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L’édition des ARN est une exception à la règle de la biologie moléculaire qui stipule que l’information codée par le gène se trouve fidèlement transmise à la protéine. Dans les mitochondries de plante, elle procède par conversion de centaines de cytosines en uraciles par désamination, principalement dans les ARNm. Afin de comprendre le mode de reconnaissance des cytosines par la machinerie d’édition nous avons systématiquement vérifié l’importance des nucléotides -1 et +1 entourant la cytosine cible dans l’édition des transcrits cox2 de blé. Sur cette base, les sites d'édition peuvent être classés en quatre familles: (a) dépendance du résidu +1, (b) dépendance du résidu -1, (c) dépendance des deux résidus et (d) indépendance. Nous avons d’autre part mis en évidence des effets à distance sur le taux de la réaction d’édition, montrant ainsi que certains sites ne sont pas autonomes pour la réaction. L'ensemble des observations nous révèle que le devenir des transcrits a une influence sur l'efficacité de l’édition. Pour le vérifier nous avons construit des gènes cox2 et rps10 dépourvus d'introns. L’efficacité d’édition des transcrits qui ne sont pas soumis à l'épissage est grandement réduite par rapport aux transcrits sauvages, ce qui renforce l’idée que les mécanismes de maturation doivent être interconnectés dans les mitochondries de plante. D’autre part, nous avons montré que l’édition de certains sites introniques pouvait être indispensable à la maturation des transcrits en rétablissant des structures nécessaires à l’épissage. L’exploration de la mécanistique de l’épissage des introns mitochondriaux nous a conduit à mettre au point un test de trans-épissage in organello. Ce test doit permettre de valider expérimentalement les hypothèses ayant trait à la reconnaissance des transcrits et de vérifier le rôle de l’édition dans ce mécanisme. Enfin, la mise en relation de l’édition avec d’autres phénomènes physiologiques touchant les organelles, comme la stérilité mâle cytoplasmique, nous a permis de développer une hypothèse permettant d’expliquer l’émergence et le maintien au cours de l’évolution de ce phénomène chez les plantes. Nous proposons que le conflit nucléo-cytoplasmique a constitué l’élément moteur pour l’apparition de l’édition en permettant l’installation de mutations T en C au niveau de la mitochondrie. La réponse nucléaire a été la correction de ces mutations sur l’ARN mitochondrial, aboutissant à ce que nous appelons aujourd'hui l’édition des ARN. / RNA editing is an exception to the central dogma of molecular biology which states that the information encoded by the gene is faithfully transmitted to the protein. The plant mitochondrial transcriptome undergoes hundreds of specific C-to-U changes by RNA editing, mainly in mRNAs. To understand the mechanism used by the plant to select the C targets on the transcript, we studied the role of the neighbors -1 and +1 nucleotides in wheat cox2 editing sites. Under this scheme, four different recognition patterns can be distinguished: (a) +1 dependency (b) -1 dependency (c) +1/-1 dependency and (d) no dependency on nearest neighbor residues. An important observation was that distal elements can influence the editing efficiency, indicating that some sites are not autonomous for the reaction. We propose that these results could be a consequence of the fate of transcripts during the different maturation steps. To test this hypothesis, we constructed intronless cox2 and rps10 genes. RNA editing was strongly reduced in these constructs, suggesting that efficient RNA processing may require a close interaction of factors engaged in different maturation processes. Our results on editing events in non coding region, particularly in introns, indicate that editing is essential for splicing by remodeling the secondary structure required to excise the intron. To gain insight into the splicing mechanism for scattered mitochondrial genes, we have settled an in organello trans-splicing assay. By this way, it should be possible to decipher the molecular determinants of the reaction and the eventual role of RNA editing in this process. Finally, we proposed a new hypothesis explaining the origin and evolution of RNA editing in plant mitochondria. We assume that the nucleo-cytoplasmic conflict was the driving force allowing the settlement of T-to-C mutations in the mitochondrial genome. The nuclear response was the correction of these mutations on the RNA, i.e. RNA editing.

