L’étude qui vous est présentée dans ce mémoire est réalisée chez l’organisme Schizosaccharomyces pombe et elle porte sur la caractérisation de la protéine Nab2, une protéine liant les queues poly(A) ainsi que sur son implication dans la régulation génique. Tout d’abord, il faut savoir qu’il existe quatre modes de régulation (transcriptionnel, post-transcriptionnel, traductionnel et post-traductionnel) dans lesquels interviennent différents types de protéines, en particulier des protéines liant les queues poly(A) des ARN, aussi connues sous le nom de PABPs. Ces protéines reconnaissent l’ARN à l’aide de différents domaines de liaison et elles se subdivisent en deux catégories : les PABPs nucléaires ou cytoplasmiques, représentées respectivement par PABPN1 et PABPC1 chez les mammifères. Comprendre la fonction des PABPs revêt un intérêt particulier puisqu’elles sont impliquées à différents stades de la régulation génique. Des maladies ont aussi été associées à deux PABPs nucléaires humaines, PABPN1 et ZC3H14, mais aucune association entre leur fonction réciproque et la maladie n’a pu être établie. Une des façons de comprendre leur rôle est d’étudier celui de leurs orthologues respectifs. Chez la levure à fission, un orthologue de PABPN1 a été caractérisé et il s’agit de Pab2. S. pombe possède cependant une seconde PABP nucléaire, Nab2, qui est caractérisée dans ces travaux. Des méthodes in vivo et in vitro ont été utilisées afin de confirmer le statut de la protéine, à savoir qu’il s’agit bel et bien d’une PABP nucléaire et que celle-ci est non essentielle. L’identification de partenaires protéiques de Nab2 par spectrométrie de masse a aussi permis de relier Nab2 avec des processus de régulation génique tels que l’épissage et la dégradation. Puisque Pab2 est aussi associée à des fonctions en lien avec la dégradation, il est possible de faire un parallèle entre ces deux protéines et de supposer qu’elles interagissent ensemble. La deuxième partie de ces travaux porte donc sur l’étude de la relation fonctionnelle entre Nab2 et Pab2 et elle a permis de montrer un mécanisme de régulation opportuniste basé sur la liaison de la cible ARN par l’une ou l’autre de ces PABPs. En effet, l’étude de la régulation du gène modèle RPL30-2 indique que Nab2 et Pab2 ont des rôles opposés puisqu’ils sont respectivement des régulateurs positifs et négatifs de l’expression de son transcrit.

Le canal sodique épithélial, ENaC, est une protéine hétéromérique constituée de trois sous-unités: [alpha], [bêta] et [gamma]. ENaC est exprimé au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales du néphron, du colon distal et des voies aériennes. Au niveau du néphron, l'activité et l'expression de ENaC sont finement régulées par deux hormones: l'aldostérone et la vasopressine, ce qui fait de ENaC un élément clé du maintient de la pression artérielle. ENaC joue également un rôle dans la régulation de la pression artérielle dans le colon distal. Il existe plusieurs mutations du canal directement liées à des troubles graves de la pression artérielle: le syndrome de Liddle et le pseudoaldostéronisme de type I (PHA I). La première pathologie est un gain de fonction du canal provoquant une hypertension précoce et sévère alors que le PHA I est une perte de fonction caractérisée par une diminution de la réabsorption sodium et une hypotension. ENaC est également une cible thérapeutique de choix dans les hypertensions de type 1. Il a récemment été démontré que la sous-unité [alpha] ENaC était impliquée dans l'augmentation de l'activité du canal de cobaye mais pas de rat par deux ligands extra-cellulaires: le cpt-cAMP un analogue perméant de l'AMPc, et le glibenclamide, un inhibiteur des canaux K[indice inférieur ATP]. Notre objectif est de déterminer les sites d'interaction des ces ligands avec ENaC ce qui permettra de mieux comprendre la relation structure/fonction de la boucle extra-cellulaire. Des techniques de biologie moléculaire nous ont permis de construire des sous-unités [alpha] chimériques contenant des séquences de rat et de cobaye. Ces chimères ont été coexprimées dans l'ovocyte de xénope avec les sous-unités [bêta] rat et [gamma] rat et les courants macroscopiques ont été enregistré en voltage clamp à deux électrodes. Nous avons ainsi déterminé que les régions centrales et terminales de la boucle extra-cellulaire de la sous-unité [alpha]gp conféraient une sensibilité partielle au cpt-cAMP. La réalisation de mutants nous a permis d'identifier cinq acides aminés dans la région terminale de la boucle dont une isoleucine en position 510 indispensable à l'activation du canal par le cpt-cAMP. Nous avons montré en patch clamp en configuration"outside out" que cette augmentation du courant macroscopique résultait d'une augmentation de la NPo du canal et non de sa conductance unitaire. Concernant l'interaction entre le glibenclamide et la sous-unité [alpha], nous avons employé la même approche que pour le cpt-cAMP. Nos résultats préliminaires indiquent que la totalité de la boucle extra-cellulaire est impliquée dans l'interaction avec le glibenclamide. Comme pour le cpt-cAMP, la région terminale de la boucle extra-cellulaire confère la plus grande sensibilité au ligand. Cependant, nous n'avons pas identifié tous les acides aminés interagissant avec le glibenclamide. Nous soupçonnons l'isoleucine 510 de jouer un rôle dans cette interaction.

