La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative progressive et irréversible. Une étape précoce de la MA est la relâche neuronale excessive du peptide amyloïde-[bêta] (A[bêta]), qui s'accumule dans le cerveau, s'assemble et se dépose sous forme de plaques A[bêta] insolubles et neurotoxiques. L'A[bêta] est produit suite au clivage amyloïdogénique de la protéine APP, effectué par les sécrétases [bêta] et [gamma] au niveau des endosomes. Il est bien connu que le trafic intracellulaire de l'APP affecte son clivage. L'étude du trafic intracellulaire de cette protéine est donc cruciale pour comprendre ce qui régit la production d'A[bêta]. Certains membres de la famille des récepteurs de lipoprotéines de faibles densités (LDLR), dont SorLA/LR11, interagissent avec l'APP et modulent son clivage en régulant son trafic et/ou en s'associant avec les sécrétases. LRP10, un nouveau membre peu connu des LDLR, trafique entre le Golgi et les endosomes, tout comme SorLA/LR11. Conséquemment, nous avons émis l'hypothèse selon laquelle LRP10 serait un nouveau récepteur de la protéine APP, impliqué dans la régulation du trafic et du clivage de cette dernière ainsi que dans la relâche d'A[bêta]. Nos résultats démontrent que LRP10 et la protéine APP colocalisent au TGN (trans-Golgi network ) et interagissent de façon directe.La surexpression stable de LRP10 dans les cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y, provoque une accumulation de la forme mature de l'APP, ainsi qu'une diminution de son clivage et de la production d'A[bêta].La déplétion de LRP10, par la technique d'ARN interférant, provoque l'augmentation de la production d'A[bêta]. De plus, l'expression d'un mutant de LRP10, redistribué aux endosomes précoces, induit la redistribution intracellulaire de l'APP au niveau de ces mêmes endosomes dans les cellules HeLa et SH-SY5Y, tel qu'observé en microscopie confocale.La surexpression stable du mutant de LRP10 dans les SH-SY5Y a aussi démontré une augmentation du clivage amyloïdogénique de l'APP normalement effectué aux endosomes et donc une augmentation de la production d'A[bêta]. Enfin, la comparaison des niveaux d'expression protéique de LRP10 retrouvés dans le cortex frontal et l'hippocampe de cerveaux de patients âgés sains ou atteints de la MA, révèle que l'expression de LRP10 est réduit dans le cerveau des patients atteints de la MA. En conclusion, LRP10 est un nouveau récepteur de l'APP participant à son triage entre le TGN et les endosomes, protégeant ainsi l'APP du clivage amyloïdogénique et de l'accumulation d'A[bêta]. Ainsi, la réduction de l'expression de LRP10 dans le cerveau pourrait augmenter la production de l'A[bêta] et représenter un facteur de risque dans la MA.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La peau est un organe se trouvant à l’interface de notre organisme et de notre environnement. Ellesubit un vieillissement qui se traduit par des modifications affectant ses différentes couches. Parmi celles-cile derme est particulièrement affecté. Les fibroblastes, présents dans le derme, synthétisent des moléculesde la matrice extracellulaire ainsi que des enzymes de dégradation. Lors du vieillissement, cette sécrétionest modifiée favorisant ainsi la sécrétion d’enzymes et la dégradation du derme. L’un des objectifs de ces travaux de thèse est d’évaluer les modifications ayant lieu chez les fibroblastes lors du vieillissement. Pour cela, trois modèles de vieillissement de fibroblastes primaires dermiques humains ont été développés et caractérisés. Une étude transcriptomique a été réalisée par PCR quantitative en temps réel et a permis de mettre en évidence des différences d’expression de gènes codant pour des composants du derme. Dans le but de développer des actifs cosmétiques à visée « anti-âge », des extraits riches en polysaccharides ont été réalisés à partir de plantes et de microorganismes, puis leur efficacité a été évaluée sur des modèles de peaux humaines. L’appareil de Golgi est un organite jouant un rôle majeur dans la modification post-traductionnelle et la sécrétion. La modification structurale de celui-ci lors du vieillissement a été évaluée sur les modèles de fibroblastes en utilisant des techniques de microcopie optique et électronique. Les résultats montrent une altération de la morphologie du réseau trans-golgien chez les fibroblastes