Le transfert intergénérationnel de l'immunité est un phénomène dont l'étude remonte à une dizaine d'année. Chez les vertébrés, il prend la forme d'un transfert d'anticorps de la mère aux juvéniles. Pourtant, les processus écologiques et évolutifs du transfert sur plusieurs générations et la persistance des anticorps maternels chez les juvéniles n'ont pas bien étudiés. Ce travail de thèse porte sur l'étude des mécanismes du transfert d'anticorps maternel sur plusieurs générations consécutives et leurs conséquences sur la réponse immunitaire et sur la croissance des juvéniles. En utilisant des approches expérimentales, j'ai pu dans un premier temps montré que le transfert d'anticorps maternel était affecté par la disponibilité en nourriture dans l'environnement. De plus, nos résultats suggèrent que la persistance d'anticorps maternel dépend du niveau initial d'anticorps maternels présents chez le juvénile dans les premiers jours de vie. Dans un second temps, nous avons étudié la réponse immunitaire et la croissance des poussins en tentant de mettre en évidence comment les anticorps maternels influençaient le compromis entre ces deux paramètres physiologiques. Enfin, nos résultats suggèrent que les anticorps maternels pourraient être le messager intergénérationel d'un effet épigénétique sur la réponse immunitaire. En effet, une réponse immunitairre des grand-mères induit par l'exposition à un parasite a été trouvé stimuler la réponse immunitaire des petits-enfants contre ce même parasite. Mes travaux de thèses soulignent une fois de plus, l'importance du transfert de l'immunité dans l'écologie et l'évolution des interactions hôte-parasite. / Intergenerational transfer of immunity is a phenomenon which started to be studied 10 years ago. In vertebrates, it takes the form of a transfer of antibodies from mothers to juveniles. However, the ecological and evolutionary processes of transfer across several generations and the persistence of maternals antibodies in chicks remain poorly understood. This thesis focuses on the study of the mechanisms of maternal antibodies transfer over several generations and on how they impact the immune response and growth in juveniles. By using experimental approaches, I first show that the transfer of maternal antibody was affected by food availability in the environment. In addition, our results suggest that the persistence of maternal antibodies depends on the initial level of maternal antibodies present in the nestlings in the first days of life. Secondly, we studied the immune response and growth of juvenile by investigating how maternal antibodies may affect the resolution of the trade-off between these two physiological parameters. Finally, our results suggest that maternal antibodies would be a messenger of an epigenetic effect on immunty. Indeed, induced immune response in grand-mothers towards a pathogen has been found to stimulate the immune response of grand-children. My thesis emphasizes the importance of maternal transfer of immunity in the ecology and evolution of host-parasite.

L’apport des modèles de transplantation chez le rongeur pour des protocoles d’induction de tolérance chez l’homme est limité. La création d’un modèle pré-clinique visant à induire une tolérance aux allogreffes chez le gros animal comme le porc s’avère pertinent. L’activation de cellules dendritiques (DC) porcines par le CD40L ou le mélange de TNFa, d’INFa et de LPS augmente l’expression des molécules B7, induit l’expression de novo de CD25 et augmente leur capacité allostimulatrices. Par ailleurs, le CD40L ou le mélange TNF+INF+LPS induit des DC orientant la réponse allogénique vers Th1 et Th17. Les lymphocytes T régulateurs naturels CD4+CD25+ porcins ont été mis en évidence grâce à l’expression de Foxp3. Une stimulation de cellules CD4+ par la PHA en présence de TGFß induit l’expression de Foxp3. L’ajout de rapamycine maintien cette expression et renforce l’activité suppressive ce qui pourrait être expliqué par le fait que la rapamycine bloque l’expression d’IL 17 induite par le TGFß. / The contribution of rodent models of transplantation for protocols of induction of tolerance in humans has been disappointing. It therefore seems relevant to create a pre-clinic model in large animals. The activation of swine dendritic cells (DC) by CD40L or a combination of TNF+INF+LPS increases the expression of B7 molecules and induced de novo expression of CD25 on DC associated with an increase of allogeneic lymphocyte stimulation ability. In addition, CD40L and TNF+IFN+LPS induced DC polarizing to Th1 and Th17 response respectively. Swine natural CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes have been highlighted through the expression of Foxp3. Stimulation of CD4+ cells by PHA and IL-2 in the presence of TGFß induces the expression of Foxp3 and the addition of rapamycin enhances the suppressive activity while maintaining the expression of Foxp3. Rapamycin blocks the expression of IL-17 induced by TGFß. This effect could explain the increase of the suppressive activity caused by rapamycin.