Les viroïdes sont les pathogènes les plus simples connus à ce jour. Ils possèdent un génome d'ARN simple brin, circulaire, qui n'encode aucune protéine et qui n'est pas encapsidé. Malgré tout, ils sont capables d'infecter des plantes supérieures et de causer des symptômes suffisamment sévères pour amener d'importantes pertes économiques dans les domaines agro-alimentaire et horticole. Depuis quelques années, plusieurs études ont été réalisées pour mieux comprendre ces pathogènes obligatoires mais, jusqu'à maintenant, peu de données sont disponibles sur les petits ARN interférents (siARN) produits par les plantes à la suite d'une infection par un viroïde. Le but de ce travail est de recueillir le plus d'informations possible sur les siARN produits par le pêcher à la suite d'une infection par le viroïde de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd). Les petits ARN non-codants de 18 à 26 nucléotides de plants de pêcher sains et infectés par PLMVd ont été clonés et séquencés.Les observations faites à partir de ces séquences montrent que seul le plant infecté produit des petits ARN homologues à PLMVd. Aussi, certaines régions du génome du viroïde semblent être plus enclines à produire des siARN. De plus, les deux polarités du génome de PLMVd semblent être susceptibles à l'interférence à l'ARN. Ensuite, certaines observations montrent que les molécules circulaires de PLMVd ainsi qu'un duplex d'ARN formé des deux polarités du génome de PLMVd sont des cibles potentielles de l'interférence à l'ARN. Enfin, à la suite de l'analyse des résultats, on peut supposer que les siARN homologues à PLMVd peuvent modifier l'expression de certains gènes végétaux. À la suite de ces observations et aux questions qu'elles ont soulevées, nous avons préparé une expérience de séquençage à haut débit des petits ARN d'un plant de pêcher sain et d'un plant infecté par PLMVd.Les résultats préliminaires montrent que le niveau d'expression de PLMVd et des petits ARN homologues à PLMVd varient selon les plants étudiés et selon le mois dans lequel les feuilles de pêcher ont été cueillies. L'ARN extrait des feuilles qui semblaient contenir la plus forte concentration de siARN a été utilisé pour les expériences suivantes.Les premiers tests pour la préparation des petits ARN pour le séquençage par la technologie Solexa d'Illumina montrent que le kit de préparation des petits ARN est efficace. En conclusion, ces résultats ouvrent la voie à un séquençage à haut débit des siARN de pécher, plus particulièrement ceux qui sont associés à l'infection par PLMVd. Ils permettent aussi d'énoncer certaines hypothèses qu'il sera intéressant de vérifier dans le futur.

