Dentre os vários microrganismos que fazem parte de microecossistemas de solos, as bactérias do gênero Burkholderia apresentam-se de interesse por possuírem amplo potencial agrícola e biotecnológico. São portadores de uma infinidade de características, como por exemplo: promotoras de crescimento em plantas com a fixação biológica do nitrogênio e produção de fitormônios, supressores de algumas doenças, biorremediadores, agentes de biocontrole e produtores de biopolímeros. Descrito por Yabuuchi et. al. (1992), o gênero ainda precisa ser melhor caracterizado, pois sua taxonomia vem sendo modificada de tal forma que novos componentes estão sendo frequentemente propostos, especialmente pela identificação de novos nichos ecológicos e sua ação no ambiente. No Parque Nacional de Caxiuanã - Pará, Amazônia Oriental, os solos de origem antropogênica denominados Terra Preta Arqueológica (TPA) são caracterizados pelos elevados materiais orgânicos, que se auto-sustentam. Neste estudo, a diversidade do gênero Burkholderia foi avaliada por meio de técnicas microbiológicas (cultivo) e moleculares, como a Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE) com sequências iniciadoras específicas para o gênero, usando o gene 16S rRNA. Os fragmentos amplificados foram analisados pelo sequenciador automático ABI 3100, com o intuito de gerar informações sobre as principais espécies de Burkholderia presentes em sítios de TPA e comparados com as espécies encontradas em solo de floresta nativa natural, adjacente à TPA. Apesar da maior estabilidade e presença de matéria orgânica em sítio TPA, os resultados revelam que as espécies do gênero Burkholderia são numericamente superiores em solo de floresta nativa natural, vindo a confirmar que aspectos físico-químicos (ex. pH) e a vegetação predominante nas áreas de estudo afetam diretamente na composição das comunidades microbianas. Algumas estirpes encontradas destacam-se pelo seu papel funcional no solo, muitas delas comumente associadas à fixação biológica de nitrogênio. Foram encontradas as espécies Burkholderia silvatlantica, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia nodosa, Burkholderia terrae, Burkholderia hospita / Amongst the various microorganisms from soil microecossystems, the genus Burkholderia has been studied since several properties have been discovered more recently, with high potential for agricultural and biotechnological exploitation. Species from this genus have infinite features, e.g. plant growth promoter with biological nitrogen fixation and production of phytohormones, capability for suppression of some diseases, bioremediation, biological control and production of biopolymers. Described by Yabuuchi et al. (1992), the genus still needs to be better characterized, since its taxonomy is frequently modified and several new species have been proposed, especially after recent identification of new ecological niches and their action in the environment. In the National Park of Caxiuanã at the Eastern Amazon region are found anthrosols with past anthropogenic activity, constructed by the pre-historic Amerindians. These anthrosols are known as Archaeological Dark Earth (ADE) which has high and stable concentration of organic matter, thus keep their self-sustainability due to this high soil fertility. In this study, the diversity of genus Burkholderia was evaluated by means of microbiological (bacterial cultivation) and the molecular technique Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) using short and specific sequences designed for this genus, using the gene 16S rRNA. The amplified fragments from TPA were automated sequenced (ABI 3100) and the ADE diversity was compared with a pristine forest soil, located adjacent to TPA. Although the high stability and organic matter content in the ADE, the results showed a greater number of species from the genus Burkholderia in the pristine forest soil, located at the surrounding of the TPA soil. These data indicate that physical-chemical parameters (e.g. pH) and the prevalent vegetation in the studied areas can affect directly the structure of the microbial communities. Some strains could be distinguished by their functional role in soil, such as those associated with the ability for biological nitrogen fixation. The main species were Burkholderia silvatlantica, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia nodosa, Burkholderia terrae, Burkholderia hospita