Pour certaines espèces, les nouvelles technologies de séquençage à haut débit et les pipelines automatiques d'annotation permettent actuellement de passer du tube Eppendorf au fichier genbank en un clic de souris, ou presque. D'autres organismes, en revanche, résistent farouchement au bio-informaticien le plus acharné en leur opposant une complexité génomique confondante. Les diplonémides en font partie. Ma thèse est centrée sur la découverte de nouvelles stratégies d'encryptage de l'information génétique chez ces eucaryotes, et l'identification des processus moléculaires de décodage. Les diplonémides sont des protistes marins qui prospèrent à travers tous les océans de la planète. Ils se distinguent par une diversité d'espèces riche et inattendue. Mais la caractéristique la plus fascinante de ce groupe est leur génome mitochondrial en morceaux dont les gènes sont encryptés. Ils sont décodés au niveau ARN par trois processus: (i) l'épissage en trans, (ii) l'édition par polyuridylation à la jonction des fragments de gènes, et (iii) l'édition par substitution de A-vers-I et C-vers-T; une diversité de processus posttranscriptionnels exceptionnelle dans les mitochondries. Par des méthodes bio-informatiques, j'ai reconstitué complètement le transcriptome mitochondrial à partir de données de séquences ARN à haut débit. Nous avons ainsi découvert six nouveaux gènes dont l'un présente des isoformes par épissage alternatif en trans, 216 positions éditées par polyuridylation sur 14 gènes (jusqu'à 29 uridines par position) et 114 positions éditées par déamination de A-vers-I et C-vers-T sur sept gènes (nad4, nad7, rns, y1, y2, y3, y5). Afin d'identifier les composants de la machinerie réalisant la maturation des ARNs mitochondriaux, le génome nucléaire a été séquencé, puis je l'ai assemblé et annoté. Cette machinerie est probablement singulière et complexe car aucun signal en cis ni acteur en trans caractéristiques des machineries d'épissage connues n'a été trouvé. J'ai identifié plusieurs candidats prometteurs qui devront être validés expérimentalement: des ARN ligases, un nombre important de protéines de la famille des PPR impliquées dans l'édition des ARNs dans les organites de plantes, ainsi que plusieurs déaminases. Durant ma thèse, nous avons mis en évidence de nouveaux types de maturation posttranscriptionnelle des ARNs dans la mitochondrie des diplonémides et identifié des candidats prometteurs de la machinerie. Ces composants, capables de lier précisément des fragments d'ARN et de les éditer pourraient trouver des applications biotechnologique. Au niveau évolutif, la caractérisation de nouvelles excentricités moléculaires de ce type nous donne une idée des processus de recrutement de gènes, de leur adaptation à de nouvelles fonctions, et de la mise en place de machineries moléculaires complexes. / Thanks to new high throughput sequencing technologies and automatic annotation pipelines, proceeding from an eppendorf tube to a genbank file can be achieved in a single mouse click or so, for some species. Others, however, fiercely resist bioinformaticians with their confounding genomic complexity. Diplonemids are one of them. My thesis is centered on the discovery of new strategies for encrypting genetic information in eukaryotes, and the identification of molecular decoding processes. Diplonemids are a group of poorly studied marine protists. Unexpectedly, metagenomic studies have recently ranked this group as one of the most diverse in the oceans. Yet, their most distinctive feature is their multipartite mitochondrial genome with genes in pieces, and encryption by nucleotide deletions and substitutions. Genes are decrypted at the RNA level through three processes: (i) trans-splicing, (ii) polyuridylation at the junction of gene pieces and (iii) substitutions of A-to-I and C-to-T. Such a diverse arsenal of mitochondrial post-transcriptional processes is highly exceptional. Using a bioinformatics approach, I have reconstructed the mitochondrial transcriptome from RNA-seq libraries. We have identified six new genes including one that presents alternative trans-splicing isoforms. In total, there are 216 uridines added in 14 genes with up to 29 U insertions, and 114 positions edited by deamination (A-to-I or C-to-T) among seven genes (nad4, nad7, rns, y1, y2, y3, y5). In order to identify the machinery that processes mitochondrial RNAs, the nuclear genome has been sequenced. I have then assembled and annotated the genome. This machinery is probably unique and complex because no cis signal or trans actor typical for known splicing machineries have been found. I have identified promising protein candidates that are worth to be tested experimentally, notably RNA ligases, numerous members of the PPR family involved in plants RNA editing and deaminases. During my thesis, we have identified new types of post-transcriptional RNA processing in diplonemid mitochondria and identified new promising candidates for the machinery. A system capable of joining precisely or editing RNAs could find biotechnological applications. From an evolutionary perspective, the discovery of new molecular systems gives insight into the process of gene recruitment, adaptation to new functions and establishment of complex molecular machineries.

