Η ριβονουκλεάση Ρ (RNase P) είναι ένα γενικών καθηκόντων ένζυμο, το οποίο είναι υπεύθυνο για την ενδονουκλεολυτική θραύση των πρόδρομων μεταγράφων tRNA προκειμένου να παραχθούν τα 5΄ ώριμα άκρα τους. Οι περισσότερες μορφές του ένζύμου είναι ριβονουκλεοπρωτεΐνες. Δραστικότητα RNase P έχει απομονωθεί από βακτήρια, αρχαία, ευκαρυωτικά, καθώς και από υποκυτταρικά οργανίδια. Η υπομονάδα RNA των βακτηρίων καθώς και η αντίστοιχη υπομονάδα από ορισμένα αρχαία και ευκαρυωτικά παρουσιάζουν ενζυμική δραστικότητα in vitro, απουσία πρωτεΐνης, σε υψηλές ιοντικές συνθήκες. Στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται για πρώτη φορά η απομόνωση και ο μερικός καθαρισμός και χαρακτηρισμός της ριβονουκλεάσης Ρ από το αιθανολοπαραγωγό βακτήριο Zymomonas mobilis. Το ένζυμο καθαρίστηκε με ανιονανταλλακτική χρωματογραφία, και ο προσδιορισμός της ενζυμικής δραστικότητας έγινε παρουσία σημασμένου με 32Ρ προδρόμου μεταγραφήματος in vitro μορίου tRNA (ptRNA) του γονιδίου SupS1 του Schizosaccharomyces pombe. Ακολούθησαν πειράματα για την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών δράσης του ενζύμου. Πειράματα απενεργοποίησης με μικροκοκκική νουκλεάση και πρωτεΐνάση Κ έδειξαν ότι το ένζυμο για να δράσει απαιτεί την παρουσία πρωτεΐνης και RNA. Μετά από εκτεταμένη ανάλυση in silico εντοπίστηκαν δύο αλληλουχίες μεγέθους 368 nts και 462 nts, οι οποίες παρουσιάζουν ομολογία με την RNA και την πρωτεϊνική υπομονάδα της RNase P από το Escherichia coli αντίστοιχα. Κλωνοποιήθηκε το γονίδιο που κωδικοποιεί την υπομονάδα RNA της RNase P από το Z. mobilis και διαπιστώθηκε ότι είναι ενεργό μέσω πειραμάτων σάρωσης MgCl2. Τέλος μελετήθηκε η επίδραση στο ολοένζυμο αναστολέων της πρωτεϊνικής σύνθεσης όπως η νεομυκίνη, η πουρομυκίνη, η σπιραμυκίνη και το φουσιδικό οξύ, τα οποία επιλέχθηκαν λόγω της ικανότητάς τους να προσδένονται στο RNA. / -

No description available.

RNase P is a ubiquitous ribonuclease responsible for removing the 5’ leader of tRNA precursor. Bacterial RNase P contains one RNA (RPR) and one protein (RPP) subunit. However, the number of protein variants depends on the origin. The RNA subunit is the catalytic subunit that in vitro cleaves its substrate with and without the protein subunit. Therefore RNase P is a ribozyme. However, the protein subunit is indispensable in vivo. The objective of this thesis was to understand the mechanism of and substrate interaction in RPR-mediated cleavage, in particular the contributions of the two domains of RPR and the roles of the base at the -1 residue in the substrate. As model systems I have used bacterial (Eco) and archaeal (Pfu) RPRs. The TSL (T-stem-loop) region of a tRNA precursor and the TBS (TSL-binding site) in the RPR S-domain interact upon RPR-substrate complex conformation. A productive TSL/TBS-interaction affects events at the cleavage site by influencing the positioning of chemical groups and/ or Mg2+ such that efficient and correct cleavage occurs consistent with an induced fit mechanism. With respect to events at the cleavage site, my data show that the identity of the residue immediately upstream the 5’ of the cleavage site (at -1) plays a significant role for efficient and accurate cleavage although its presence is not essential. My data also show that the RPR C-domain can cleave without the S-domain. However, the presence of the S-domain increases the efficiency of cleavage but lowers the accuracy. The structure of the S-domain of Pfu RPR differs from that of Eco RPR and my data suggest that the Pfu S-domain does not affect the accuracy in the same way as for Eco RPR. It also appears that the proteins that bind to the Pfu S-domain play a role in formation of a productive TSL/TBS-interaction. It is therefore possible that the proteins of Pfu RNase P have evolved to take over the role of the S-domain with respect to the interaction with the TSL-region of the substrate.