Les travaux décrits dans ce mémoire visent à élucider le rôle de la protéine Pab2 dans la régulation des gènes méiotiques. La méiose est un phénomène conservé à travers l'évolution chez les organismes eucaryotes. Chez les eucaryotes unicellulaires comme la levure, la méiose accomplie [i.e. accomplit] autant un rôle de reproduction sexuelle qu'un rôle de protection de l'organisme. Chez la levure à fission Schizosaccharomyces pombe , le processus de méiose résultant de la reproduction de deux individus génère des spores, des structures résistantes aux conditions environnementales détrimentales. Lorsque la cellule enclenche la méiose, plusieurs centaines de gènes sont temporellement induits pour exprimer des gènes spécifiques aux processus méiotiques. Afin de s'assurer que des gènes méiotiques ne soient pas exprimés pendant la mitose au détriment de la cellule, des mécanismes de surveillance doivent rigoureusement surveiller l'expression de ces gènes. Afin d'éclaircir le rôle de Pab2 dans cette surveillance, nous avons utilisé une approche génétique combinée à des essais biochimiques. Des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine combinées à des essais de substitution de promoteur ont démontré que la régulation de Pab2 sur les gènes méiotiques est posttranscriptionnelle. De plus, des expériences d'immunoprécipitation de la protéine Pab2 suivies d'analyse d'ARN ont démontré que la protéine Pab2 forme un complexe in vivo avec les ARN qu'elle régule. Des analyses dans le laboratoire ont démontré que Pab2 possède une interaction fonctionnelle et physique avec des composantes de l'exosome. Afin de déterminer l'implication de l'exosome dans la régulation des gènes méiotiques, nous avons utilisé différentes souches de levure [i.e. levures] possédant des délétions dans les gènes des composantes de l'exosome ou des facteurs coopérant avec ce complexe, en présence ou absence de Pab2. Ces expériences ont démontré que l'exosome nucléaire, particulièrement la sous-unité Rrp6, était majoritairement responsable de la dégradation des transcrits méiotiques, et ce sans l'aide de complexes coopérateurs comme le TRAMP. Afin de déterminer le facteur de sélectivité de la régulation par Pab2 et par l'exosome, nous avons utilisé des souches thermosensibles pour la protéine Mmi 1, un autre agent posttranscriptionnel impliqué dans la surveillance de l'expression des gènes méiotiques. Ces expériences ont démontré que Pab2 coopère avec Mmi1 dans la dégradation des transcrits méiotiques. Notamment, l'augmentation de l'expression des gènes méiotiques en absence de Pab2 est suffisante pour contourner la voie dépendante de meiRNA, qui est un ARN non-codant essentiel à l'initiation de la méiose. Ces résultats constituent l'évidence que la protéine Pab2 liant les queues poly(A) participe au maintient du silence de l'expression des gènes méiotiques pendant la mitose.

Chez une bactérie, la régulation de l’expression génétique est essentielle afin de maintenir l’équilibre, s’assurer du bon fonctionnement des processus cellulaires et mieux s’adapter aux changements environnementaux. Elle peut s’effectuer à plusieurs niveaux (la transcription, la traduction et la synthèse ou la dégradation des protéines), et par le bais de différents mécanismes, dont les protéines, font le plus grand part de cette régulation. Cependant, au début des années 2000, une découverte fascinante a mis en évidence un nouveau mécanisme de régulation dont l’ARN est l’acteur principal. Ce sont les riborégulateurs (riboswitches). Ces derniers sont localisés dans la partie non traduite de certains ARNmessagers (ARNm) et capable de lier un ligand spécifique sans l’intervention des protéines, afin de réguler l’expression génique du gène d’intérêt. Aujourd’hui, plusieurs familles de riborégulateurs sont caractérisées, entre autres les riborégulateurs c-di-GMP. Ces derniers sont présents chez plusieurs espèces bactériennes notamment les bactéries pathogènes telles que Clostridium difficile, une bactérie nosocomiale opportuniste qui a causé des problèmes majeurs durant les dernières années, vu sa multirésistance aux antibiotiques. Le séquençage de son génome a révélé la présence de 66 riborégulateurs dont 16 sont des riborégulateurs c-di-GMP. Il a été proposé que parmi ces derniers, certains régulent l’expression des gènes impliqués dans deux phénotypes essentiels chez C. difficile : la motilité et la formation du biofilm. La présente étude porte sur la caractérisation structurale et fonctionnelle de deux riborégulateurs c-di-GMP chez le C. difficile, le Cdi1-1 et Cdi1-12, qui se trouvent en amont du gène CD1990 et le gène CD2830 (ZmpI) respectivement. Au début, nous avons prédit les deux structures liées (en présence du ligand) et non liées (en absence du ligand). Nous avons ainsi démontré qu’un des deux riborégulateurs (Cdi1-12) est fonctionnel et capable de lier le c-di-GMP in vitro. Ensuite, nous avons caractérisé les changements structuraux potentiels lors de l’interaction riborégulateur Cdi1-12/ligand. Nous avons également caractérisé le mécanisme de régulation en cis du riborégulateur Cdi1-12 in vitro et nous avons constaté que c’est un riborégulateur transcriptionnel Rho-indépendant. À la fin de notre étude, nous avons confirmé le mode de régulation de ce riborégulateur in vivo dans la bactérie modèle Bacillus subtilis.