Os manguezais tropicais são considerados um dos ecossistemas mais produtivos do mundo, sendo caracterizados pela alta taxa de ciclagem de matéria orgânica e nutrientes que ocorre entre os oceanos e os ambientes terrestres. Embora os manguezais sejam considerados áreas de proteção ambiental, a destruição desses ambientes é progressiva, devido a atividades industriais e portuárias nos estuários. Nos manguezais, a ciclagem de nutrientes está diretamente relacionada às atividades e a diversidade das comunidades microbianas presentes no solo. Este trabalho está inserido em um projeto mais amplo dentro do programa BIOTA/FAPESP, no que tange aos estudos da biodiversidade no Estado de São Paulo e utilização dessa biodiversidade de modo sustentável. O objetivo deste trabalho foi avaliar as estruturas e diversidade das comunidades de Bacteria, Archaea e Fungi presentes no solo de manguezal preservado da Ilha do Cardoso-SP. As amostras foram analisadas pelas técnicas de T-RFLP, ARISA, clonagem e seqüenciamento a fim de obter uma caracterização das estruturas das comunidades microbianas de uma área de manguezal preservado em comparação com os ambientes adjacentes de restinga e floresta e também a um manguezal antropizado. Os resultados permitiram concluir que o manguezal possui características exclusivas, com a presença de organismos distintos, revelando um possível potencial biotecnológico a ser explorado. Adicionalmente, os dados revelaram que a ação antrópica afetou as estruturas dessas comunidades de modo a ser notada uma sensível diminuição de diversidade no manguezal antropizado, evidenciando, dessa maneira, a importância da preservação desse ecossistema / The tropical mangroves are considered one of the most productive ecosystems of the world, being characterized by the high tax of organic matter and recycling of nutrients, that happens between the oceans and the terrestrial habitats. Although the mangroves are considered areas of environmental protection, the destruction of those ecosystems is progressive, due to industrial and port activities in the estuaries. In mangroves, the recycling of nutrients is directly related to the activities and to the diversity of microbial communities present in the soil. This work is part of a wider project inside of the program BIOTA/FAPESP, with respect to the studies of the biodiversity in the State of São Paulo and use of that biodiversity in a maintainable way. The objective of this work was to evaluate the structures and diversity of communities of Bacteria, Archaea and Fungi present in the soil of preserved mangrove of Ilha do Cardoso-SP. The samples were analyzed by T-RFLP and ARISA techniques, cloning and sequencing in order to obtain a characterization of the microbial communities structure of preserved mangrove area in comparison with the adjacent environments of restinga (tropical moist forest) and forest and also to a degraded mangrove. The results allowed concluding that the mangroves present exclusive characteristics, with the presence of distinct organisms, revealing a possible biotechnological potential to be explored. Additionally, the data revealed that the human action affected the structures of those communities in a way to be noticed a sensitive diversity decrease in the degraded mangrove, evidencing, this way, the importance of the ecosystem preservation

Os manguezais tropicais são considerados um dos ecossistemas mais produtivos do mundo, sendo caracterizados pela alta taxa de ciclagem de matéria orgânica e nutrientes que ocorre entre os oceanos e os ambientes terrestres. Embora os manguezais sejam considerados áreas de proteção ambiental, a destruição desses ambientes é progressiva, devido a atividades industriais e portuárias nos estuários. Nos manguezais, a ciclagem de nutrientes está diretamente relacionada às atividades e a diversidade das comunidades microbianas presentes no solo. Este trabalho está inserido em um projeto mais amplo dentro do programa BIOTA/FAPESP, no que tange aos estudos da biodiversidade no Estado de São Paulo e utilização dessa biodiversidade de modo sustentável. O objetivo deste trabalho foi avaliar as estruturas e diversidade das comunidades de Bacteria, Archaea e Fungi presentes no solo de manguezal preservado da Ilha do Cardoso-SP. As amostras foram analisadas pelas técnicas de T-RFLP, ARISA, clonagem e seqüenciamento a fim de obter uma caracterização das estruturas das comunidades microbianas de uma área de manguezal preservado em comparação com os ambientes adjacentes de restinga e floresta e também a um manguezal antropizado. Os resultados permitiram concluir que o manguezal possui características exclusivas, com a presença de organismos distintos, revelando um possível potencial biotecnológico a ser explorado. Adicionalmente, os dados revelaram que a ação antrópica afetou as estruturas dessas comunidades de modo a ser notada uma sensível diminuição de diversidade no manguezal antropizado, evidenciando, dessa maneira, a importância da preservação desse ecossistema / The tropical mangroves are considered one of the most productive ecosystems of the world, being characterized by the high tax of organic matter and recycling of nutrients, that happens between the oceans and