The rate and accuracy of protein production is the main determinant of bacterial growth. Elongation Factor Tu (EF-Tu) provides the ribosome with aminoacylated tRNAs, and is central for its activity. In Salmonella enterica serovar Typhimurium, EF-Tu is encoded by the genes tufA and tufB. A bacterial cell depending on tufA499-encoded EF-Tu mutant Gln125Arg grows extremely slowly. We found evidence that this is caused by excessive degradation of mRNA, which is suggested to be the result of transcription-translation decoupling because the leading ribosome is ‘starved’ for amino acids and stalls on the nascent mRNA, which is thus exposed to Riboendonuclease RNase E. The slow-growth phenotype can be reversed by mutations in RNase E that reduce the activity of this enzyme. We found that the EF-Tu mutant has increased levels of ppGpp during exponential growth in rich medium. ppGpp is usually produced during starvation, and we propose that Salmonella, depending on mutant EF-Tu, incorrectly senses the resulting situation with ribosomes ‘starving’ for amino acids as a real starvation condition. Thus, RelA produces ppGpp which redirects gene expression from synthesis of ribosomes and favours synthesis of building blocks such as amino acids. When ppGpp levels are reduced, either by over-expression of SpoT or by inactivation of relA, growth of the mutant is improved. We suggest this is because the cell stays in a fast-growth mode. RNase E mutants with a conditionally lethal temperature-sensitive (ts) phenotype were used to address the long-debated question of the essential role of RNase E. Suppressor mutations of the ts phenotype were selected and identified, both in RNase E as well as in extragenic loci. The internal mutations restore the wild-type RNase E function to various degrees, but no single defect was identified that alone could account for the ts phenotype. In contrast, identifying three different classes of extragenic suppressors lead us to suggest that the essential role of RNaseIE is to degrade mRNA. One possibility to explain the importance of this function is that in the absence of mRNA degradation by RNase E, the ribosomes become trapped on defective mRNAs, with detrimental consequences for continued cell growth.

Η ριβονουκλεάση Ρ (RNase P) είναι ένα πανταχού παρόν ένζυμο, το οποίο θραύει ενδονουκλεολυτικά τα πρόδρομα μετάγραφα των tRNA, παράγοντας τα ώριμα 5΄ άκρα τους. Πρόσφατα, βρέθηκε πως η RNase P συμμετέχει στην μεταγραφή γονιδίων που κωδικοποιούν tRNA, rRNA και άλλα μικρά μη κωδικοποιούντα RNA. Η RNase P έχει ανιχνευθεί σε αντιπροσώπους και των τριών περιοχών της ζωής (βακτήρια, αρχαία, ευκαρυώτες), καθώς επίσης σε μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες, με μοναδική εξαίρεση το αρχαίο Nanoarchaeum equitans. Σε σχεδόν όλους τους οργανισμούς, η RNase P είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο αποτελούμενο από μία απαραίτητη RNA υπομονάδα και ποικίλο αριθμό πρωτεϊνών. Υπάρχουν μόνο δύο, πρόσφατα, αναφερόμενες εξαιρέσεις, αυτές των ανθρώπινων μιτοχονδρίων και των πλαστιδίων του φυτού A. thaliana, των οποίων η RNase P είναι αποκλειστικά πρωτεϊνικής φύσεως. Η RNA υπομονάδα είναι υπεύθυνη για την καταλυτική λειτουργία του ολοενζύμου της RNase P από τα βακτήρια, τα αρχαία και τους ευκαρυώτες. Οι πρωτεϊνικές υπομονάδες είναι απαραίτητες για την κατάλυση in vivo και παίζουν πολλούς ρόλους στη δομή και λειτουργία του ολοενζύμου. Η πυρηνική RNase P από το Dictyostelium discoideum είναι το πιο πλούσιο, σε πρωτεϊνική σύσταση, ολοένζυμο ανάμεσα στα ευκαρυωτικά ένζυμα RNase P που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα. Είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο, το οποίο αποτελείται από μια RNA υπομονάδα και οχτώ πρωτεΐνες (DRpp40, DRpp30, DRpp29, DRpp25, DRpp21, DRpp20, DPop1, DPop5). Αυτές οι πρωτεΐνες παρουσιάζουν ομοιότητες με τις ομόλογές τους από ανώτερα ευκαρυωτικά ένζυμα, όπως του ανθρώπου, ενώ παράλληλα διατηρούν ιδιοσυγκρασιακά χαρακτηριστικά. Στην παρούσα μελέτη, περιγράφουμε την κλωνοποίηση και τις ιδιότητες αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης DRpp29 με την RNA υπομονάδα της RNase P του D. discoideum. Πειράματα ηλεκτροφορητικής κινητικότητας έδειξαν, πως η DRpp29 δεσμεύεται ειδικά με την