Les protéines de la Famille Ets sont des facteurs de transcription qui reconnaissent par l'intermédiaire d'un domaine de liaison à l'ADN, appelé le domaine ETS, une séquence nucléotidique centrée sur un core consensus 5'-GGAA/T-3'. Le gène fev, un membre de cette famille, a été isolé chez l'humain après avoir été identifié dans une tumeur de Ewing chez l'enfant comme le résultat d'une translocation chromosomique. Une étude préliminaire de 1997 indiquait que chez l'Homme, Fev possède une expression tissulaire restreinte au petit intestin et à la prostate "adulte". Dans la première partie de ce travail, nous avons observé une surexpression de l'ARNm de ce facteur de transcription dans une large série d'adénocarcinomes prostatiques de différenciation variable en comparaison au profil d'expression observé dans un groupe témoin de prostates hyperplasiées. En recherchant des lignées cellulaires qui expriment ce facteur, nous avons mis en évidence la présence de ce messager dans la lignée humaine d'origine prostatique LNCaP. De même, les lignées humaines d'origine hématopoïétiques Dami/HEL92.1.7, K-562, KU-812 F et U-937 expriment ce facteur. Parallèlement, nous avons réalisé l'étude de l'expression de Fev dans le cerveau humain. En effet, chez le rat et chez la souris, l'homologue de Fev (mPet-1/Pet-1) est exprimé spécifiquement dans les neurones sérotoninergiques. Nous avons ainsi montré sur le cerveau humain que l'ARNm de Fev est exclusivement exprimé dans les noyaux du raphé qui contiennent les neurones sérotoninergiques. Il est co-exprimé avec deux marqueurs de ces neurones, la SERT/5-HTT et la TPH2. Parallèlement, nos travaux de caractérisation fonctionnelle de la protéine Fev ont permis de définir ce facteur comme un répresseur transcriptionnel. En effet, ce facteur possède un domaine carboxy-terminal riche en résidus alanines qui lui confère, en partie, sa fonction de répresseur de la transcription (répression active); la délétion de cette région conduisant à une réduction drastique de l'effet répresseur. Parallèlement, nous avons montré que le domaine ETS de Fev est responsable d'une activité répressive passive par l'occupation des sites de liaison aux facteurs Ets. Néanmoins, nous ne connaissons pas, à l'heure actuelle, les gènes-cibles spécifiques qui sont directement réprimés par Fev dans les cellules dans lesquelles le gène est normalement exprimé. Nous avons tenté de développer, par établissement de clones stables, des modèles cellulaires où le gène d'intérêt est surexprimé, mais ces tentatives furent infructueuses. Cet effet drastique de Fev est conféré par la partie carboxy-terminale. Il est ainsi probable que la surexpression de ce répresseur transcriptionnel spécifique de certains gènes cibles de la famille Ets provoque des effets sur la survie des cellules en régulant des gènes indispensables à la croissance cellulaire, et ainsi empêchant la prolifération de clones cellulaires.

La grande famille des facteurs de transcription Ets est caractérisée par un domaine de liaison à l’ADN, le domaine ETS, qui présente une structure de type hélice-tour-hélice ailé et qui reconnaît la séquence nucléotidique GGAA/T. Ces facteurs sont des protéines modulaires, dont les domaines sont structurellement conservés, régulent la transcription de leurs gènes cibles. L’action régulatrice de ces facteurs de transcription, ainsi que leur spécificité, dépendent de leurs sites d’expression, du taux auquel ils sont exprimés ainsi que des modifications post-traductionnelles qui les touchent. Au sein de la famille Ets, les trois membres du groupe PEA3 - Erm, Pea3 et Er81 - sont impliqués dans divers processus tant physiologiques tels que le développement des neurones sensitifs et moteurs que pathologiques tels que la croissance et l’invasion tumorale ou l’apparition de métastases, au niveau mammaire notamment. Notre travail a eu pour ambition de mieux comprendre les relations structure/fonction des membres du groupe PEA3, et plus particulièrement de Erm. Pour réaliser l’étude structurelle des trois membres du groupe PEA3, nous les avons produits, via le système d’expression baculoviral, et purifiés. Dans ces conditions, nous avons obtenu plusieurs mg de la protéine Erm purifiée à plus de 95%. Nous avons dès lors réalisé des études par dichroïsme circulaire et spectrométrie infrarouge qui ont mis en évidence une faible structuration de la protéine. Ces résultats corrèlent avec les prédictions bioinformatiques pour la structuration en hélice alpha. Néanmoins, certaines divergences sont apparues en ce qui concerne la détermination de la structuration en feuillets beta, ces derniers étant probablement surévalués dans les études expérimentales suite à une forte propension à l’agrégation protéique. En parallèle, nous avons pris part à la démonstration du fait que la protéine Erm est modifiée par ubiquitinylation. Cette modification post-traductionnelle a pour conséquence de diriger Erm vers la voie de dégradation par le protéasome et donc de rendre ce facteur de transcription très labile. C’est ainsi qu’à l’heure actuelle, les tentatives de cristallisation de la protéine sont restées sans succès. Afin de mettre en évidence les gènes régulés par les membres du groupe PEA3 dans le cancer mammaire métastatique, nous avons effectué des études par micro-array dans la lignée humaine MDA-MB-231. Lors d’expériences où l’expression de erm et de er81 a été diminuée par la technique des shRNA, nous n’avons malheureusement pas pu identifier de gènes dont l’expression était modulée de façon reproductible. Enfin, dans le but de mieux cerner les mécanismes qui conduisent à la surexpression des facteurs de transcription du groupe PEA3, nous nous sommes intéressés à la régulation de leur expression. Aussi, suite au travail initié préalablement au laboratoire sur le gène erm humain, nous avons déterminé une région de 24 nucléotides au sein du promoteur sensible à l’activation par la voie des PKCs conventionnelles (cPKCs). Cette région contient des sites putatifs de liaison pour plusieurs facteurs de transcription. Les expériences de mutagenèse dirigée et de retard sur gel indiquent que la régulation positive de erm par la voie des cPKCs semble être le résultat de la modification de l'activité d'un ou plusieurs facteur(s) transcriptionnel(s) qui reste(nt) à identifier.

