'extracellulaire et identifier des acides aminés potentiellement critiques dans l'architecture de la protéine ainsi que dans la liaison avec certains substrats (5FdUMP et GMPc). Nous avons également généré les outils moléculaires permettant l'étude de l'impact de 13 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) non synonymes d'ABCC11. En raison d'une instabilité des lignées cellulaires, l'étude n'a pu être menée à son terme. Notre travail a ainsi contribué à une meilleure caractérisation d'ABCC11 et souligne sa potentielle valeur pronostic et prédictive dans le traitement du cancer du sein.

Des études épidémiologiques ont démontré que l’exposition aux pesticides tels que le chlordécone augmente le risque du cancer, en particulier de la prostate. Il avait été précédemment montré au laboratoire que le chlordécone possède des propriétés pro-angiogéniques impliquant la libération de NO et la production de VEGF suite à l’activation du récepteur aux oestrogènes de type alpha (ERα). Les processus angiogéniques pouvant impliquer les espèces réactives de l’oxygène (EROs), produites notamment par la mitochondrie, l’objectif de ce travail a été d’évaluer la contribution de la biogenèse mitochondriale et du stress oxydatif dans l’angiogenèse induite par le chlordécone.Les résultats obtenus montrent que la biogenèse mitochondriale n’est pas essentielle pour la réponse angiogénique du chlordécone puisqu’elle n’est retrouvée que pour de forte concentration de chlordécone. Les mécanismes mis en jeu ont été identifiés au niveau des cellules endothéliales humaines. Ils impliquent une régulation spatio temporellede la production des EROs impliquant dans un premier temps la NADPH oxydase, elle même capable de stimuler la production mitochondriale d’EROs via la voie impliquant la NO synthase. Le chlordécone serait par ailleurs capable de favoriser la localisation périnucléaire des EROs afin de favoriser la production de VEGF. L’ensemble de ces effets implique le récepteur aux oestrogènes. Ce travail a donc permis d’identifier les mécanismes cellulaires impliqués dans la modulation de l’angiogenèse par le chlordécone. Ces mécanismes moléculaires pourraient contribuer à identifier de nouvelles cibles permettant de réguler les processus angiogéniques et la tumorigenèse induites par ce toxique. / Epidemiological studies report that exposure to pesticides like chlordecone increases risk of prostate cancer and tumorigenesis. We have reported recently that the pro-angiogenic effect of chlordecone involving NO release and VEGF production is mediated through activation of α isoform of the estrogen receptor (ERα). Since mitochondria and ROS have been implicated inthe process of angiogenesis, this study aims to determine the contribution of mitochondrial biogenesisand oxidative stress in chlordecone-induce dangiogenesis. Firstly, our results indicate that mitochondrial biogenesis is not essential for chlordecone angiogenic response. We also identified the molecular mechanism involved; chlordecone induces endothelial cells angiogenesis by a spatiotemporal regulation of ROS production involving NADPH oxidase then mitochondrial O2 -via a NO sensitive pathways through activation of ERα.These findings propose that a molecular mechanism may partly explain the epidemiological evidence implicating chlordecone as risk factor of prostatic cancer.