RNA υπομονάδα, ένα χαρακτηριστικό που επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με τον σχεδιασμό του μοντέλου της δομής της DRpp29. Επιπλέον, κατασκευάστηκαν μεταλλάγματα απολοιφής της DRpp29, για να μελετηθούν οι περιοχές της DRpp29 που συνεισφέρουν ή/και είναι υπεύθυνες για την άμεση αλληλεπίδρασή της με την RNA υπομονάδα. Εντοπίστηκε μια περιοχή, μεταξύ των ευκαρυωτικών ομολόγων, πλούσια σε λυσίνες και αργινίνες, η οποία φαίνεται να διευκολύνει την αλληλεπίδραση των δύο αυτών υπομονάδων. Προσδιορίσαμε, επίσης, με τη διεξαγωγή ανάλυσης αποτυπώματος και τη χρήση δεδομένων βιοπληροφορικής, τη δευτεροταγή δομή της RNA υπομονάδας της RNase P του D. discoideum. Με ανάλυση αποτυπώματος αποκαλύφθηκε, πως η DRpp29 αλληλεπιδρά με την περιοχή εξειδίκευσης (“S-domain”) της RNA υπομονάδας, δείχνοντας, ότι η DRpp29 επηρεάζει την ικανότητα δέσμευσης του υποστρώματος από το ένζυμο. Στη συνέχεια, ελέγχθη η ικανότητα της DRpp29 και των μεταλλαγμάτων της να σχηματίζουν, μαζί με την RNA υπομονάδα του E. coli, ενεργά ενζυμικά σύμπλοκα με δραστικότητα RNase P. Τέλος, ελέγχθη ο σχηματισμός ενός ελάχιστα καταλυτικού πυρήνα της RNase P του D. discoideum, με την πραγματοποίηση πειραμάτων ομόλογης ανασύστασης με την DRpp29, τον πρωτεϊνικό της συνεργάτη DRpp21 και την RNA υπομονάδα / Ribonuclease P (RNase P) is a ubiquitous enzyme, which endonucleolytically cleaves the precursor tRNA transcripts to produce their mature 5΄ ends. Recently, RNase P has been found to participate in the transcription of tRNA, rRNA and other small non-coding RNA genes. RNase P occurs in representatives of all domains of life (bacteria, archaea, eukarya), as well as in mitochondria and chloroplasts, apart from the archeon Nanoarchaeum equitans. In almost every organism, RNase P is a ribonucleoprotein complex, with one essential RNA and a multiple number of protein subunits. There are only two exceptional cases, that of the human mitochondria and the plastids from A. thaliana, whose RNase P lacks an RNA subunit. The RNA subunit is responsible for the main catalytic function of the RNase P holoenzyme in bacteria, archaea and eukarya. Protein subunits are essential for catalysis in vivo and they play multiple roles in structure and function of the holoenzyme. Dictyostelium discoideum nuclear RNase P is the most proteinaceous holoenzyme among the eukaryal RNase P studied so far. It’s a ribonucleoprotein complex, which consists of one RNA and eight protein subunits (DRpp40, DRpp30, DRpp29, DRpp25, DRpp21, DRpp20, DPop1, DPop5). These proteins display similarities with its counterparts from higher eukaryotes, such as the human enzyme, but at the same time they retain distinctive characteristics. In the present study, we report the molecular cloning and interaction details of DRpp29 and RNase P RNA. Electromobility shift assays exhibited that DRpp29 binds specifically to the RNase P RNA subunit, a feature that was further confirmed by the molecular modeling of the DRpp29 structure. Moreover, deletion mutants of DRpp29 were constructed in order to investigate the domains of DRpp29 that contribute to and/or are responsible for the direct interaction with the D. discoideum RNase P RNA. A eukaryotic specific, lysine and arginine rich region was revealed, which seems to facilitate the interaction between these two subunits. We determined the D. discoideum RNase P RNA secondary structure based on footprinting analysis and bioinformatic data. Furthermore, footprinting analysis revealed that DRpp29 interact with the specificity domain (“S-domain”) of the RNA subunit, suggesting that DRpp29 influence the enzyme’s substrate binding ability. Furthermore, we tested the ability of wild type and mutant DRpp29 to form active RNase P enzymatic particles with the E. coli’s RNase P RNA. Finally, we tested the formation of a minimal catalytic core of the D. discoideum RNase P, by performing homologous reconstitution experiments with DRpp29, its protein partner DRpp21 and the RNA subunit