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Notre laboratoire a récemment découvert un mode d’expression des gènes mitochondriaux inédit chez le protozoaire biflagellé Diplonema papillatum. Outre son ADNmt formé de centaines de chromosomes circulaires, ses gènes sont fragmentés. Le gène cox1 qui code pour la sous unité I de la cytochrome oxydase est formé de neuf modules portés par autant de chromosomes. L’ARNm de cox1 est obtenu par épissage en trans et il est également édité par insertion de six uridines entre deux modules. Notre projet de recherche a porté sur une étude globale des processus post-transcriptionnels du génome mitochondrial de diplonémides. Nous avons caractérisé la fragmentation de cox1 chez trois autres espèces appartenant aux deux genres du groupe de diplonémides à savoir : Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 et Rhynchopus euleeides. Le gène cox1 est fragmenté en neuf modules chez tous ces diplonémides mais les modules sont portés par des chromosomes de taille et de séquences différentes d’une espèce à l’autre. L’étude des différentes espèces a aussi montrée que l’édition par insertion de six uridines entre deux modules de l’ARNm de cox1 est commune aux diplonémides. Ainsi, la fragmentation des gènes et l’édition des ARN sont des caractères communs aux diplonémides. Une analyse des transcrits mitochondriaux de D. papillatum a permis de découvrir quatre autres gènes mitochondriaux édités, dont un code pour un ARN ribosomique. Donc, l'édition ne se limite pas aux ARNm. De plus, nous avons montré qu’il n’y a pas de motifs d’introns de groupe I, de groupe II, de type ARNt ou d’introns impliqués dans le splicéosome et pouvant être à l’origine de l’épissage des modules de cox1. Aucune complémentarité significative de séquence n’existe entre les régions flanquantes de deux modules voisins, ni de résidus conservés au sein d’une espèce ou à travers les espèces. Nous avons donc conclu que l’épissage en trans de cox1 chez les diplonémides fait intervenir un nouveau mécanisme impliquant des facteurs trans plutôt que cis. L’épissage et l’édition de cox1 sont dirigés probablement par des ARN guides, mais il est également possible que les facteurs trans soient des molécules protéiques ou d’ADN. Nous avons élucidé les processus de maturation des transcrits mitochondriaux de D. papillatum. Tous les transcrits subissent trois étapes coordonnées et précises, notamment la maturation des deux extrémités, l’épissage, la polyadénylation du module 3’ et dans certains cas l’édition. La maturation des extrémités 5’ et 3’ se fait parallèlement à l’épissage et donne lieu à trois types d’intermédiaires. Ainsi, un transcrit primaire avec une extrémité libre peut se lier à son voisin. Cet épissage se fait apparemment sans prioriser un certain ordre temporel alors que dans le cas des transcrits édités, l’édition précède l`épissage. Ces études donnant une vue globale de la maturation des transcrits mitochondriaux ouvrent la voie à des analyses fonctionnelles sur l’épissage et l’édition chez D. papillatum. Elles sont le fondement pour finalement élucider les mécanismes moléculaires de ces deux processus post-transcriptionnels de régulation dans ce système intriguant. / Our laboratory has recently discovered an unprecedented mode of expression of mitochondrial genes in D. papillatum, a biflagellate protozoan. In addition to its mtDNA formed of hundreds of circular chromosomes, genes are fragmented. For example, the cox1 gene which encodes the subunit one of the cytochrome oxidase complex, comprises nine modules carried by nine chromosomes. The cox1 mRNA is obtained by trans-splicing and is also edited by the insertion of six uridines between two modules. My thesis project focused on the study of post-transcriptional processes in diplonemid mitochondria. We characterized the fragmentation of cox1 in three other species belonging to two diplonemids