Afin d'améliorer l'efficacité des immunothérapies anti-tumorales, il est crucial de mieux comprendre les régulations cellulaires et moléculaires contrôlant l'initiation et le maintien d'une réponse immunitaire adaptative anti-tumorale. Dans ce contexte, l'équipe a identifié l'E3 ubiquitine ligase ASB2a (Ankyrin repeat-containing protein with a SOCS Box 2 alpha) comme un régulateur de la motilité des cellules hématopoïétiques via la polyubiquitination et la dégradation par le protéasome de la Filamine A. Mon projet de thèse visait à étudier si ASB2a joue un rôle dans la mise en place et/ou le maintien de la réponse immunitaire anti-tumorale. L'analyse des données de séquençage d'ARN issues des biopsies d'une cohorte de patients atteints de cancer colorectaux révèle que l'expression d'ASB2 est plus élevée dans les sous-types de mauvais pronostic et est inversement corrélée avec la survie des patients. Dans le but de déterminer s'il existe un lien fonctionnel entre l'expression d'ASB2 et la progression du cancer du côlon, nous avons utilisé un modèle de tumeurs coliques chez des souris invalidées de façon conditionnelle et inductible pour le gène ASB2 dans les cellules hématopoïétiques. Dans un premier temps, nous avons validé la pertinence de ce modèle d'invalidation en montrant qu'ASB2a était responsable des différents niveaux de Filamine A observés entre les différentes populations de cellules dendritiques conventionnelles de la rate. J'ai ensuite démontré que l'invalidation d'ASB2 réduit le développement des tumeurs coliques, résultats en accord avec la pathologie humaine. Ce phénotype est causé par l'activation d'une réponse immunitaire anti-tumorale adaptative de type 1 plus forte chez les souris invalidées pour ASB2. L'ensemble de ces travaux mettent en évidence le potentiel d'ASB2a comme cible thérapeutique innovante dans le traitement du cancer colorectal. / In order to enhance the efficiency of anti-tumor immunotherapies, it is crucial to better understand the cellular and molecular regulations sustaining the initiation and maintenance of an adaptive anti-tumor immune response. In this context, the team identified the E3 ubiquitin ligase ASB2a (Ankyrin repeat-containing protein with a SOCS Box 2 alpha) as a regulator of hematopoietic cell mobility through the polybiquitination and proteasomal degradation of the Filamin A. My thesis project aimed to study if ASB2a plays a role in the establishment and/or maintenance of the anti-tumor immune response. The analysis of RNA sequencing derived from the biopsy of colorectal cancer patients revealed that ASB2a expression is higher in the subtypes associated with poor prognosis and is inversely correlated with patient relapse-free survival. In order to determine whether there is a functional link between ASB2 expression and colon cancer progression, we used a colorectal cancer model applied to ASB2 knockout mice in hematopoietic cells. First, we validate the relevance of this knockout model by showing that ASB2a was responsible for the different levels of Filamin A observed between the different populations of spleen conventional dendritic cells. Then, I have shown that ASB2 invalidation reduces the development of colonic tumors, in accordance with human pathology. This phenotype is due to the activation of a stronger type 1 adaptive anti-tumor immune response in ASB2 knockout mice. This study highlight the potential of ASB2a as an innovative therapeutic target in the treatment of colorectal cancer.

La pression rencontrée par les organismes sur Terre varie de la pression atmosphérique à 110 MPa atteinte dans la fosse la plus profonde de l'océan. Même si Escherichia. coli n’est pas naturellement résistante à la pression, elle capable d'acquérir une résistance et même supporter un choc de pression de 2 GPa (~20 000 atm). L'une des réponses intéressantes d’E. coli à un choc sous létal de pression (100 MPa) est l'induction d'une réponse SOS dépendante de RecA due à des lésions double brins de l’ADN. La pression elle-même n'est pas capable de compromettre l'intégrité covalente de l'ADN. Des criblages ont permis d’isoler des souches d’E. coli résistantes à la pression qui révèlent qu'une endonucléase de restriction (ER) de type IV, Mrr, est le seul facteur responsable du clivage de l'ADN. Cette enzyme cible uniquement l'ADN méthylé et l’expression d’une MTase étrangère, M.HhaII, est également capable d'induire une réponse SOS dans des souches de E. coli en présence de Mrr. Ici, nous démontrons en utilisant des techniques de fluctuations d’intensité de fluorescence, in vivo et in vitro que Mrr est un présent sous la forme d’un tétramère dans les cellules non stressées. La pression est capable de dissocier Mrr en dimères actifs qui peuvent lier l'ADN et cliver à certains sites cryptiques. En revanche, la MTase HhaII favorise la forme dimeric de Mrr liée à l’ADN en raison de la méthylation de nombreux sites de haute affinité. Une analyse mutationnelle et un modèle d’homologie 3D de la protéine entière révèle la base structurelle probable du changement entre la forme tétramérique inactive à la forme dimérique active. Nous avons mis en pace un système permettant de faire de la microscopie sous pression (in vitro and in vivo) et nos résultats préliminaires ont confirmé