Η ριβονουκλεάση Ρ (RNase P) είναι ένα πανταχού παρόν ένζυμο, το οποίο είναι απαραίτητο για την ωρίμανση του 5’ άκρου των πρόδρομων tRNA μορίων. Δρα ενδονουκλεολυτικά προκαλώντας θραύση της 5’ επιπρόσθετης οδηγού αλληλουχίας στα πρόδρομα μετάγραφα των tRNA, παράγοντας τα ώριμα μόρια. Η RNase P έχει ανιχνευθεί σε αντιπροσώπους και των τριών φυλογενετικών περιοχών (βακτήρια, αρχαία, ευκαρυώτες), καθώς επίσης σε μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες, με μοναδική εξαίρεση το αρχαίο Nanoarchaeum equitans και το υπερθερμόφιλο βακτήριο Aquifex aeolicus. Σε όλους σχεδόν τους οργανισμούς, η RNase P είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο αποτελούμενο από μία απαραίτητη RNA υπομονάδα και ποικίλο αριθμό πρωτεϊνών. Στη βιβλιογραφία μέχρι τώρα έχουν αναφερθεί μόνο δύο εξαιρέσεις, αυτές των ανθρώπινων μιτοχονδρίων και των πλαστιδίων του φυτού A. thaliana, των οποίων η RNase P είναι αποκλειστικά πρωτεϊνικής φύσεως. Η RNA υπομονάδα είναι υπεύθυνη για την καταλυτική λειτουργία του ολοενζύμου της RNase P από τα βακτήρια, τα αρχαία και τους ευκαρυώτες. Οι πρωτεϊνικές υπομονάδες είναι απαραίτητες για την κατάλυση in vivo και παίζουν ποικίλους ρόλους στη δομή και λειτουργία του ολοενζύμου. Η παρούσα διπλωματική εργασία έχει ως σκοπό την λειτουργική μελέτη επί των υπομονάδων του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου της RNase P από τον μυξομύκητα Dictyostelium discoideum. Η πυρηνική RNase P από το D. discoideum είναι το πιο πλούσιο, σε πρωτεϊνική σύσταση (πυκνότητα επιπολής, 1.23 g/ml), ολοένζυμο ανάμεσα στα ευκαρυωτικά ένζυμα RNase P που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα. Είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο, το οποίο αποτελείται από μια RNA υπομονάδα και οχτώ πρωτεΐνες (DRpp40, DRpp30, DRpp29, DRpp25, DRpp21, DRpp20, DPop1, DPop5). Αυτές οι πρωτεΐνες παρουσιάζουν ομοιότητες με τις ομόλογές τους από ανώτερα ευκαρυωτικά ένζυμα, όπως του ανθρώπου, ενώ παράλληλα διατηρούν ιδιοσυγκρασιακά χαρακτηριστικά. Στην παρούσα μελέτη, περιγράφουμε την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνικών υπομονάδων DRpp30 και DPop5 μεταξύ τους, καθώς και με την RNA υπομονάδα της RNase P του D. discoideum. Συγκεκριμένα μελετήθηκε ο ενδεχόμενος σχηματισμός ενός ελάχιστα καταλυτικού πυρήνα της RNase P με την διεξαγωγή πειραμάτων ομόλογης ανασύστασης με την RNA υπομονάδα παρουσία των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών DRpp30 και DPop5. Επίσης πραγματοποιήθηκαν πειράματα αλλαγής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA). Ακολούθησαν πειράματα ανάλυσης αποτυπώματος (Footprinting Analysis) αλλά και πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης (co-immunoprecipitation) των πρωτεϊνών, έτσι ώστε να υπάρξουν παραπάνω δεδομένα για τις μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις. Τα παραπάνω αποτελέσματα θα συμβάλλουν στην συνολική μελέτη του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου της RNase P από τον D. discoideum. / Ribonuclease P (RNase P) is a ubiquitous enzyme, found in representatives of all domains of life (bacteria, archaea, eukarya), as well as in subcellular organelles, that endonucleolytically cleaves all precursor tRNA transcripts to produce their mature 5΄ ends. In almost every organism, RNase P is a ribonucleoprotein complex, with one essential RNA and one to ten protein subunits. RNase P from Dictyostelium discoideum is the most proteinaceous holoenzyme among the eukaryal RNase Ps studied so far and is comprised of an RNA and eight probable protein subunits (DPop1, DPop5, DRpp20, DRpp21, DRpp25, DRpp29, DRpp30 and DRpp40) as revealed by sequence similarity. Herein, we present preliminary functional studies in the interaction between the protein subunits DPop5 and DRpp30, as well as with the RNA subunit of RNase P from D. discoideum. Particularly we investigated if these protein subunits with the RNA subunit could form a minimal consensus RNase P core, conducting reconstitution assays with the RNA subunit in the presence of the recombinant proteins DPop5 and DRpp30. Furthermore using Electrophoretic mobility shift assays, EMSAs, footprinting analysis and co-immunoprecipitation assays we studied thoroughly the interactions between the recombinant proteins and with the RNA subunit, in aim to discover possible areas of interaction on the RNA subunit. Our data will give new insights and expand our knowledge about the ribonucleoprotein complex of RNase P from the slime mold Dictyostelium discoideum.