sénescents, l’un des modèles développés au cours de ces travaux. Chez ces cellules, le TGN présente une morphologie particulière qui s’étend dans le cytoplasme. Ainsi, lors de la sénescence, nous avons pu révéler par le biais d’une étude transcriptomique que l’expression de gènes impliqués dans la structure et la fonctionnalité de l’appareil de Golgi étaient modifiée. Les résultats obtenus lors de cette thèse ont permis de mettre en évidence de nouveaux marqueurs biologiques innovants pour le criblage d’actifs dermo-cosmétiques à visée «anti-âge». / Skin is an important organ of the human body representing a protective structure in direct contactwith the external environment. During aging, skin undergoes dramatic changes including alteration ofdermal cells and components. Among these, fibroblasts synthetize and secrete a large variety ofcomponents and degrading enzymes involved in the modulation of dermal structure and functions. It isestablished that modification of the secreted components and enzymes during aging is related to dermisdegradation. This work aims to characterize aging-related alteration in fibroblasts. For this purpose, three aged human dermal primary fibroblast models have been developed. A transcriptomic study, using real-time quantitative PCR, has also been undertaken and has shown modifications in the expression of genesencoding dermal proteins. Using these results and in order to develop “anti-aging” cosmetic ingredients, extracts from polysaccharides-rich plant and microbial cells have been prepared and their efficiency evaluated on skin explants.As the Golgi apparatus is a major organelle of the secretory pathway, its structural organization has been investigated in fibroblasts using microscopy. The data show a marked alteration of trans-Golgi network morphology in aged cells. In contrast to its small and compact structure in young cells, the trans-Golgi network displays a large and expanded configuration in senescent cells. In addition, a transcriptomic analysis reveals that the expression of some genes, related to Golgi shape and/or function, is significantly modified in senescent cells. These genes could be then, used as innovating targets for the screening of novel dermo-cosmetic products with anti-aging activity.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de mortalité dans les pays industrialisés. L'hypercholestérolémie constitue un facteur de risque majeur pour les MCV. Elle est caractérisée par des niveaux élevés de lipoprotéines de faible densité (LDL, aussi appelé “mauvais cholestérol”). La présence prolongée de haut niveaux de LDL dans la circulation augmente le risque de formation de plaques athérosclérotiques, ce qui peut conduire à l'obstruction des artères et l'infarctus du myocarde. Le LDL est normalement extrait du sang par sa liaison au récepteur du LDL (LDLR) qui est responsable de son endocytose dans les hépatocytes. Des études génétiques humaines ont identifié PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) comme le troisième locus responsable de l'hypercholestérolémie autosomique dominante après le LDLR et son ligand l’apolipoprotéine B-100. PCSK9 interagit avec le LDLR et induit sa dégradation, augmentant ainsi les niveaux plasmatiques de LDL. Les mutations gain de fonction (GF) de PCSK9 sont associées à des niveaux plasmatiques élevés de LDL et à l'apparition précoce des MCV, alors que les mutations perte de fonction (PF) de PCSK9 diminuent le risque de MCV jusqu’à ~ 88% grâce à une réduction du LDL circulant. De ce fait, PCSK9 constitue une cible pharmacologique importante pour réduire le risque de MCV. PCSK9 lie le LDLR à la surface cellulaire et/ou dans l'appareil de Golgi des hépatocytes et provoque sa dégradation dans les lysosomes par un mécanisme encore mal compris. Le but de cette étude est de déterminer pourquoi certaines mutations humaines de PCSK9 sont incapables de dégrader le LDLR tandis que d'autres augmentent sa dégradation dans les lysosomes. Plusieurs mutations GF et PF de PCSK9 ont été fusionnées à la protéine fluorecente mCherry dans le but d'étudier leur mobilité moléculaire dans les cellules hépatiques vivantes. Nos analyses quantitatives de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) ont montré que les mutations GF (S127R et D129G) avaient une mobilité protéique plus élevée (> 35% par rapport