notre modèle d’activation de Mrr. / The pressure encountered by organisms on Earth varies from the atmospheric pressure to 110 MPa as reached in the deepest trench of the ocean. Although Escherichia coli is not naturally resistant to high pressure, it is capable of acquiring pressure resistance and withstanding a pressure shock up to 2 GPa (~20,000 atm). When exposed to a sub-lethal pressure shock (100 MPa) E. coli induces a RecA-dependent SOS response due to DNA double strand breaks. Pressure itself is not capable of compromising the covalent integrity of the DNA. Instead, screens for pressure-resistance E. coli mutants have revealed that a Type IV restriction endonuclease, Mrr is the only factor responsible for DNA cleavage. This enzymes targets only methylated DNA and expression of a foreign methyltransferase, M.HhaII, is also capable of inducing an SOS response in strains harboring Mrr. Here, we demonstrate using fluorescence fluctuation techniques in vivo and in vitro that Mrr is present as a tetramer in unstressed cells and that pressure dissociates Mrr into active dimers that can bind DNA and cleave at some cryptic sites. In contrast, the M.HhaII MTase pulls the Mrr tetramer-dimer equilibrium to the dimer-bound DNA form probably due to the methylation of many high-affinity sites. Mutational analysis associated with a 3D homology model of the full-length protein reveals the probable structural basis for the switch from an inactive tetramer to an active dimer. We set up a system that allows microscopy experiments (in vitro and in vivo) under pressure and preliminary results have confirmed our model of Mrr activation.

La broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) est une maladie respiratoire inflammatoire chronique caractérisée par une limitation progressive et irréversible des débits aériens causée par l’inhalation à long terme de particules nocives telles que le tabac. La BPCO présente un remodelage majeur et hétérogène des voies aériennes comportant une grande variabilité inter-individuelle. La réponse inflammatoire et immunitaire au cours de la BPCO est caractérisée par une infiltration du tissu respiratoire par les polynucléaires neutrophiles (PN), les macrophages et par les cellules T. La dégradation des fibres élastiques du poumon en peptides solubles d’élastine (PE) par le biais de la sécrétion de protéases par les cellules de l’immunité innée est une caractéristique constante de la BPCO. Ces PE participent à la physiopathologie de la BPCO comme cela a été démontré dans différents modèles murins de la maladie emphysémateuse. L’orientation de la réponse des cellules T helper (Th) et des cellules T cytotoxiques (Tc) au cours de la BPCO n’est pas élucidée et reste controversée. L’objectif principal de ce travail de thèse a été de définir l’orientation de la réponse Th et Tc ainsi que le rôle des PE dans le remodelage associé à la BPCO. Pour cela, nous avons étudié la signature cytokinique Th-1/Tc-1 (IFN-), Th-2/Tc-2 (IL-4), Th-17/Tc-17 (IL-17) spécifique du remodelage bronchique associé à la BPCO au niveau cellulaire, mais également transcriptionnel et fonctionnel. L’association entre les résultats expérimentaux obtenus et le phénotype des patients inclus a été analysé de manière à déterminer le rôle de ces mécanismes dans l’expression clinique de cette pathologie respiratoire chronique. Les résultats obtenus ont mis en évidence une diminution de l’expression de l’IL-4 (Th2) chez les patients BPCO par rapport aux sujets contrôles ainsi qu’une potentialisation de l’expression de cette cytokine en présence des PE. / Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a chronic inflammatory respiratory pathology characterized by a progressive and irreversible limitation of airflow caused by the long-term inhalation of harmful particles such as tobacco. COPD presents a major and heterogeneous remodeling of the airways with important inter-individual variability. The inflammatory and immune response during COPD is characterized by infiltration of pulmonary tissue by neutrophils (PN), macrophages, and T cells. The degradation of lung elastic fibers into soluble elastin peptides (EP) is caused by the secretion of proteases by innate immunity cells and it is a consistent feature of COPD. These EP participate in the pathophysiology of COPD as demonstrated in different murine models of the emphysematous disease. The T helper (Th) and the T cytotoxic (Tc) orientation during COPD is unclear andremains controversial. The main objective of this work was to define the Th and Tc responses as well as the role ofEP in airways remodeling associated to COPD. For this purpose, we studied the cytokine signature Th-1/Tc-1 (IFN- ), Th-2/Tc-2 (IL-4), Th-17/Tc-17 (IL-17) specific of the airway remodeling associated to COPD both at the cellular, transcriptional and functional level. Association between the experimental results obtained and the phenotype of the patients included in the study was analyzed in order to determine the role of these mechanisms in the clinical expression of this chronic respiratory pathology. The results obtained showed a decrease in the expression of IL-4 (Th2) in COPD patients compared to control subjects as well as a potentiation of this cytokine expression in the presence of EP.