Le cancer du sein est le cancer qui a la plus forte fréquence au Canada. En 2012, on estime que 23 200 nouveaux cas de cancer du sein seront diagnostiqués. Deux tiers des tumeurs mammaires expriment ou surexpriment le récepteur des oestrogènes α (ERα). De même, les oestrogènes sont importants pour la croissance de ces tumeurs. La présence des récepteurs hormonaux est un critère qui détermine le choix de la thérapie; à cet égard, le ciblage des récepteurs des oestrogènes par les antioestrogènes a pour but d’inactiver ces récepteurs et diminuer leur contribution à la croissance tumorale. Les antioestrogènes sont des inhibiteurs compétitifs de ERα. Tamoxifene est le médicament le plus utilisé pour traiter les tumeurs mammaires ER+ de tous les stades, avant ou après la ménopause. Tamoxifene est antioestrogène partiel ou SERM qui a un profile mixte d’activités agonistes et antagonistes. Fulvestrant ou ICI 182, 780 est un antioestrogène de type total ou SERD dépourvu de toute activité agoniste. Ce composé est utilisé en clinique chez les femmes après la ménopause ayant des tumeurs mammaires avancées. Fulvestrant constitue, donc, une deuxième ligne thérapeutique en cas de rechute après à un traitement par Tamoxifene. Afin de comprendre le potentiel thérapeutique de Fulvestrant, il est primordial d’étudier son impact sur ERα. Actuellement, la polyubiquitination et la dégradation de ERα sont les mécanismes les plus connus pour expliquer l’inactivation de ERα par Fulvestrant. Par ailleurs, en utilisant des modèles cellulaires ER+ et ER-; nous avons montré que les antioestrogènes totaux induisent une insolubilité de ERα indépendamment de leur capacité à induire sa dégradation. L’insolubilité corrèle avec l’association de ERα avec la matrice nucléaire et avec l’inhibition de sa transactivation. L’hélice H12 du domaine de liaison du ligand joue un rôle important dans l’insolubilité et l’inactivation de ERα par les antioestrogènes totaux. Par ailleurs, les antioestrogènes totaux se distinguent par leur capacité à induire la SUMOylation de ERα par SUMO1 et SUMO2/3. La SUMOylation est rapide et précède la dégradation de ERα dans cellules ER+. À l’aide de dérivés de l’antioestrogène total ICI 164, 384, nous avons montré que la chaine latérale des antioestrogènes totaux est à la base de l’induction de la SUMOylation et de l’inactivation de ERα. De plus, la SUMOylation semble être une marque d’inhibition, car la déSUMOylation restaure une activité de ERα en présence des antioestrogènes totaux. L’hélice H12 du LBD et le domaine de liaison à l’ADN sont requis pour l’induction de la SUMOylation. La recherche de protéines impliquées dans l’inactivation et dans la SUMOylation a permis d’identifier le facteur de remodelage de la chromatine ACF dans le même complexe que ERα. De manière similaire à la SUMOylation, le recrutement de ACF est précoce et constitue une propriété spécifique des antioestrogènes totaux. D’autre part, Fulvestrant induit le recrutement de ACF au niveau du promoteur du gène cible des oestrogènes pS2, ce qui suggère une contribution du remodelage de la chromatine dans les mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. La surexpression de la DéSUMOylase SENP1 abolit le recrutement de ACF ce qui indique un rôle de la SUMOylation dans le recrutement de ACF. De même, l’hélice H12 du LBD de ERα constitue un lien entre l’inactivation de ERα et le recrutement de ACF. L’insolubilité, la SUMOylation et l'interaction du complexe ACF sont le reflet des mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. Ces observations peuvent être utilisées comme des critères fonctionnels pour identifier d’autres composés avec de meilleures propriétés pharmacologiques que Fulvestrant. / Approximately 70% of breast tumors express or overexpress estrogen receptor alpha (ERα) and are treated with antiestrogens (AEs), which act as competitive inhibitors of this receptor. Tamoxifen has been widely used for the treatment of ERα-positive tumors, but intrinsic or acquired resistance can lead to tumor recurrence. Full AEs such as Fulvestrant (ICI182, 780) are currently used to treat postmenopausal women with ERα-positive breast cancers with disease progression following Tamoxifen therapy. Unlike Tamoxifen and other Selective estrogen receptor modulators (SERMs), full AEs (SERDs) are devoid of any agonistic activity. It is currently thought that the capacity of full AEs to induce rapid polyubiquitination and degradation of ERα underlies their complete suppression of ERα signalling. On the one hand, we show a correlation between ICI 182, 780 induced ERα inhibition and its association with the insoluble fraction. This insolubility corresponds to an immobilization within the nuclear matrix and takes place in the absence of an accelerated turn over. The helix 12 in the ligand binding domain is important in the induction of insolubility and inactivation. On the other hand, we identify ERα as a target for Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) posttranslational modification by SUMO1 and SUMO2/3 specifically when liganded with full AEs. Induction of SUMOylation is rapid and precedes receptor degradation in ERα-positive breast cancer cells. On the other hand, the SERMs do not induce SUMOylation. The helix 12 in the ligand binding domain and the DNA binding domain play a role in the induction of SUMOylation in the presence of full AEs. Structure activity relationship experiments with full AE derivatives showed that the induction of SUMOylation is correlated with the degree of inhibition of ERα-mediated transcription. In addition, preventing SUMOylation by overexpression of a SENP1 deSUMOylase abolished the inverse agonist properties of full AEs without increasing activity in the presence of agonists or of Tamoxifen. In our attempt to screen for factors with a possible role in SUMOylation and inactivation, we show that the treatment with SERDs but not SERMs, induces a rapid interaction between ERα and the human ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor (ACF) in ERα-negative and ERα-positive cell lines. The helix 12 is important since introducing single point mutations in this helix lead to an increased solubility and abrogate ACF recruitment. Using ChIP, we find an increase of ACF1 subunit association with proximal promoter of estrogen target gene pS2 suggesting a possible role of ACF in remodeling in this promoter. ACF recruitment is SUMOylation dependant since the overexpression of DeSUMOylase SENP1 abolishes the interaction between ERα and ACF. Together, induction of insolubility, SUMOylation and ACF recruitment are characteristic properties of full antiestrogens that contribute to their specific activity profile. They can be used to screen for new compounds with an improved therapeutic potential.