au WT) dans le réseau trans- Golgien. En outre, nos analyses quantitatives de recouvrement de fluorescence inverse après photoblanchiment (iFRAP) ont montré que les mutations PF de PCSK9 (R46L) avaient une mobilité protéique plus lente (<22% par rapport au WT) et une fraction mobile beaucoup plus petite (<40% par rapport au WT). Par ailleurs, nos analyses de microscopie confocale et électronique démontrent pour la toute première fois que PCSK9 est localisée et concentrée dans le TGN des hépatocytes humains via son domaine Cterminal (CHRD) qui est essentiel à la dégradation du LDLR. De plus, nos analyses sur des cellules vivantes démontrent pour la première fois que le CHRD n'est pas nécessaire à l'internalisation de PCSK9. Ces résultats apportent de nouveaux éléments importants sur le mécanisme d'action de PCSK9 et pourront contribuer ultimement au développement d'inhibiteurs de la dégradation du LDLR induite par PCSK9. / Coronary heart diseases (CHD) are a leading cause of death in Western societies. Hypercholesterolemia is a major risk factor for CHD. It is characterized by high levels of circulating low-density lipoprotein cholesterol (LDL, also called "bad cholesterol"). The prolonged presence of elevated levels of LDL in the circulation increases the risk of formation of atherosclerotic plaques, which can lead to obstruction of arteries and myocardial infarction. LDL is normally cleared from the blood through the binding of its sole protein constituent apolipoprotein B100 to hepatic LDL receptor (LDLR), which mediates its endocytosis in the liver. Human genetic studies have identified PCSK9 as the third gene responsible of autosomal dominant hypercholesterolemia after LDLR and its ligand apolipoprotein B100. PCSK9 interacts with the LDLR and induces its degradation thereby causing plasma LDL levels to rise. PCSK9 gain-of-function (GOF) mutations are associated with elevated plasma LDL levels and premature CHD while PCSK9 loss-offunction (LOF) mutations reduce the risk of CHD up to ~88% owing to reduction of circulating LDL. Accordingly, PCSK9 is recognized as a major pharmacological target to lower the risk of CHD. PCSK9 binds the LDLR at the cell surface and/or in the Golgi apparatus of hepatocytes and causes its degradation in lysosomes by a mechanism not yet clearly understood. The goal of this study was to determine why some human PCSK9 mutations fail to induce LDLR degradation while others increase it in lysosomes. Several PCSK9 LOF and GOF mutations were fused to the fluorescent protein mCherry to study their molecular mobility in living human liver cells. Our quantitative analysis of fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) showed that PCSK9 GOF mutations S127R and D129G have a higher protein mobility (>35% compared to WT) at the trans- Golgi network (TGN). Our quantitative analysis of inverse fluorescence recovery after photobleaching (iFRAP) showed that PCSK9 LOF mutation R46L presented a much slower protein mobility (<22% compared to WT) and a much slower mobile fraction (<40% compared to WT). In addition, our confocal and electron microscopy analyses demonstrate for the first time that PCSK9 is localized and concentrated at the TGN of human hepatocytes. Furthermore, our results demonstrate that PCSK9 localization in the TGN is mediated through its C-terminal cysteine and histidine-rich domain (CHRD), which is essential for LDLR degradation. Also, our live-cell analyses demonstrate for the first time that the CHRD is not required for internalization of PCSK9. These results provide important new information on the mechanism of action of PCSK9 and may ultimately help in the development of inhibitors of the PCSK9-induced LDLR degradation.