De nos jours, les agents pathogènes des plantes, engendrent encore des pertes agricoles importantes. A terme, la solution la plus adaptée semble être la création de variétés de plantes cultivées présentant une résistance génétique à large spectre et durable. Créer de telles plantes nécessite la compréhension des mécanismes de résistance mis en jeu dans des pathosystèmes modèles, tels que celui impliquant le gène de résistance Rx et le virus X de la pomme de terre. Dans ce système, la protéine Rx intervient dans la perception d’un facteur d'avirulence issu du virus: sa protéine de capside (Cp). Cependant, les mécanismes moléculaires déclenchant la résistance chez la plante exprimant Rx demeurent obscurs. Cette étude s’est focalisée sur l’étape de reconnaissance de l’éliciteur viral par Rx. Une première approche a permis la mise en évidence d’un éliciteur minimal de 90 acides amine. L’étude d’un fragment légèrement plus grand par des méthodes de biochimie structurale, tend à exclure un modèle selon lequel, la différence de structuration tertiaire entre Cp élicitrice et Cp non élicitrice déterminerait la reconnaissance par Rx. Une seconde approche, de biologie moléculaire, a mis en évidence deux protéines hôte interagissant avec ce petit fragment éliciteur. L'étude s’est focalisée sur un gène codant un facteur de transcription, nbERF5, et a révélé que cette protéine interagit aussi bien avec les Cp de souches de Potexvirus avirulentes que virulentes dans la résistance liée à Rx, mais également avec la protéine de résistance Rx et l’intéracteur direct: RanGAP2. La poursuite de la caractérisation de cet ERF, permettra de déterminer son importance dans la résistance liée à Rx. / Nowadays, phytopathogenic agents are still causing significant agricultural losses. The most suitable option appears to be the creation of crop species carrying a genetic durable and broad spectrum resistance. In order to create such varieties, we need to understand the mechanisms underlying resistance, involved in model Pathosystems, Such as the one composed of the resistance gene Rx and the potato virus X. In that system, the host gene encodes a protein assimilated to a receptor implicated in the perception of an avirulence factor produced by the virus: its capside protein (Cp). Nevertheless, the molecular mechanisms triggering the resistance remain largely unknown. This study has been focused on the elicitor recognition mediated by Rx. A first approach led to the identification of a minimal elicitor containing 90 amino acids has. The structural characterization of a slightly larger protein fragment using biochemical methods suggested that the difference in the tertiary structuration of both elicitor and non-elicitor Cp would not be the determinant of Rx mediated recognition. Second, a molecular approach led to the discovery of two host proteins interacting with the small elicitor fragment. The work was focused on a transcription factor, nbERF5 and showed that this protein interacts similarly with elicitor or non-elicitor Cps of Rx mediated resistance. Interestingly, this gene product is able to directly interact with the Rx protein, but also with the direct interactor of Rx: RanGAP2, protein required for the Rx mediated resistance efficiency. Further characterization of this ethylen response factor will help us to understand its role in Rx mediated resistance.