Les travaux épidémiologiques et expérimentaux effectués à ce jour sur le cancer du sein ont montré que les oestrogènes - comme l’eostradiole (E2) - et leur récépteur (ER) - un facteur de transcription les liants - sont fortement impliqués dans au moins 70% des cas de cancer du sein. Cette implication est d’autant plus visible que les patients, suite à une thérapie anti-oestrogénique, ont tendance à développer une résistance endocrinienne au traitement. Pendant longtemps, l’ER a été étudié en tant que facteur indépendant liant directement une séquence ADN spécifique sur le génome. Aujourd’hui le paradigme a profondément changé. Il est bien connu que ER s’associe avec de nombreux autres facteurs de transcription et protéines régulant la chromatine afin de réguler l’expression des gènes. Cependant, nos connaissances concernant la fonction de modifications épigénétiques suite à l’activation de ER - notamment la méthylation de l’ADN et l’acétylation des histones - sont encore limitées. Dans cette étude, j’ai mis en place un protocole de culture cellulaire adapté à l’étude de la privation et à la re-stimulation d’E2 stricto sensu. Dans un premier temps, ce protocole a été évalué à l’aide de la toute dernière technologie de puce permettant la lecture du méthylome et couvrant la liste complète des éléments amplificateurs. Dans un deuxième temps, j’ai mesuré le transcriptome et les profiles d’acétylation de l’histone H3 (H3K27ac) afin de déterminer la capacité de ER à réguler l’expression des gènes J’ai découvert que, suite à la privation de E2, les niveaux de méthylation de l’ADN et de H3K27ac changent et que ces changements s’accentuent avec le temps, en particulier au niveau des éléments amplificateurs. Une analyse d’enrichissement des facteurs de transcription et des séquences de liaison spécifiques a révélé que les facteurs de transcriptions des familles AP-1 et FOX sont des intermédiaires favorisants la liaison de ER aux éléments amplificateurs. Finalement, la re-stimulation des cellules par de l’E2 a montré que la majorité des changements épigénétiques observé sont réversibles mais que certains éléments amplificateurs restent hyperméthylés et déacétylés. Ceci pourrait indiquer que les traitements anti-oestrogéniques sont efficaces mais pourrait également indiquer un marqueur de résistance endocrinienne. Cette étude apporte des informations nouvelles quant aux effets de l’inhibition et l’activation de ER sur la méthylation de l’ADN et l’acétylation de l’histone H3 à l’échelle du génome et renforce l’importance du rôle d’autres facteurs au niveau des amplificateurs / Previous epidemiological and experimental studies have strongly implicated estrogens in breast cancer risk and Estrogen Receptor (ER), the transcription factor to which estrogen binds, is considered as the major molecular driver of around 70% breast cancers. The importance of the deregulated estrogen signalling is further highlighted by increasing evidence that current chemopreventive and therapeutic strategies that target hormonally responsive breast cancers frequently result in the development of resistance to anti-estrogens and metastatic progression, highlighting the need for understanding the molecular underlying mechanisms. While until recently, ER was believed to act as a stand-alone transcription factor, which can directly bind its motifs in DNA, it is now accepted that ER activity is a complex and dynamic process that requires highly concerted actions of a dozen transcriptional cofactors and various chromatin regulators at DNA. Recent studies focused on characterising ER-associated cofactors and their role in opening the chromatin provided a remarkable insight into transcriptional regulation mediated by ER. However DNA methylation and histone acetylation are poorly understood in the context of ER’s dynamic binding. In this thesis, I combined a cell culture protocol adapted for studying estradiol (E2) deprivation and re-stimulation in stricto sensu in ER-positive breast cancer cells with the latest methylation array, that allowed a genome-wide interrogation of DNA methylation (including