Le rétrécissement aortique calcifié (RAC) est une maladie calcifiante de la valve aortique caractérisée par un remodelage fibro-calcique lentement progressif des feuillets valvulaires, et par un remodelage du ventricule gauche (VG). Il n’existe à ce jour aucun traitement pharmacologique capable de prévenir la maladie, et le seul traitement consiste en un remplacement valvulaire chirurgical ou percutané. Les objectifs de cette thèse étaient d’identifier des déterminants de la progression du RAC et du remodelage VG, d’étudier une nouvelle modalité d’évaluation de la sévérité du RAC, et d’analyser par une approche expérimentale les mécanismes initiateurs de la calcification valvulaire aortique. Les résultats de ce travail peuvent être résumés comme suit : - Le taux plasmatique de galectine-3 n’était pas associé au degré de sévérité du RAC ou au statut fonctionnel des patients. La galectine-3 n’avait pas de valeur pronostique sur la survenue d'événements liés au RAC. Les résultats observés sont en défaveur de l'utilisation de ce biomarqueur au cours de la prise en charge des patients ayant un RAC asymptomatique. - Dans une cohorte prospective de patients ayant un RAC au moins minime, le volume de graisse épicardique était indépendamment associé à un remodelage péjoratif du VG. Ce résultat suggère que la graisse épicardique pourrait être un déterminant du remodelage pathologique du VG via une interaction locale. - L’utilisation de l’imagerie de fusion a entrainé une augmentation du taux de discordance entre les paramètres de sévérité du RAC. Ce résultat était plus marqué chez les patients ayant une valve aortique bicuspide. Au regard de la classification et des seuils définissant actuellement la sévérité du RAC, et du fait de leur valeur pronostique bien démontrée, les résultats de cette étude sont en défaveur de l'utilisation de l’imagerie de fusion pour évaluer la sévérité du RAC. - L’accumulation dans le feuillet valvulaire aortique d’érythrocytes sénescents, suite à la survenue de lésions endothéliales non cicatrisées, constitue une situation délétère favorisant la différenciation des cellules valvulaires interstitielles vers un phénotype ostéoblastique et in fine le dépôt de calcium conduisant au RAC. La physiopathologie d’initiation des calcifications valvulaires et de progression du RAC est complexe et multifactorielle. La découverte de cibles thérapeutiques potentielles et l’optimisation de la prise en charge des patients ayant un RAC nécessite de combiner des études cliniques pour identifier les déterminants de la progression et de la réponse myocardique au cours du RAC, et une approche fondamentale pour caractériser les mécanismes impliqués dans la maladie. / Calcific aortic stenosis (AS) is characterized by a slowly progressive fibrocalcific remodeling of aortic valve leaflets, and by a left ventricular (LV) remodeling. There is currently no effective medical treatment capable of preventing disease progression, and the only treatment is surgical or percutaneous valve replacement. The objectives of this thesis were to identify determinants of AS progression and LV remodeling, to study a new modality of evaluation of AS severity, and to analyze through an experimental approach the initiating mechanisms of valve calcification. The results of this work can be summarized as follows: - The plasmatic level of galectin-3 was not associated with the degree of AS severity or the functional status of patients. Galectin-3 had no prognostic value for the occurrence of AS-related events. The results observed are not in favor of the use of this biomarker for the management of patients with asymptomatic AS. - In a prospective cohort of patients with at least mild AS, epicardial fat volume was independently associated with an adverse remodeling of the LV. This result suggests that epicardial fat may be a determinant of pathological LV remodeling through a local interaction. - The use of fusion imaging increased the rate of discordant AS severity parameters. This result was more pronounced in patients with a bicuspid aortic valve. Considering current classification and thresholds defining AS severity, and their well-proven prognostic value, the results of this study do not favor the use of fusion imaging to assess AS severity. - The accumulation of senescent erythrocytes in aortic valve leaflets, consecutive to unhealed endothelial injury, is a noxious condition that promotes the differentiation of valvular interstitial cells towards an osteoblastic phenotype and favor calcium deposition leading to AS. The pathophysiology of initiation of valvular calcification and AS progression is complex and multifactorial. The discovery of potential therapeutic targets and the optimization of the management of patients with AS require the combination of clinical studies to identify the determinants of AS progression and myocardial response, and a fundamental approach to characterize mechanisms involved in the disease.