genera: Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 and Rhynchopus euleeides. The cox1 gene is fragmented into nine modules in all species but the modules are carried by chromosomes of different size and sequences from one species to another. We have shown that there are no motifs for classical introns, including spliceosomal and archaeal introns, as well as introns of group I and II, that might be implicated in the trans-splicing of cox1 modules. No significant complementarity exists between the flanking regions of two neighboring modules, nor are any conserved residues within a species or across species. We therefore concluded that the trans-splicing of cox1 in diplonemids involves a novel mechanism implicating trans rather than cis-factors. Trans-splicing and editing of cox1 probably involve guide RNAs, but it is also possible that the trans-factors are proteins or DNA molecules. The study of different species has also shown that the insertion of six uridines between two cox1 modules in mRNA is a shared trait in these diplonemids. We discovered that four other mitochondrial genes are also edited in D. papillatum and that RNA editing is not limited to mRNA. So, fragmented genes and RNA editing are common characteristics of diplonemids. We elucidated D. papillatum’s mitochondrial transcript maturation steps. All transcripts undergo three coordinated and precise processes including end processing, trans-splicing and / or editing and polyadenylation. The processing of the 5 'and 3' ends gives rise to three kinds of maturation intermediates. A primary transcript with one free end can bind to its neighbor and trans-splicing occurs without directionality. In the case of edited transcripts, editing precedes trans-splicing. These studies have prepared the ground for functional studies of trans-splicing and RNA editing with the long term goal to elucidate the molecular mechanisms involved in post-transcriptional regulation in this intriguing system.

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Notre laboratoire a récemment découvert un mode d’expression des gènes mitochondriaux inédit chez le protozoaire biflagellé Diplonema papillatum. Outre son ADNmt formé de centaines de chromosomes circulaires, ses gènes sont fragmentés. Le gène cox1 qui code pour la sous unité I de la cytochrome oxydase est formé de neuf modules portés par autant de chromosomes. L’ARNm de cox1 est obtenu par épissage en trans et il est également édité par insertion de six uridines entre deux modules. Notre projet de recherche a porté sur une étude globale des processus post-transcriptionnels du génome mitochondrial de diplonémides. Nous avons caractérisé la fragmentation de cox1 chez trois autres espèces appartenant aux deux genres du groupe de diplonémides à savoir : Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 et Rhynchopus euleeides. Le gène cox1 est fragmenté en neuf modules chez tous ces diplonémides mais les modules sont portés par des chromosomes de taille et de séquences différentes d’une espèce à l’autre. L’étude des différentes espèces a aussi montrée que l’édition par insertion de six uridines entre deux modules de l’ARNm de cox1 est commune aux diplonémides. Ainsi, la fragmentation des gènes et l’édition des ARN sont des caractères communs aux diplonémides. Une analyse des transcrits mitochondriaux de D. papillatum a permis de découvrir quatre autres gènes mitochondriaux édités, dont un code pour un ARN ribosomique. Donc, l'édition ne se limite pas aux ARNm. De plus, nous avons montré qu’il n’y a pas de motifs d’introns de groupe I, de groupe II, de type ARNt ou d’introns impliqués dans le splicéosome et pouvant être à l’origine de l’épissage des modules de cox1. Aucune complémentarité significative de séquence n’existe entre les régions flanquantes de deux modules voisins, ni de résidus conservés au sein d’une espèce ou à travers les espèces. Nous avons donc conclu que l’épissage en