a comprehensive panel of enhancers). I further investigated histone acetylation (ChIP-seq) and transcriptome (RNA-seq) after E2 deprivation and re-stimulation to better characterise the ability of ER to coordinate gene regulation. I found that E2 deprivation and re-stimulation result in time-dependent DNA methylation changes and in histone acetylation across diverse genomic regions, many of which overlap with enhancers. Further enrichment analysis of transcription factor (TF) binding and motif occurrence highlights the importance of ER tethering mainly through two partner TF families, AP-1 and FOX, in the proximity of enhancers that are differentially methylated and acetylated. This is the first study that comprehensively characterized DNA methylation at enhancers in response to inhibition and activation of ER signalling. The transcriptome and genome occupancy data further reinforced the notion that ER activity may orchestrate a broad transcriptional programme through regulating a limited panel of critical enhancers. Finally, the E2 re-stimulation experiments revealed that although the majority of the observed epigenetic changes induced by E2 deprivation could be largely reversed when the cells were re-stimulated we show that DNA hypermethylation and H3K27 acetylation at enhancers as well as several gene expression changes are selectively retained. The partial reversibility can be interpreted as a sign of treatment efficiency but also as a mechanism by which ER activity may contribute to endocrine resistance. This study provides entirely new information that constitutes a major advance in our understanding of the events by which ER and its cofactors mediate changes in DNA methylation and chromatin states at enhancers. These findings should open new avenues for studying role of the deregulated estrogen signalling in the mechanism underlying the “roots” of endocrine resistance that commonly develops in response to anti-estrogen therapy

Le contrôle de la prolifération des cellules cancéreuses mammaires est un phénomène complexe. Les oestrogènes jouent un rôle important dans le contrôle de cette prolifération. L'action des oestrogènes se fait via le récepteur des oestrogènes α (REα), un facteur de transcription qui complexé à l'oestradiol, est capable de moduler la transcription de nombreux gènes impliqués dans la prolifération, l'apoptose ou la différentiation cellulaire. L'utilisation d'anti-hormones qui sont des inhibiteurs compétitifs de l'œstradiol bloquent la prolifération des cellules cancéreuses mammaires. Malheureusement les patientes métastatiques traitées par ce type de molécules développent systématiquement une résistance aux thérapies anti-hormonales. Les facteurs de croissance, tels que l'EGF ou l'IGF-I, qui entraînent une activation du REα de manière ligand indépendante pourraient être responsable de l'apparition de ces phénomènes de résistance. L'étude des voies d'activation du REα par ces facteurs de croissance est donc importante. Le facteur de croissance IGF-I participe au contrôle du développement de la glande mammaire pendant l'embryogenèse et il a une activité œstrogène dans les cellules cancéreuses mammaires. Cette activité oestrogène de l'IGF-I requiert l'expression du récepteur des oestrogènes α (REα), mais on ne connaît pas les mécanismes moléculaires mis en jeu. Nous avons démontré que sur un promoteur complexe tel que le promoteur du gène oestrogéno régulé pS2/TFF1, qui contient un site de liaison au REα et un site de liaison au complexe AP1, l'activation transcriptionnelle de ce gène requiert le REα et le complexe AP1. L'ensemble de ces travaux a permis de mettre en évidence un mécanisme d'action original et non conventionnel du REΑ, en absence d'hormone. En présence du facteur de croissance IGF-I, le REα est nécessaire mais pas suffisant pour activer la transcription et le complexe AP1 joue un rôle aussi important que le REα dans l'activation transcriptionnelle du gène pS2/TFF1. Ce complexe AP1, ou les voies conduisant à son activation pourrait donc être des cibles thérapeutique de choix pour le traitement du cancer du sein.