Les pathologies cardiovasculaires sont le plus souvent l’aboutissement des processus liés à l’athérosclérose. Elles représentent la première cause de morbi-mortalité dans le monde et leur incidence s’accroit avec le vieillissement de la population et l’expansion de facteurs de risques comme le diabète ou l’obésité. La sténose valvulaire aortique (SVA) est la valvulopathie la plus fréquente dans les pays développés présentant de nombreux points communs avec l’athérosclérose vasculaire. En plus des facteurs de risque, les lésions valvulaires et les lésions vasculaires partagent des similitudes dans les processus physiopathologiques impliqués comme l’inflammation, la fibrose, l’angiogenèse et la calcification. Ce dernier processus apparait dans les stades avancés des pathologies liées à l’athérosclérose et joue un rôle critique via son implication dans la stabilité de la plaque ou l’épaississement des cuspides valvulaires aortiques. Les macrophages, cellules issues de la différenciation des monocytes infiltrés, jouent un rôle prépondérant dans ces lésions via les phénotypes classiques (M1) et alternatifs (M2). Néanmoins cette dichotomie ne reflète pas complètement la variété de leur plasticité et les différents phénotypes induits notamment par le microenvironnement des monocytes/macrophages (zones riches en lipides, zones riches en fer ou zones riches en calcification). Dans la valve aortique, les cellules interstitielles de valve (VIC) forment la population cellulaire la plus présente au sein de la valve aortique. Ces cellules jouent un rôle déterminant dans le maintien du tissu valvulaire, mais également dans les processus de calcification menant à la SVA. Dans un premier temps, cette thèse a pour but d’étudier la capacité des macrophages à former des ostéoclastes, cellules responsables de la dégradation de la matrice osseuse, au sein des plaques d’athérosclérose. Dans un second temps, ce travail se focalisera sur les processus de calcification de la valve aortique via l’étude du rôle de la leptine dans les calcifications valvulaires (étude a priori) puis dans une étude transcriptomique sans a priori de VIC issues de valve sténosées et non-sténosées. Nos résultats sur les macrophages montrent ex vivo que les cellules en bordure des calcifications vasculaires sont des macrophages alternatifs de type M2. In vitro, ces cellules sont incapables de se différencier en ostéoclastes et de résorber une matrice osseuse. Pour l’étude de l’effet de la leptine sur les VIC, nous montrons que la leptine sérique est plus élevée chez des patients présentant une SVA, nous confirmons que la leptine et son récepteur sont exprimés au sein des valves aortiques et que la leptine favorise la différenciation ostéoblastique des VIC de manière dépendante des voies Akt et ERK. Enfin, l’étude transcriptomique a permis de mettre en évidence une nouvelle voie métabolique dérégulée dans les VIC. Cette enzyme est sous exprimée dans les VIC issues de valves pathologiques et dans les zones calcifiées des valves aortiques sténosées. Par ailleurs, le traitement des VIC par le produit de cette enzyme en milieu procalcifiant inhibe la calcification. Cette thèse met en avant de nouveaux indices sur les processus de calcification observés dans les plaques d’athérosclérose et les valves aortiques sténosées. Ces résultats décrivent l’impossibilité des M2 à former des ostéoclastes capables de résorber les calcifications. Il sera intéressant d’étudier le phénotype des macrophages en bordure des calcifications des valves aortiques sténosées. D’autre part, il sera intéressant d’étudier l’origine de la leptine dans la valve et son mécanisme d’action sur les VIC. Enfin, ce travail a mis à jour une nouvelle voie métabolique, impliquée dans le développement des calcifications valvulaires, qui pourrait constituer une voie thérapeutique innovante dans le traitement médicamenteux de la SVA. / Cardiovascular diseases (CVD) are the most often outcome of atherosclerosis processes. CVD are the first leading cause of death rate with an increasing incidence due to ageing populations and expansion of risk factors such as diabetes mellitus or obesity. Aortic valve stenosis (AVS) is the most frequent valvulopathy in developed countries sharing common points with vascular atherosclerosis. More than only risk factors, valvular and vascular lesions share common pathophysiological processes implicated in the development of the disease such as inflammation, fibrosis, angiogenesis and calcification. This last process appears in late stages of atherosclerosis diseases and play critical roles via implication in plaque stability or thickening of the aortic valve. Macrophages are cells deriving from infiltrated monocytes, playing an important role in the inflammatory state