trans de cox1 chez les diplonémides fait intervenir un nouveau mécanisme impliquant des facteurs trans plutôt que cis. L’épissage et l’édition de cox1 sont dirigés probablement par des ARN guides, mais il est également possible que les facteurs trans soient des molécules protéiques ou d’ADN. Nous avons élucidé les processus de maturation des transcrits mitochondriaux de D. papillatum. Tous les transcrits subissent trois étapes coordonnées et précises, notamment la maturation des deux extrémités, l’épissage, la polyadénylation du module 3’ et dans certains cas l’édition. La maturation des extrémités 5’ et 3’ se fait parallèlement à l’épissage et donne lieu à trois types d’intermédiaires. Ainsi, un transcrit primaire avec une extrémité libre peut se lier à son voisin. Cet épissage se fait apparemment sans prioriser un certain ordre temporel alors que dans le cas des transcrits édités, l’édition précède l`épissage. Ces études donnant une vue globale de la maturation des transcrits mitochondriaux ouvrent la voie à des analyses fonctionnelles sur l’épissage et l’édition chez D. papillatum. Elles sont le fondement pour finalement élucider les mécanismes moléculaires de ces deux processus post-transcriptionnels de régulation dans ce système intriguant. / Our laboratory has recently discovered an unprecedented mode of expression of mitochondrial genes in D. papillatum, a biflagellate protozoan. In addition to its mtDNA formed of hundreds of circular chromosomes, genes are fragmented. For example, the cox1 gene which encodes the subunit one of the cytochrome oxidase complex, comprises nine modules carried by nine chromosomes. The cox1 mRNA is obtained by trans-splicing and is also edited by the insertion of six uridines between two modules. My thesis project focused on the study of post-transcriptional processes in diplonemid mitochondria. We characterized the fragmentation of cox1 in three other species belonging to two diplonemids genera: Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 and Rhynchopus euleeides. The cox1 gene is fragmented into nine modules in all species but the modules are carried by chromosomes of different size and sequences from one species to another. We have shown that there are no motifs for classical introns, including spliceosomal and archaeal introns, as well as introns of group I and II, that might be implicated in the trans-splicing of cox1 modules. No significant complementarity exists between the flanking regions of two neighboring modules, nor are any conserved residues within a species or across species. We therefore concluded that the trans-splicing of cox1 in diplonemids involves a novel mechanism implicating trans rather than cis-factors. Trans-splicing and editing of cox1 probably involve guide RNAs, but it is also possible that the trans-factors are proteins or DNA molecules. The study of different species has also shown that the insertion of six uridines between two cox1 modules in mRNA is a shared trait in these diplonemids. We discovered that four other mitochondrial genes are also edited in D. papillatum and that RNA editing is not limited to mRNA. So, fragmented genes and RNA editing are common characteristics of diplonemids. We elucidated D. papillatum’s mitochondrial transcript maturation steps. All transcripts undergo three coordinated and precise processes including end processing, trans-splicing and / or editing and polyadenylation. The processing of the 5 'and 3' ends gives rise to three kinds of maturation intermediates. A primary transcript with one free end can bind to its neighbor and trans-splicing occurs without directionality. In the case of edited transcripts, editing precedes trans-splicing. These studies have prepared the ground for functional studies of trans-splicing and RNA editing with the long term goal to elucidate the molecular mechanisms involved in post-transcriptional regulation in this intriguing system.