Le virus herpès simplex de type 1 (HSV 1) affecte la majorité de la population mondiale. HSV 1 cause de multiples symptômes délétères dont les plus communs sont les lésions orofaciales usuellement appelées feux sauvages. Le virus peut aussi causer des effets plus sérieux comme la cécité ou des troubles neurologiques. Le virus réside de façon permanente dans le corps de son hôte. Malgré l’existence de nombreux traitements pour atténuer les symptômes causés par HSV 1, aucun médicament ne peut éliminer le virus. Dans le but d’améliorer les connaissances concernant le cycle viral de HSV 1, ce projet cible l’étude du transport du virus dans la cellule hôte. Ce projet aura permis la collecte d’informations concernant le modus operandi de HSV 1 pour sortir des compartiments cellulaires où il séjourne. Les différentes expérimentations ont permis de publier 3 articles dont un article qui a été choisi parmi les meilleurs papiers par les éditeurs de « Journal of Virology » ainsi qu’un 4e article qui a été soumis. Premièrement, un essai in vitro reproduisant la sortie de HSV 1 du noyau a été mis sur pied, via l’isolation de noyaux issus de cellules infectées. Nous avons démontré que tout comme dans les cellules entières, les capsides s’évadent des noyaux isolés dans l’essai in vitro en bourgeonnant avec la membrane nucléaire interne, puis en s’accumulant sous forme de capsides enveloppées entre les deux membranes nucléaires pour finalement être relâchées dans le cytoplasme exclusivement sous une forme non enveloppée. Ces observations appuient le modèle de transport de dé-enveloppement/ré-enveloppement. Deuxièmement, dans le but d’identifier des joueurs clefs viraux impliqués dans la sortie nucléaire du virus, les protéines virales associées aux capsides relâchées par le noyau ont été examinées. La morphologie multicouche du virus HSV 1 comprend un génome d’ADN, une capside, le tégument et une enveloppe. Le tégument est un ensemble de protéines virales qui sont ajoutées séquentiellement sur la particule virale. La séquence d’ajout des téguments de même que les sites intracellulaires où a lieu la tégumentation sont l’objet d’intenses recherches. L’essai in vitro a été utilisé pour étudier cette tégumentation. Les données recueillies suggèrent un processus séquentiel qui implique l’acquisition des protéines UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 et possiblement ICP4 sur les capsides relâchées par le noyau. Troisièmement, pour obtenir davantage d’informations concernant la sortie de HSV 1 des compartiments membranaires de la cellule hôte, la sortie de HSV 1 du réseau trans golgien (TGN) a aussi été étudiée. L’étude a révélé l’implication de la protéine kinase D cellulaire (PKD) dans le transport post-TGN de HSV 1. PKD est connue pour réguler le transport de petits cargos et son implication dans le transport de HSV 1 met en lumière l’utilisation d’une machinerie commune pour le transport des petits et gros cargos en aval du TGN. Le TGN n’est donc pas seulement une station de triage, mais est aussi un point de rencontre pour différentes voies de transport intracellulaire. Tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension du processus complexe de maturation du virus HSV 1, ce qui pourrait mener au développement de meilleurs traitements pour combattre le virus. Les données amassées concernant le virus HSV 1 pourraient aussi être appliquées à d’autres virus. En plus de leur pertinence dans le domaine de la virologie, les découvertes issues de ce projet apportent également de nouveaux détails au niveau du transport intracellulaire. / Herpes simplex virus type 1 (HSV 1) affects the majority of the world population. HSV 1 causes various deleterious symptoms with the most common being facial mucosal lesions usually named cold sores. The virus can also contribute to more serious effects such as corneal blindness and neurological problems. The virus is permanently residing in the host body. Despite the existence of several treatments against HSV 1 symptoms, no drug is able to eliminate the virus. In order to improve knowledge of the viral cycle of HSV 1, this project focuses on the transport of the virus in the host cell. During this project we collect data to detail the modus operandi used by HSV 1 to leave cellular compartments such as the nucleus and the TGN. The different experimentations achieved during this PhD allowed the publication of three articles, including one selected as worthy of note by the editors of “Journal of virology” and a fourth article that has been submitted. Firstly, an in vitro assay that reproduces the exit of HSV 1 virus from nuclei was established via the isolation of nuclei from infected cells. We found that, as in intact cells, capsids escaped the isolated nuclei in the in vitro assay by budding through the inner nuclear membrane, accumulated as enveloped capsids between the two nuclear membranes, and were released in cytoplasm exclusively as unenveloped capsids. These observations