of lesions via classical (M1) or alternative phenotypes (M2) phenotypes. Nevertheless, this dichotomy does not reflect completely the variety of their plasticity and different phenotypes induced by the microenvironment of monocytes/macrophages (lipid riche zone, iron riche zone or calcium rich zone). In the aortic valve, valvular interstitial cells (VIC) are the most prominent cell type found in the aortic valve. These cells play a major role not only in the valve tissue homeostasis but also in the calcification processes leading to AVS. In a first part, the aim of this thesis is to elucidate the ability of macrophages to differentiate into osteoclasts, cell type responsible for bone matrix remodeling, inside atherosclerosis plaques. In a second part, this work will focus on the calcification processes occurring in the aortic valve via the study of the role of leptin in valvular calcification (association study) and then in a transcriptomic analysis of VIC isolated from calcified versus non calcified aortic valves (genome-wide expression study). Our results about macrophages show that ex vivo cell surrounding vascular calcification are alternative M2 macrophages. In vitro, these cells are no able to differentiate into true osteoclasts nor to resorb calcium deposits. Concerning the role of leptin on VIC, the results show that serum leptin is higher in patients with AVS, leptin and its receptors are expressed in the aortic valves and leptin enhances the osteoblast différenciation of VIC in an Akt and ERK dependant manner. Finally, the transcriptomic analysis allowed to highlight a new pathway deregulated in VIC. This enzyme is underexpressed in VIC isolated from calcified aortic valves and in the calcified zonesAbstract4of stenosed aortic valves. Otherwise, treating VIC with the product of this enzyme in a procalcifying medium inhibits calcification processes.This thesis highlights new insights into the calcification processes occurring in atherosclerosis lesions and calcified aortic valves. These results describe that M2 macrophages cannot differentiate into osteoclasts and reverse calcification formation inside atherosclerosis plaques. In parallel, it would be interesting to study the macrophages phenotypes surrounding calcium deposits in stenosed aortic valves. Then, it will be interesting to decipher the origin of leptin and its precise mechanism of action on VIC. Finally this work points out a new metabolic pathway implicated in the development of valvular calcification which could be a medical treatment of SVA.

Le rétrécissement aortique calcifié dégénératif (RAC) représente la principale pathologie valvulaire cardiaque dans les pays occidentaux (2% à 7% de la population après 65 ans). Il n’existe, à ce jour, aucun traitement médical qui permette de stopper ou de prévenir la progression du RAC. Le seul traitement du RAC sévère est le remplacement valvulaire aortique chirurgical ou par cathétérisme (TAVI) en cas de symptômes (dyspnée,douleur thoracique ou syncope), de dysfonction ventriculaire gauche (FEVG<50%) ou de mauvaise tolérance fonctionnelle lors d’un test d’effort. À l’inverse, la prise en charge des patients asymptomatiques avec un RAC sévère est controversée devant le risque de mort subite ou de détérioration myocardique irréversible sans traitement et le risque de la chirurgie cardiaque prophylactique et des complications prothétiques. De plus, le RAC intéresse une population de plus en plus âgée où la présence de symptômes peut être difficilement évaluable et où s’associent des facteurs de risques et des comorbidités cardiovasculaires rendant la stratégie clinique de plus en plus compliquée. Enfin, il semble que parmi les patients avec un RAC serré asymptomatique, certains sont à plus haut risque d’évènements et bénéficieraient peut être d’une chirurgie plus précoce. L’identification de marqueurs de progression et pronostiques objectifs dans ce sous-groupe de patients constitue donc un enjeu très important. / Aortic valve stenosis (AS) is the most common valvular heart disease in Westerncountries AS (2%–7% of the population after 65 years old) for which valve replacement is theonly curative treatment. Current guidelines recommend surgery in patients with severe ASand either symptoms or left ventricular systolic dysfunction (LVEF<50%). However,treatment of asymptomatic patients remains controversial due, on the one side, to the riskof sudden death without preceding symptoms and irreversible myocardial dysfunction and,on the other side, to the risk of surgery and prosthetic valve complications. Identifyingsubsets of asymptomatic AS patients with preserved left ventricular ejection fraction whomay benefit from early or prophylactic surgery is therefore a critical clinical challenge.