Le cancer du sein est le cancer qui a la plus forte fréquence au Canada. En 2012, on estime que 23 200 nouveaux cas de cancer du sein seront diagnostiqués. Deux tiers des tumeurs mammaires expriment ou surexpriment le récepteur des oestrogènes α (ERα). De même, les oestrogènes sont importants pour la croissance de ces tumeurs. La présence des récepteurs hormonaux est un critère qui détermine le choix de la thérapie; à cet égard, le ciblage des récepteurs des oestrogènes par les antioestrogènes a pour but d’inactiver ces récepteurs et diminuer leur contribution à la croissance tumorale. Les antioestrogènes sont des inhibiteurs compétitifs de ERα. Tamoxifene est le médicament le plus utilisé pour traiter les tumeurs mammaires ER+ de tous les stades, avant ou après la ménopause. Tamoxifene est antioestrogène partiel ou SERM qui a un profile mixte d’activités agonistes et antagonistes. Fulvestrant ou ICI 182, 780 est un antioestrogène de type total ou SERD dépourvu de toute activité agoniste. Ce composé est utilisé en clinique chez les femmes après la ménopause ayant des tumeurs mammaires avancées. Fulvestrant constitue, donc, une deuxième ligne thérapeutique en cas de rechute après à un traitement par Tamoxifene. Afin de comprendre le potentiel thérapeutique de Fulvestrant, il est primordial d’étudier son impact sur ERα. Actuellement, la polyubiquitination et la dégradation de ERα sont les mécanismes les plus connus pour expliquer l’inactivation de ERα par Fulvestrant. Par ailleurs, en utilisant des modèles cellulaires ER+ et ER-; nous avons montré que les antioestrogènes totaux induisent une insolubilité de ERα indépendamment de leur capacité à induire sa dégradation. L’insolubilité corrèle avec l’association de ERα avec la matrice nucléaire et avec l’inhibition de sa transactivation. L’hélice H12 du domaine de liaison du ligand joue un rôle important dans l’insolubilité et l’inactivation de ERα par les antioestrogènes totaux. Par ailleurs, les antioestrogènes totaux se distinguent par leur capacité à induire la SUMOylation de ERα par SUMO1 et SUMO2/3. La SUMOylation est rapide et précède la dégradation de ERα dans cellules ER+. À l’aide de dérivés de l’antioestrogène total ICI 164, 384, nous avons montré que la chaine latérale des antioestrogènes totaux est à la base de l’induction de la SUMOylation et de l’inactivation de ERα. De plus, la SUMOylation semble être une marque d’inhibition, car la déSUMOylation restaure une activité de ERα en présence des antioestrogènes totaux. L’hélice H12 du LBD et le domaine de liaison à l’ADN sont requis pour l’induction de la SUMOylation. La recherche de protéines impliquées dans l’inactivation et dans la SUMOylation a permis d’identifier le facteur de remodelage de la chromatine ACF dans le même complexe que ERα. De manière similaire à la SUMOylation, le recrutement de ACF est précoce et constitue une propriété spécifique des antioestrogènes totaux. D’autre part, Fulvestrant induit le recrutement de ACF au niveau du promoteur du gène cible des oestrogènes pS2, ce qui suggère une contribution du remodelage de la chromatine dans les mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. La surexpression de la DéSUMOylase SENP1 abolit le recrutement de ACF ce qui indique un rôle de la SUMOylation dans le recrutement de ACF. De même, l’hélice H12 du LBD de ERα constitue un lien entre l’inactivation de ERα et le recrutement de ACF. L’insolubilité, la SUMOylation et l'interaction du complexe ACF sont le reflet des mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. Ces observations peuvent être utilisées comme des critères fonctionnels pour identifier d’autres composés avec de meilleures propriétés pharmacologiques que Fulvestrant. / Approximately 70% of breast tumors express or overexpress estrogen receptor alpha (ERα) and are treated with antiestrogens (AEs), which act as competitive inhibitors of this receptor. Tamoxifen has been widely used for the treatment of ERα-positive tumors, but intrinsic or acquired resistance can lead to tumor recurrence. Full AEs such as Fulvestrant (ICI182, 780) are currently used to treat postmenopausal women with ERα-positive breast cancers with disease progression following Tamoxifen therapy. Unlike Tamoxifen and other Selective estrogen receptor modulators (SERMs), full AEs (SERDs) are devoid of any agonistic activity. It is currently thought that the capacity of full AEs to induce rapid polyubiquitination and degradation of ERα underlies their complete suppression of ERα signalling. On the one hand, we show a correlation between ICI 182, 780 induced ERα inhibition and its association with the insoluble fraction. This insolubility corresponds to an immobilization within the nuclear matrix and takes place in the absence of an accelerated turn over. The helix 12 in the ligand binding domain is important in the induction of insolubility and inactivation. On the other hand, we identify ERα as a target for Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO) posttranslational