Le microenvironnement tumoral, et notamment le stress hypoxique, joue un rôle immunosuppressif permettant l’échappement des cellules tumorales à la surveillance du système immunitaire. Des études récentes ont montré que l’échange de microvésicules (MVs) entre les cellules tumorales et les cellules du système immunitaire peut être responsable de l’établissement d’un microenvironnement immunosuppressif. Dans ce contexte, nous avons étudié l’effet des MVs issues des cellules tumorales hypoxiques sur la cytotoxicité des cellules «Natural Killer» (NKs). Nos résultats démontrent clairement que les cellules NKs sont capables d’internaliser les MVs issues des cellules tumorales normoxiques et hypoxiques. Cependant, seules les MVs hypoxiques sont capables de diminuer significativement la cytotoxicité des cellules NKs. Ainsi, nous avons déterminé que les MVs dérivées des cellules tumorales hypoxiques séquestrent deux immunomodulateurs, le TGF- et le miR-23a. Nous avons montré que le transfert de TGF- et miR-23a aux cellules NKs était responsable de la diminution respective de l’expression du récepteur activateur NKG2D à leur surface et de la protéine membranaire associée aux lysosomes (LAMP-1/CD107a) impliquée dans la dégranulation des granules cytotoxiques. Dans la deuxième partie de cette étude nous avons montré que les cellules tumorales soumises à un stress hypoxique étaient capables de déjouer un système immunitaire fonctionnel et d’échapper ainsi à la surveillance immunitaire des cellules NKs. En effet, nos résultats ont clairement démontré que la résistance des cellules tumorales hypoxiques à la lyse par les cellules NKs n’était pas liée à un défaut de reconnaissance, mais plutôt à l’activation d’un mécanisme de résistance intrinsèque dans les cellules tumorales. Ce mécanisme de résistance implique l’activation de l’autophagie qui opère dans les cellules tumorales pour dégrader le granzyme B, une protéase à sérine secrétée par les cellules NKs dont l’internalisation par les cellules tumorales cibles est nécessaire pour induire leur mort. Les expériences d’imagerie cellulaire combinées à des approches biochimiques ont confirmé que le niveau de granzyme B dans les cellules tumorales hypoxiques était significativement mois élevé par rapport à celui des cellules tumorales normoxiques. Ces résultats suggèrent fortement que le granzyme B est destiné à être dégradé par autophagie dans les cellules tumorales hypoxiques. En effet, l’inhibition génétique et pharmacologique de l’autophagie dans les cellules tumorales hypoxiques était suffisante pour contrecarrer la dégradation de granzyme B et ainsi restaurer la sensibilité des cellules tumorales hypoxiques à la lyse par les cellules NKs. Nos résultats ont clairement établi que l’inhibition de l’autophagie pouvait améliorer la réponse immunitaire antitumorale dépendante des cellules NK. Nous avons validé ce concept in vivo chez la souris en utilisant deux modèles syngéniques de cancer du sein et de mélanome. L’ensemble de nos travaux indiquent clairement que le stress hypoxique, qui est une caractéristique majeure du microenvironnement tumoral, peut favoriser l’établissement d’un microenvironnement immunosuppressif par plusieurs mécanismes qui ne s’excluent pas mutuellement. En effet, le stress hypoxique modifie les caractéristiques des cellules tumorales et active des mécanismes de résistance à la surveillance immunitaire. De plus, les cellules tumorales modifiées peuvent éduquer et exporter leur phénotype hypoxique aux cellules immunitaires présentes dans le microenvironnement afin d’affaiblir leur pouvoir cytotoxique. Nos résultats ouvrent ainsi la voie à la mise en place de nouvelles applications cliniques en immunothérapie anticancéreuse basées sur la réactivation des lymphocytes cytotoxiques et l’inhibition simultanée de l’autophagie. / The tumor microenvironment, including hypoxic stress plays an immunosuppressive role in tumor cell escape from immune surveillance. Recent studies have shown that the exchange of microvesicles (MVs) between tumor cells and cells of the immune system could be responsible for the establishment of an immunosuppressive microenvironment. In this context, we investigated the effect of MVs derived from hypoxic tumor cells on the cytotoxicity of Natural Killer (NK) cells. Our results clearly demonstrated that NK cells are able to internalize MVs derived from both normoxic and hypoxic tumor cells. However, only hypoxic MVs are able to significantly reduce the cytotoxicity of NK cells. Thus, we revealed that MVs derived from hypoxic tumor cells sequester two immunomodulators, TGF- and miR-23a. We have shown that the transfer of TGF- and miR-23a to NK cells was responsible for the respective reduction of the expression of NKG2D activating receptor on their surface and lysosomal-associated membrane protein (LAMP-1 / CD107a) involved in degranulation of cytotoxic granules.In the second part of this thesis we have shown that tumor cells subjected to hypoxic stress were able to outmaneuver a functional immune system and thus escape NK-mediated immune surveillance. Indeed, our results clearly demonstrated that the resistance of hypoxic tumor cells to NK-mediated lysis was not related to the impairment of recognition by NK cells, but rather to the activation of an intrinsic resistance mechanism in tumor cells. We showed that the resistance mechanism involves the activation of the autophagy which operates in the tumor cells to degrade the granzyme B, a serine protease secreted by NK cells and internalized by target tumor cells to induce cell death. Cell imaging experiments combined to biochemical approaches have confirmed that the level of granzyme B in hypoxic tumor cells was significantly higher compared to normoxic tumor cells. The analysis of the subcellular distribution of granzyme B reveals that it is predominantly present in the endosomes and autophagosomes of hypoxic tumor cells. These results strongly suggest that granzyme B is subjected to be degraded by autophagy in hypoxic tumor cells. Genetic and pharmacological inhibition of autophagy in hypoxic tumor cells was sufficient to block the degradation of granzyme B and thus restore the sensitivity of hypoxic tumor cells to NK-mediated lysis. Our results clearly demonstrated that inhibition of autophagy could improve NK-mediated antitumor immune response. We validated this concept in vivo using two syngeneic mice model of breast cancer and melanoma.Taken together, our work clearly shows that hypoxic stress, which is a major feature of the tumor microenvironment, can promote the establishment of an immunosuppressive microenvironment by several mechanisms which are not mutually exclusive. Thus, hypoxic stress changes the characteristics of tumor cells and activates the mechanisms of resistance to immune surveillance. In addition, tumor cells can educate and export their hypoxic phenotype to the immune cells in the microenvironment in order to impair their cytotoxicity. Our findings pave the way for the development of new clinical applications in cancer immunotherapy based on the reactivation of cytotoxic lymphocytes and simultaneous inhibition of autophagy.