support the de-envelopment / re-envelopment model of transport. Secondly, to identify viral players implicated in the nuclear egress of HSV 1, viral proteins associated with nuclear released capsids were investigated. HSV 1 has a multilayered morphology that includes a DNA genome, a capsid, a tegument and an envelope. The tegument represents viral proteins added sequentially on the viral particle. The sequential order and intracellular compartments where the tegument is added are the subject of intense research. The in vitro assay was used to investigate this tegumentation process. The acquired data suggest a sequential process that involved the acquisition of viral proteins UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 and possibly ICP4 on capsids released by the nucleus. Thirdly, to obtain information regarding another process of egress of HSV 1 from a membranous cellular organelle, the egress of HSV 1 from the TGN was also studied. The study revealed the implication of the cellular protein kinase D (PKD) in HSV 1 post-TGN transport. The involvement of this kinase, known to regulate the transport of small cargos, highlights the post TGN trafficking of both small and large entities (such as HSV 1) by a common machinery, in sharp contrast to earlier steps of transport. This indicates that the TGN is not only a sorting station but also a meeting point where different intracellular routes can meet. All these outcomes contribute to a better understanding of the complex maturation process of HSV 1 that could lead to the development of better tools to fight the virus. Results acquired concerning HSV 1 could also be applied to other viruses. Besides their relevance in the virology field, findings provided by this project also supply new details about cellular biology concerning intracellular transport.

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Le virus herpès simplex de type 1 (HSV 1) affecte la majorité de la population mondiale. HSV 1 cause de multiples symptômes délétères dont les plus communs sont les lésions orofaciales usuellement appelées feux sauvages. Le virus peut aussi causer des effets plus sérieux comme la cécité ou des troubles neurologiques. Le virus réside de façon permanente dans le corps de son hôte. Malgré l’existence de nombreux traitements pour atténuer les symptômes causés par HSV 1, aucun médicament ne peut éliminer le virus. Dans le but d’améliorer les connaissances concernant le cycle viral de HSV 1, ce projet cible l’étude du transport du virus dans la cellule hôte. Ce projet aura permis la collecte d’informations concernant le modus operandi de HSV 1 pour sortir des compartiments cellulaires où il séjourne. Les différentes expérimentations ont permis de publier 3 articles dont un article qui a été choisi parmi les meilleurs papiers par les éditeurs de « Journal of Virology » ainsi qu’un 4e article qui a été soumis. Premièrement, un essai in vitro reproduisant la sortie de HSV 1 du noyau a été mis sur pied, via l’isolation de noyaux issus de cellules infectées. Nous avons démontré que tout comme dans les cellules entières, les capsides s’évadent des noyaux isolés dans l’essai in vitro en bourgeonnant avec la membrane nucléaire interne, puis en s’accumulant sous forme de capsides enveloppées entre les deux membranes nucléaires pour finalement être relâchées dans le cytoplasme exclusivement sous une forme non enveloppée. Ces observations appuient le modèle de transport de dé-enveloppement/ré-enveloppement. Deuxièmement, dans le but d’identifier des joueurs clefs viraux impliqués dans la sortie nucléaire du virus, les protéines virales associées aux capsides relâchées par le noyau ont été examinées. La morphologie multicouche du virus HSV 1 comprend un génome d’ADN, une capside, le tégument et une enveloppe. Le tégument est un ensemble de protéines virales qui sont ajoutées séquentiellement sur la particule virale. La séquence d’ajout des téguments de même que les sites intracellulaires où a lieu la tégumentation sont l’objet d’intenses recherches. L’essai in vitro a été utilisé pour étudier cette tégumentation. Les données recueillies suggèrent un processus séquentiel qui implique l’acquisition des protéines UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 et possiblement ICP4 sur les capsides relâchées par le noyau. Troisièmement, pour