No description available.

Human papillomavirus (HPV) related cervical cancer is still the most common gynaecological malignancy in developing countries and, as yet, there is no alternative to surgery for the treatment of HPV-associated pre-malignant lesions. HPV 'hijacks' the host-cell ubiquitin-proteasome system to degrade the p53 and Rb tumour suppressor proteins which in turn, leads to the development of cancer. Previous studies have shown that the HIV protease inhibitor lopinavir selectively inhibits the chymotryptic-like activity of the 26S proteasome which stabilises p53 and induces the apoptosis of HPV positive cervical carcinoma cells. Based on this it was hypothesised that lopinavir treatment of HPV positive cervical carcinoma cells would produce changes in the levels of a wide range of cellular proteins that are dis-regulated by HPV-related activation of the proteasome. In order to address this, antibody microarray screening was carried out on lopinavir treated and control untreated HPV positive SiHa cervical carcinoma cells. This showed lopinavir induced alterations in 51 proteins including the cellular antiviral defence protein RNase L. Lopinavir induced both a dose and time dependent increase in RNase L which was subsequently confirmed by western blotting. Transient siRNA silencing of RNase L expression reduced the lopinavir-dependent toxicity in SiHa cells, suggesting an important role for this protein in the toxicity of lopinavir in HPV infected cells. SiHa cells were much more sensitive to lopinavir than CaSKi cervical carcinoma cells which had much higher levels of the E6 protein and did not up regulate RNase L. Furthermore, lopinavir treated HPV16 E6/E7 immortalised keratinocytes were also shown to up regulate RNase L protein expression and these cells were much more sensitive to lopinavir induced apoptosis than mortal control keratinocytes. In addition, transient expression of RNase L in RNase L-deficient C33A cells and the same cells stably transfected with HPV16 E6 (C33AE6) demonstrated that E6 protected these cells from RNaseL-induced cell death. Surprisingly, analysis of RNase L protein levels in these cells demonstrated that E6 did not induce the degradation of the RNase L protein. Instead it was found that E6 stabilised the interaction between RNase L and its endogenous inhibitor protein, ABCE1, and that lopinavir de-stabilised this interaction. Given that C33A tumour cells, E6/E7 immortalised keratinocytes and hTert immortalised keratinocytes are all sensitive to lopinavir, this implies that this compound does not specifically target HPV immortalised cells but rather targets immortalised cells in general, regardless of how this was achieved. The optimum concentration of lopinavir for all these effects was 25 μM, which is 15-fold higher than is observed in cervico-vaginal secretions following oral dosing with the drug Kaletra. In conclusion these results have confirmed the potential of lopinavir to treat HPV related pre-cancerous cervical lesions and provided at least part of the mode-of-action. Indeed they strongly support the use of lopinavir as a low-cost, self-applied topical alternative to surgery for this disease which will be of particular benefit in low-resource countries. Finally, the ability of lopinavir to induce apoptosis of non-HPV related immortalised cells merits further investigation since this indicates this drug may be useful for the treatment of other non HPV related pre-malignant conditions.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第22605号 / 生博第438号 / 新制||生||58(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 杉田 昌彦, 教授 藤田 尚志, 教授 朝長 啓造 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

No description available.