La réponse au choc thermique est un mécanisme de défense largement décrit au cours duquel l’expression préférentielle des protéines de choc thermique Hsp aide la cellule à récupérer des dommages causés par l’hyperthermie, comme la dénaturation/agrégation des protéines. Une des conséquences du choc thermique mise en évidence au laboratoire, est l’activation du facteur de transcription NFκB. Cette activation a lieu pendant la période de récupération suivant ce stress. Par comparaison de la réponse au choc thermique de cellules témoins ou déficientes en NFκB, nous avons cherché à étudier les conséquences de l’activation de NFκB par le choc thermique. Nous avons montré que NFκB active un mécanisme augmentant la survie des cellules soumises à une hyperthermie : l’autophagie. L’absence d’induction de ce mécanisme conduit à la mort par nécrose des cellules déplétées en NFκB. Dans ces cellules, l’induction artificielle de l’autophagie restaure une survie normale au stress thermique. Nous avons montré que les principaux régulateurs de l’autophagie (complexes mTOR et PI3Kinase de Classe III) ne sont pas des cibles modulées par NFκB, en réponse à une hyperthermie. En revanche, l’accumulation de protéines dénaturées voire agrégées est un élément primordial pour l’activation de l’autophagie-dépendante de NFκB. En effet dans les cellules déficientes pour NFκB, contrairement aux cellules témoins, l’accumulation de protéines agrégées induite par le traitement hyperthermique, mais aussi par l’expression de formes mutées d’HspB5, n’est pas résorbée ; ceci indique que le contrôle qualité des protéines est altéré dans ces cellules. Cette altération pourrait provenir d’un défaut de formation du complexe BAG3-HspB8 en absence de NFκB. En effet, nous avons montré que la forte expression des gènes bag3 et hspb8, induite suite au stress thermique, est dépendante de NFκB et que l’accumulation du complexe BAG3-HspB8, observé dans les cellules témoins soumises au choc thermique, est inhibée dans les cellules déficientes pour NFκB. Nos résultats démontrent que NFκB induit un processus autophagique en réponse à l’agrégation protéique induite par l’hyperthermie. Ce mécanisme, nécessitant la formation du complexe BAG3-HspB8, augmente la survie des cellules probablement par l’élimination des protéines agrégées générées au cours du stress thermique / The heat shock response is a widely described defense mechanism during which the preferential expression of heat shock proteins (Hsps) helps the cell to recover from thermal damages such as protein denaturation/aggregation. We have previously reported that NFκB transcription factor is activated during the recovery period after heat shock. Thus, we aimed to analyze the consequences of NFκB activation during heat shock recovery, by comparing the heat shock response of NFκB competent and incompetent cells. We demonstrated that NFκB plays a major and crucial role during the heat shock response by activating autophagy, which increases the survival of heat-treated cells. Indeed, we observed that autophagy is not activated during heat shock recovery leading to an increased level of necrotic cell death in NFκB incompetent cells. Moreover, when autophagy is artificially induced in these cells, the heat shock cytotoxicity is turned back to normal. We showed that the key regulators of autophagy (mTOR complex, and class III PI3Kinase complex) are not regulated by NFκB after heat shock. In contrast, we observed that aberrantly folded/aggregated proteins accumulation is a prime event in the activation of NFκB -mediated autophagy. Moreover, NFκB -depleted cells accumulate higher levels of protein aggregates induced by either heat shock treatment or mutated form of HspB5, indicating that the protein quality control process seem to be altered in these cells. This alteration could be caused by a defect in BAG3-HspB8 complex formation in NFκB -depleted cells. We demonstrated that heat shock treatment induces a NFB-dependent overexpression of the bag3 and hspb8 genes. Moreover, the accumulation of BAG3-HspB8 complex in heat shocked NFκB -competent cells is inhibited by NFκB depletion. Our findings how / prove / highlight revealed that NFκB -induced autophagy during heat shock recovery is an additional response to protein denaturation/aggregation induced by heat shock. This process depends on the BAG3-HspB8 complex formation and increases cell survival, probably through clearance of aggregated proteins