obtenir davantage d’informations concernant la sortie de HSV 1 des compartiments membranaires de la cellule hôte, la sortie de HSV 1 du réseau trans golgien (TGN) a aussi été étudiée. L’étude a révélé l’implication de la protéine kinase D cellulaire (PKD) dans le transport post-TGN de HSV 1. PKD est connue pour réguler le transport de petits cargos et son implication dans le transport de HSV 1 met en lumière l’utilisation d’une machinerie commune pour le transport des petits et gros cargos en aval du TGN. Le TGN n’est donc pas seulement une station de triage, mais est aussi un point de rencontre pour différentes voies de transport intracellulaire. Tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension du processus complexe de maturation du virus HSV 1, ce qui pourrait mener au développement de meilleurs traitements pour combattre le virus. Les données amassées concernant le virus HSV 1 pourraient aussi être appliquées à d’autres virus. En plus de leur pertinence dans le domaine de la virologie, les découvertes issues de ce projet apportent également de nouveaux détails au niveau du transport intracellulaire. / Herpes simplex virus type 1 (HSV 1) affects the majority of the world population. HSV 1 causes various deleterious symptoms with the most common being facial mucosal lesions usually named cold sores. The virus can also contribute to more serious effects such as corneal blindness and neurological problems. The virus is permanently residing in the host body. Despite the existence of several treatments against HSV 1 symptoms, no drug is able to eliminate the virus. In order to improve knowledge of the viral cycle of HSV 1, this project focuses on the transport of the virus in the host cell. During this project we collect data to detail the modus operandi used by HSV 1 to leave cellular compartments such as the nucleus and the TGN. The different experimentations achieved during this PhD allowed the publication of three articles, including one selected as worthy of note by the editors of “Journal of virology” and a fourth article that has been submitted. Firstly, an in vitro assay that reproduces the exit of HSV 1 virus from nuclei was established via the isolation of nuclei from infected cells. We found that, as in intact cells, capsids escaped the isolated nuclei in the in vitro assay by budding through the inner nuclear membrane, accumulated as enveloped capsids between the two nuclear membranes, and were released in cytoplasm exclusively as unenveloped capsids. These observations support the de-envelopment / re-envelopment model of transport. Secondly, to identify viral players implicated in the nuclear egress of HSV 1, viral proteins associated with nuclear released capsids were investigated. HSV 1 has a multilayered morphology that includes a DNA genome, a capsid, a tegument and an envelope. The tegument represents viral proteins added sequentially on the viral particle. The sequential order and intracellular compartments where the tegument is added are the subject of intense research. The in vitro assay was used to investigate this tegumentation process. The acquired data suggest a sequential process that involved the acquisition of viral proteins UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 and possibly ICP4 on capsids released by the nucleus. Thirdly, to obtain information regarding another process of egress of HSV 1 from a membranous cellular organelle, the egress of HSV 1 from the TGN was also studied. The study revealed the implication of the cellular protein kinase D (PKD) in HSV 1 post-TGN transport. The involvement of this kinase, known to regulate the transport of small cargos, highlights the post TGN trafficking of both small and large entities (such as HSV 1) by a common machinery, in sharp contrast to earlier steps of transport. This indicates that the TGN is not only a sorting station but also a meeting point where different intracellular routes can meet. All these outcomes contribute to a better understanding of the complex maturation process of HSV 1 that could lead to the development of better tools to fight the virus. Results acquired concerning HSV 1 could also be applied to other viruses. Besides their relevance in the virology field, findings provided by this project also supply new details about cellular biology concerning intracellular transport.