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Le programme de recherche mené se situe à la confluence de l'économie et du droit. Pour reprendre le titre de l'ouvrage de Jean-Jacques Laffont et Jean Tirole de 1993, A Theory of Incentives in Procurement and Regulation, ce programme se déploie selon les deux directions traditionnelles de l'économie publique, à savoir l'analyse économique de la réglementation (regulation), d'une part, et l'analyse économique des contrats publics (procurement), d'autre part. <br /><br />Les premiers travaux de recherche se concentrèrent sur deux domaines d'applications. Le volet regulation a fait l'objet de travaux sur la réglementation des industries de réseaux en cours de libéralisation. Le volet procurement a, quant à lui, été initialement abordé sous l'angle de l'analyse économique des marchés publics. Ces travaux, entamés pour les premiers à l'occasion de la thèse de doctorat et pour les seconds dans le cadre d'un contrat de recherche pour le compte du ministère de la Justice, furent respectivement prolongés par des recherches sur le thème de l'encadrement des aides publiques et sur celui des contrats de partenariats public-privé.<br /><br />Les directions de recherche actuellement explorées suivent encore ces deux axes mais renforcent les dimensions reliées à l'économie du droit et de la concurrence pour le premier ensemble et s'orientent vers des préoccupations de finances et de comptabilité publique pour le second. <br /><br />Il s'agit, en effet, pour un premier ensemble de travaux, de s'intéresser aux décisions de la Commission européenne en matière de mise en œuvre des politiques de concurrence, notamment dans le domaine du contrôle des concentrations ou des alliances horizontales entre firmes. Ces travaux conduiront à s'attacher aux critères économiques utilisés par la Commission et aux effets des contrôles de ses décisions par le Tribunal de Première Instance et la Cour de Justice des Communautés européennes. Il conviendra ensuite de confronter les dispositifs institutionnels et les pratiques qui en découlent (via les décisions de la Commission et les arrêts des tribunaux) avec celles en vigueur outre-Atlantique.<br /><br />Un second ensemble de travaux porte sur les effets de l'encadrement comptable et budgétaire des contrats administratifs, aux premiers rangs desquels les contrats de partenariats public-privé. Il s'agit notamment de s'attacher aux modalités d'enregistrement de ces derniers tant dans les comptes publics au sens de Maastricht (dans le cadre des prescriptions d'Eurostat), dans la comptabilité patrimoniale de la collectivité publique (dans le cadre des exigences de la Loi Organique relative aux Lois de Finances - Lolf), que dans les comptes sociaux du prestataire privé (dans le cadre de l'application des normes IFRS). Il convient de s'interroger sur l'existence de stratégies de dissimulation de la dépense (et de la dette publique) au travers de tels montages. De telles stratégies de comptabilité publique créative (transfert d'engagements financiers de long terme en hors bilan) peuvent induire deux risques. Ils peuvent tout d'abord conduire à des distorsions dans le choix des instruments contractuels de la part de la collectivité publique (lesquelles viseraient plus à satisfaire des règles budgétaires telles le Pacte de Stabilité et de Croissance qu'une optimisation intertemporelle de la dépense publique). Ils contribuent à dégrader de ce fait la transparence des comptes publics. Ainsi, l'analyse du cadre comptable et financier dans lequel s'inscrivent de tels contrats ouvre sur une problématique des risques sous-jacents pour les finances publiques et sur le contrôle des pratiques de comptabilité créative, que celle-ci soit envisagée du côté de la collectivité publique ou de sa contrepartie privée.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.