Alors que les infections virales représentent toujours un problème majeur de santé publique, notamment en raison de l’émergence de nouveaux virus, notre arsenal thérapeutique reste limité. Les antiviraux à action directe existants sont généralement très spécifiques d’une espèce virale donnée générant l’apparition de souches résistantes aux traitements. L’objectif au laboratoire a donc été de chercher de nouveaux antiviraux à large spectre ciblant l’hôte. Pour cela, deux systèmes de criblage distincts ont été mis au point au laboratoire. La première stratégie de criblage, basée sur la combinaison d'infections in vitro par les virus recombinants de la rougeole et du chikungunya, a permis d’identifier deux molécules actives : le ChX77 qui est une triaminopyrimidine, et le sr1057 qui est une pyrroloquinoxaline. Dans ce travail, nous décrivons les propriétés antivirales puissantes in vitro de ChX77 aussi bien contre les virus de la rougeole et du chikungunya que contre le virus Coxsackie B3, trois virus à ARN très distincts. La molécule sr1057, quant à elle, présente une activité inhibitrice non seulement contre des virus à ARN tels que le virus de la rougeole, le virus du chikungunya et le virus Ebola, mais aussi contre des virus à ADN tels que les virus de l’herpès simplex humains et équins in vitro. Ce qui en fait des molécules antivirales à large spectre qui cibleraient probablement l’hôte car elles ont la capacité d’inhiber la réplication des virus de familles complètement différentes. La seconde stratégie développée a permis d’identifier ChX79, un dérivé 1H-benzimidazole-4-carboxamides, stimulant la réponse immunitaire innée par l’utilisation d’une lignée rapportrice exprimant la luciférase sous contrôle d'un élément de réponse aux interférons (ISRE : Interferon-Stimulated Response Element). Cette molécule présente de remarquables propriétés immunostimulatrices et induit spécifiquement certains gènes impliqués dans la réponse interféron de type I via la protéine adaptatrice MAVS et le facteur de transcription IRF1. Par ailleurs, cette molécule induit un programme de stress cellulaire intégré associé notamment à des dommages à l’ADN. Enfin, l’originalité de cette molécule demeure dans sa capacité à agir de façon synergique sur la réponse cellulaire à de l’ADN exogène permettant la production des quantités importantes d’interféron de type I via une voie STING dépendante. Ces résultats éclairent les mécanismes susceptibles de moduler la réponse cellulaire à de l’ADN cytosolique, un PAMP associé aux infections par des virus ou des bactéries, mais également à des stress génotoxiques liés à des radiations ou des agents carcinogènes / While viral infections are still a major public health problem, particularly because of the emergence of new viruses, our therapeutic arsenal remains limited. The existing Direct-acting antivirals are usually very specific for a given virus species generating the development of resistance to treatment. The objective of the laboratory was looking for new broad-spectrum antivirals targeting the host. For this, two different screening systems have been developed in the laboratory. The first strategy, based on the combination of infections in vitro with recombinant measles and chikungunya viruses, allowed us to identify two active molecules: the ChX77 which is a triaminopyrimidine, and the sr1057 which is a pyrroloquinoxaline. In this work we describe the powerful antiviral properties in vitro of ChX77 against both measles and chikungunya viruses and against the Coxsackievirus B3, three very distinct RNA viruses. The sr1057 molecule, for its part, has an inhibitory activity not only against RNA viruses such as measles, chikungunya and Ebola viruses, but also against DNA viruses such as human and equine herpes simplex virus in vitro. These results suggest that these drugs, with a broad-spectrum antiviral activity, target probably the host because they have the ability to inhibit the viral replication of viruses from completely different families. The second strategy developed allowed us to select ChX79, a 1Hbenzimidazole-4-carboxamides, stimulating the innate immune response by using a rapporteur line expressing luciferase under the control of an interferon response element (ISRE: Interferon-Stimulated Response Element). This molecule has remarkable immunostimulatory properties and induces specifically genes involved in type I interferon response via the mitochondrial signaling protein MAVS and the transcription factor IRF1. Finally, the originality of this molecule remains in its ability to prime efficiently cellular response to transfected plasmid DNA as assessed by potent synergistic effects on IFN-β secretion and ISG expression levels via STING-dependent pathway. All together, these results bring tools to decipher the mechanisms that modulate the cellular response to the cytosolic DNA, a PAMP associated to infections by viruses or bacteria, but also to genotoxic stress related to radiation or carcinogens