Les lésions d’athérosclérose sont une des causes majeurs du développement de pathologies cardiovasculaires. Cette pathologie chronique à l’origine inflammatoire est caractérisée par des mécanismes moléculaires et cellulaires complexes. L’activité de minéralisation retrouvée au sein des lésions est un critère clé de l’avancée de la maladie. A l’aide d’un modèle murin d’athérosclérose accélérée et de travaux d’optimisation technique, nous avons exploré la faisabilité de l’exploitation de l’imagerie par tomographie à émission de positons au fluorure de sodium associée à l’imagerie à résonance magnétique de la pathologie dans un modèle murin d’athérosclérose accélérée. Dans ce travail nous avons mis en évidence une activité de minéralisation précoce et soutenue associée à un statut inflammatoire plus avancé chez les animaux insuffisants rénaux. Ajouté à cela, nous avons mis en place un nouveau modèle murin de rétrécissement aortique calcifié par irradiation localisée. / Atherosclerosis lesions are a leading cause of cardiovascular events. Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease including complex molecular and cellular mechanisms. Mineralization process within the atherosclerosis lesions is a key feature of the disease development. Using a mouse model of accelerated atherosclerosis and imaging optimisation study, we showed the feasability of sodium fluoride positron emission tomography combined to magnetic resonance imaging to assess molecular activity in a mouse model of accelerated atherosclerosis. We showed that uremic animals had an early and sustained mineralization activity associated to an advanced inflammatory state. Furthermore, we developped a new mouse model of calcified aortic stenosis using targeted radiation exposure.

Le rétrécissement aortique calcifie (RAC) est la valvulopathie la plus fréquente dans les pays occidentaux et touche environ 2% des sujets de plus de 65 ans. Initialement considérée comme une dégénérescence passive de la valve aortique liée à l’âge, le RAC est actuellement considéré comme une pathologie complexe et hautement régulée et qui aboutit à un épaississement et à une calcification des feuillets valvulaires aortiques. A ce jour les mécanismes initiateurs et favorisant la progression du RAC ne sont pas complètement élucidés, et d’autre part, aucun traitement ne s’est avéré efficace pour ralentir ou stopper son évolution. Le remplacement valvulaire aortique (chirurgical ou percutané) reste le seul traitement en cas de rétrécissement aortique serré. D’autre part, il n’existe aucun modèle animal fiable et reproductible du RAC permettant de mieux comprendre la physiopathologie de cette valvulopathie et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans le laboratoire, nous avons fait l’hypothèse que la dysfonction de l’endothélium valvulaire jouait un rôle important dans l’initiation et la progression du RAC, et nous souhaitons utiliser un modèle animal permettant d’évaluer l’effet de nouvelles thérapeutiques. Ce travail porte donc sur l’évaluation du rôle du système endothélinergique dans la sténose aortique calcifiée et le développement d’un nouveau modèle animal murin de RAC. Dans notre première étude, nous nous sommes intéressés au modèle de souris EgfrWa2/Wa2. Ce modèle est induit par la substitution du résidu amine glycine par une valine. Les souris EgfrWa2/Wa2 homozygotes pour la mutation voient leur activité tyrosine kinase diminuée de 90%. Ce modèle induit un épaississement fibreux des feuillets valvulaires avec peu de calcifications. Cependant, l’augmentation du flux transaortique n’est pas liée a un RAC mais a une insuffisance aortique (IA). Nous avons évalué dans ce modèle l’effet d’un régime enrichi en graisse et d’une supplémentation en vitamine D3. Malgré une augmentation des taux sériquesdu cholestérol, de la vitamine D3 et de la calcémie, nous n’avons pas observé d’augmentation de la calcification. Le modèle EgfrWa2/Wa2 reste essentiellement un modèle d’IA avec le développement d’un RAC qui reste rare ou absent. Dans notre seconde étude, nous avons évalué le rôle du système endothélinergique dans des cultures primaires de cellules valvulaires interstitielles (hVICs) et endothéliales (hVECs) humaines, prélevées lors d’un remplacement valvulaire