modification by SUMO1 and SUMO2/3 specifically when liganded with full AEs. Induction of SUMOylation is rapid and precedes receptor degradation in ERα-positive breast cancer cells. On the other hand, the SERMs do not induce SUMOylation. The helix 12 in the ligand binding domain and the DNA binding domain play a role in the induction of SUMOylation in the presence of full AEs. Structure activity relationship experiments with full AE derivatives showed that the induction of SUMOylation is correlated with the degree of inhibition of ERα-mediated transcription. In addition, preventing SUMOylation by overexpression of a SENP1 deSUMOylase abolished the inverse agonist properties of full AEs without increasing activity in the presence of agonists or of Tamoxifen. In our attempt to screen for factors with a possible role in SUMOylation and inactivation, we show that the treatment with SERDs but not SERMs, induces a rapid interaction between ERα and the human ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor (ACF) in ERα-negative and ERα-positive cell lines. The helix 12 is important since introducing single point mutations in this helix lead to an increased solubility and abrogate ACF recruitment. Using ChIP, we find an increase of ACF1 subunit association with proximal promoter of estrogen target gene pS2 suggesting a possible role of ACF in remodeling in this promoter. ACF recruitment is SUMOylation dependant since the overexpression of DeSUMOylase SENP1 abolishes the interaction between ERα and ACF. Together, induction of insolubility, SUMOylation and ACF recruitment are characteristic properties of full antiestrogens that contribute to their specific activity profile. They can be used to screen for new compounds with an improved therapeutic potential.

Parallèlement à leur action nucléaire, les œstrogènes exercent également des effets via une signalisation cytoplasmique par des mécanismes pas complètement élucidés. Nous avons mis en évidence la méthylation de ERα (mERα) sur arginine est l’évènement clé de la signalisation non génomique des œstrogènes dans les cellules tumorales mammaires. Cette méthylation entraîne la formation d’un complexe contenant ERα/SRc/PI3K/FAK qui active des cascades de phosphorylation régulant la prolifération cellulaire. La production d’un anticorps spécifique de la forme méthylée a permis de montrer que ERα est hyperméthylé dans 55% des tumeurs mammaires. Afin de comprendre les mécanismes de régulation de la méthylation, nous avons recherché de nouveaux partenaires impliqués dans ce processus. Au cours de ma thèse, j’ai montré que la protéine kinase LKB1 est impliquée dans la signalisation non génomique des œstrogènes. Dans les cellules MCF-7, les œstrogènes entraînent rapidement le recrutement de LKB1 au sein du complexe précédemment décrit. De plus, LKB1 est indispensable à la formation de ce macro complexe ainsi qu’à la phosphorylation de Bad en aval. En effet, par cette action, LKB1 participe au rôle protecteur des œstrogènes contre l’apoptose orchestré par les œstrogènes. De plus, une étude de l’expression de mERα et LKB1, sur une série de tumeurs mammaires, a montré une corrélation significative entre l’expression de ces deux protéines associée à l’envahissement ganglionnaire. Ces résultats révèlent une signification biologique de l’interaction LKB1/mERα, suggérant un rôle oncogénique putatif de LKB1 / Besides its nuclear action, estrogens mediate also cytoplasmic signaling, however the mechanisms are not fully understood. We recently showed that arginine methylation of estrogen receptor alpha (Erα) is required for the recruitment of PI3K and Src, activating downstream kinases. An antibody that specifically recognized Erα dimethylated was generated allowing the detection of Erα hypermethylation in 55% of breast tumors. To decipher the molecular mechanisms that regulate Erα methylation in non genomic pathways, we investigated new partners of the methylated form of Erα (mERα). We identified the tumor suppressor LKB1, a Ser/Thr kinase involved in cell metabolism and cell polarity as a new partner of mERα. To ascribe a biological role to this interaction, we analyzed the protein complexes containing mErα and LKB1. LKB1 is part of the complexe involved in Erα non genomic pathway. LKB1 is essential for Erα methylation and the formation of the macrocomplex Erα/p85/Src suggesting a functional role of LKB1 in Erα methylation and then activation of downstream signaling pathways. Using a phosphospecific antibody microarray, we observed that LKB1 was required for Bad phosphorylation, suggesting its involvement in apoptosis. Indeed, we found that LKB1 participes in the protective role of estrogen against apoptosis. Interestingly, an IHC study on human breast tumors points a correlation between the expression of LKB1 and mErα : their expression is correlated with lymph node metastasis. Altogether, these results reveal biological significance of mErα/LKB1 interaction, suggesting a putative oncogenic role to LKB1