Le cancer du sein est le cancer féminin le plus fréquent et celui qui cause le plus de décès dans le monde. Il existe plusieurs types de cancer du sein qui diffèrent par l’expression des récepteurs aux œstrogènes, à la progestérone et du récepteur HER2. Le cancer du sein dit triple négatif (TNBC) n’exprime aucun de ces récepteurs. Le métabolisme des sphingolipides (SL) est fréquemment altéré dans les cancers du sein et semble participer à la progression tumorale. Tandis que les SL ont été décrits comme modulateurs des réponses immunitaires dans des modèles précliniques de cancer, il n’existe pas à ce jour d’étude chez l’Homme évaluant l’impact des altérations du métabolisme des SL sur le développement tumoral et la réponse immunitaire associée. Dans ce contexte, l’objectif de nos travaux est double. Le premier objectif est de caractériser une signature sphingolipidique dans des biopsies de tumeurs mammaires humaines de divers sous-types histologiques. Une analyse par spectrométrie de masse à haute résolution nous a permis d’identifier dans les TNBC des taux élevés de SL en -C24:0, qui pourraient constituer des biomarqueurs potentiels pour ce type de cancer. Le deuxième objectif est d’établir une signature sphingolipidique associée à la réponse immunitaire dans le cancer du sein. Nous avons analysé les lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) par cytométrie en flux et par immunohistochimie dans nos échantillons tumoraux. Ces analyses nous ont permis de montrer que, dans les TNBC, les taux de C16:0-céramide sont corrélés positivement avec la proportion de TIL CD8+ et négativement avec celle des Treg FoxP3+. Afin d’évaluer l’influence potentielle des SL sur la topologie d’infiltration des lymphocytes (intratumoral versus adjacent), nous avons aussi comparé les taux de SL dans les tumeurs ayant une forte ou une faible proportion de lymphocytes T CD8+ intratumoraux. Nous avons observé notamment des taux élevés de sphingosine-1-phosphate (S1P) dans les tumeurs faiblement infiltrées par les lymphocytes T CD8+ intratumoraux. Nos observations suggèrent que la production de C16:0-céramide soit en faveur d’un recrutement préférentiel des lymphocytes T CD8+ dans les TNBC, tandis que la S1P pourrait être un facteur d’immunoéchappement, impactant négativement sur la topologie des TIL CD8+ dans les tumeurs mammaires. L’ensemble de nos travaux indique que certains SL pourraient constituer des biomarqueurs originaux de TNBC. De plus, la reprogrammation de ce métabolisme pourrait augmenter (i) quantitativement et qualitativement l’infiltration intratumorale des lymphocytes, et (ii) potentiellement l’efficacité des immunothérapies dans le cancer du sein. / Breast cancer, the most common malignancy affecting women, is responsible for the majority of woman death by cancer worldwide. There are three different breast cancer types defined by the expression of oestrogen and progesterone and HER2 receptors. The so-called triple negative breast cancer (TNBC), doesn’t express any of these receptors. Sphingolipid (SL) metabolism is frequently altered in breast cancer, alterations are associated with tumour progression. Although SL can act as immune response modulators in preclinical cancer models, there are, to date, no study assessing the impact of SL metabolism alterations on tumor development and associated immune response in Humans. In this setting, our aim was double. Our first objective was to characterize the SL signature in human mammary tumour biopsies from different pathological subtypes. Using high-resolution mass spectrometry assay, we identified elevated levels of C24:0-SL in TNBC, which could be used as potential biomarkers of this cancer subtype. Our second objective was to identify a SL signature associated with immune responses in breast cancer tissues. Tumour-infiltrating lymphocytes (TIL) were analyzed by flow cytometry and immunohistochemistry. Those analyses showed that, in TNBC, levels of C16:0-ceramide are positively correlated with the proportion CD8+ TIL and negatively correlated with that of FoxP3+ Treg TIL. In order to evaluate the potential influence of SL on the topology of infiltrating lymphocytes (intratumoural versus adjacent), we compared the SL levels in tumors depicting high or low proportions of intratumoral CD8+ T cells. We observed higher levels of sphingosine-1-phosphate (S1P) in low infiltrated intratumoral CD8+ T cells. Our observations suggest that C16:0-ceramide production could favor CD8+ T cell recruitment in TNBC, whereas S1P could act as an immune escape factor, negatively impacting on CD8+ TIL topology in mammary tumours. Our whole work indicates that a set of specific SL could constitute original biomarkers in TNBC. Moreover, reprogramming SL metabolism could improve (i) the infiltration of tumours by lymphocytes, both in terms of quality and quantity, and (ii) possibly, the efficacy of immunotherapy in breast cancer.