Die Genexpressionsmaschinerie in Chloroplasten und Mitochondrien und die ihrer prokaryotischen Vorläufer sind konserviert. Innerhalb eines bakteriellen Grundgerüsts entwickelte sich darüber hinaus ein komplexer RNA-Metabolismus. In der vorliegenden Arbeit wird eine neue Klasse kleiner RNAs (15-50nt) mit plastidärem und mitochondrialen Ursprung beschrieben. Diese kurzen RNAs überlappen mit Bindestellen von RNA-bindenden Proteinen, die mRNAs gegen exonukleolytischen Verdau beschützen. Diese stabilisierende Funktion wird vermutlich hauptsächlich von PPR (Pentatricopeptid repeat) Proteinen und verwandten Proteine bewerkstelligt. Die kleinen RNAs repräsentieren dabei minimale nuklease-resistente Bereiche, sogenannte RNA-Bindeprotein footprints. Solche footprints finden sich in fast jedem intergenischen Bereich, der Prozessierung aufweist. Durch transkriptomweite Untersuchungen von kleinen RNAs in Mutanten von RNA-Bindeproteinen konnte für diese eine Reihe von Bindestellen identifiziert werden. Nuklease-resistente kleine RNAs fehlen in entsprechenden Mutanten. Der Vergleich neu identifizierter Ziele einzelner RNA-Bindeproteine führte dabei zu neuen Erkenntnissen über den Mechanismus der RNA-Erkennung durch PPR Proteine. Im Gegensatz zu Plastiden befinden sich kleine RNAs in Mitochondrien überwiegend an den 3‘ Enden von Transkripten, deren Stabilität vermutlich maßgeblich von diesen RNA-Bindeproteinen beeinflusst wird. Für das chloroplastidäre Ribonukleoprotein CP31A konnte gezeigt werden, dass es an der Stabilisierung der ndhF mRNA beteiligt ist. Die Interaktion mit der ndhF mRNA, die eine zentrale Komponente des NDH-Komplexes kodiert, wird dabei über die 3‘ untranslatierte Region vermittelt. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass CP31A die Stabilität einiger antisense Transkripte beeinflusst. Weiterhin wurden zehn neue Cytidin Desaminierungungen durch die Analyse von RNA-Seq Datensätzen in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana identifiziert. / Chloroplasts and mitochondria are of endosymbiotic origin. Their basic gene expression machineries are retained from their free-living prokaryotic progenitors. On top of this bacterial scaffold, a number of organelle-specific RNA processing steps evolved. In this thesis, a novel class of organelle-specific short (15-50nt) RNAs is described on a transcriptome-wide scale. The small RNAs are found at binding sites of PPR (Pentatricopeptide repeat) and PPR-like proteins, which protect mRNAs against exonucleolytic decay. The small RNAs represent minimal nuclease resistant RNAs, so called PPR footprints. Small RNAs were identified in almost every intergenic region subjected to intergenic processing. This finding suggests that accumulation of processed transcripts in plastids is mostly due to protection by highly specific RNA-binding proteins. Small RNA sequencing identified a number of nuclease insensitive sites missing in mutants of RNA-binding proteins. Analysis of multiple small RNAs representing target sites of single PPR proteins expands the knowledge of target specificity. In mitochondria, accumulations of small RNAs predicts that at least two thirds of mitochondrial mRNAs are stabilized by RNA-binding proteins binding in their 3’UTR. In sum, small organellar RNAs turned out to be instrumental in elucidating the hitherto enigmatic intercistronic processing of organellar RNAs and allowed novel insights into the function of the dominant family of organellar RNA binding proteins, the PPR proteins. A chloroplast ribonucleoprotein CP31A is shown to be involved in stabilization of an mRNA for a central component of the NDH-complex by interaction with its 3’UTR. In addition, CP31A represents the first factor described that influences the accumulation of chloroplast antisense transcripts. Finally, ten novel plastid C to U RNA-editing sites were identified in the model plant Arabidopsis thaliana, using a novel RNA-Seq based approach.