aortique chirurgical chez des patients ayant un RAC serré. Les valves de patients traités par une intervention de Bentall ont été utilisées comme groupe contrôle. Nous avons tout d’abord observé, par RT-PCR quantitative, que les hVECs issues de valves sténosées présentaient une augmentation non significative de l’ARNm codant pour l’endothéline et une augmentation significative de l’ARNm codant pour le récepteur ET-B, ainsi qu’une diminution significative de l’enzyme de conversion de l’endothéline dans les hVECs par rapport aux hVECs issues de valves contrôles. Le récepteur ET-B était également surexprimé dans les hVICs par rapport aux valves contrôles. En revanche, nous n’avons pas retrouvé de variation d’expression du récepteur ET-A dans les hVICs. Nous avons ensuite évalué l’effet de l’endotheline-1 (ET-1) dans les hVICs. Nous avons retrouvé que les hVICs calcifient lorsqu’elles sont en présence d’ET-1. Ces données suggèrent une implication du système endothélinergique dans la calcification valvulaire aortique. Des études complémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre son implication, notamment en évaluant l’effet d’antagoniste des récepteurs de l’endothéline dans des cultures de hVICs puis dans un modèle animal fiable mimant cette pathologie. / Aortic stenosis (AS) is the most common valvulopathy in Western countries and affects approximately 2% of subjects over 65 years of age. Originally considered a passive age-related degeneration of the aortic valve, AS is currently considered a complex and highly regulated pathology that results in thickening and calcification of aortic valve leaflets. To date the mechanisms initiating and promoting the progression of AS are not completely understood and secondly, no treatment has been effective to slow or stop its evolution. Aortic valve replacement (surgical or percutaneous) remains the only treatment for severe aortic stenosis. On the other hand, there is no reliable and reproducible animal model of AS to better understand the pathophysiology of this valvulopathy and to test new therapeutic targets. In the laboratory, we hypothesized that valvular endothelial dysfunction plays an important role in the initiation and progression of AS and we wish to use an animal model to evaluate the effect of new therapeutics. This work focuses on assessing the role of the endothelinergic system in AS and the development of a novel mouse animal model of AS. First, we used the EgfrWa2/Wa2 mouse model. This model is induced by the substitution of the amino glycine residue by a valine. The EgfrWa2/Wa2 mice homozygous for the mutation have their tyrosine kinase activity decreased by 90%. This model induces fibrous thickening of the leaflets with little calcification, but the increase in transaortic flow is not related to AS but to aortic regurgitation (AR). In this model we evaluated the effect of a fat-enriched diet and vitamin D3 supplementation. Despite increased serum levels of cholesterol, vitamin D3 and serum calcium, we did not observe an increase in calcification. The EgfrWa2/Wa2 model remains essentially a model of AR whereas AS remains rare or absent. Second, we evaluated the role of the endothelinergic system in primary cultures of human interstitial valvular (hVICs) and endothelial (hVECs) cells, obtained from AS patients treated by surgical aortic valve replacement. The valves of patients treated by a Bentall procedure were used as a control group. We first observed, by quantitative RT-PCR, that stenotic valves showed an increase in mRNA encoding endothelin and for its ET-B receptor and a decrease in the endothelin converting enzyme in the hVECs compared to the control valves. The ET-B receptor was also overexpressed in the hVICs compared to the control valves. We did not find any variation in expression of its ET-A receptor in hVICs. We then assessed the effect of endothelin-1 (ET-1) in the hVICs. We found that hVICs calcify when they are in the presence of ET-1. These data suggest involvement of the endothelinergic system in aortic valve calcification. Further studies are needed to better understand its involvement, notably by evaluating the effect of endothelin receptor antagonist in hVICs cultures and then in a reliable animal model mimicking this pathology