the terrestrial habitats. Although the mangroves are considered areas of environmental protection, the destruction of those ecosystems is progressive, due to industrial and port activities in the estuaries. In mangroves, the recycling of nutrients is directly related to the activities and to the diversity of microbial communities present in the soil. This work is part of a wider project inside of the program BIOTA/FAPESP, with respect to the studies of the biodiversity in the State of São Paulo and use of that biodiversity in a maintainable way. The objective of this work was to evaluate the structures and diversity of communities of Bacteria, Archaea and Fungi present in the soil of preserved mangrove of Ilha do Cardoso-SP. The samples were analyzed by T-RFLP and ARISA techniques, cloning and sequencing in order to obtain a characterization of the microbial communities structure of preserved mangrove area in comparison with the adjacent environments of restinga (tropical moist forest) and forest and also to a degraded mangrove. The results allowed concluding that the mangroves present exclusive characteristics, with the presence of distinct organisms, revealing a possible biotechnological potential to be explored. Additionally, the data revealed that the human action affected the structures of those communities in a way to be noticed a sensitive diversity decrease in the degraded mangrove, evidencing, this way, the importance of the ecosystem preservation

Considerando a dieta como um fator modulador do microbioma ruminal, neste trabalho objetivou-se investigar o impacto do bagaço da cana-de-açúcar sobre a composição e funcionalidade das espécies microbianas residentes no rúmen de carneiros (Ovis aries). Foram utilizados seis animais machos fistulados de O. aries, dos quais três foram alimentados com uma dieta composta por 70% de volumoso e 30% de concentrado (tratamento controle) e outros três animais alimentados com uma dieta similar a anterior, mas com 14% do volumoso substituído por bagaço de cana-de-açúcar (tratamento bagaço). O conteúdo ruminal (líquido e fibra) foram amostrados quinzenalmente durante 60 dias. A partir dessas amostras foram acessadas a estrutura e a composição da comunidade microbiana pela extração de DNA total e amplificação das regiões V3 e V6-V7 do gene 16S rRNA bacteriano e a região intergênica fúngica (ITS2). Além disso, foram feitas análises metagenômicas e metatranscriptômicas de comunidade microbianas enriquecidas em fibra ruminal para identificar enzimas lignocelulolíticas expressas. As frações líquida e fibrosa do conteúdo ruminal de O. aries revelaram uma comunidade bacteriana dominada principalmente por Bacteroidetes e Firmicutes ao longo de todo período experimental. Dois gêneros, Prevotella e Ruminococcus representaram 20% e 4% da comunidade bacteriana ruminal, respectivamente. Para a comunidade fúngica o filo Neocallimastigomycota representou 91% das sequências e os principais gêneros deste filo foram Piromyces, Neocallimastix, Orpinomyces, Anaeromyces, Caecomyces e Cyllamyces aderidos a fibra ruminal. O gênero Caecomyces, foi significativamente mais abundante na fibra ruminal de animais que se alimentaram de bagaço de cana-de açúcar. Além disso, foi observado um aumento significativo na frequência de enzimas como, por exemplo, 1,4-α-glucano, α-galactosidase, endo 1,4-β-xilanase, β- xilosidase, xilose isomerase, celobiose fosforilase e α-N-arabinofuranosidase no tratamento com bagaço de cana-de-açúcar. Considerando que a recuperação de enzimas a partir de comunidades microbianas naturalmente selecionadas para a degradação de biomassa é uma estratégia promissora para superar a atual ineficiência da ação enzimática na produção industrial de biocombustíveis, os resultados deste trabalho representam a possibilidade de aumentar a capacidade de recuperação ou descoberta de enzimas a partir de ruminantes, ou ainda, a possibilidade de manipular a estrutura do microbioma do rúmen para usá-lo como fonte de inóculo enriquecido em processos industriais de degradação de biomassa. / Considering the diet as a modulator of ruminal microbiome, this work aimed to investigate the impact of sugarcane bagasse on the composition and function of microbial species residents in the sheep (Ovis aries) rumen. Six cannulated male animals were used in the experiment, where three individuals were fed on a diet consisting of 70% forage and 30% concentrate (control treatment), and three were fed on a similar diet, but with sugarcane bagasse replacing 14% of the forage portion (bagasse treatment). The ruminal content (i.e., liquid and fiber) were sampled every two weeks during 60 days. From these samples, the structure and composition of the microbial community were assessed by total DNA extraction and amplification of V3 and V6-V7 regions of 16S rRNA gene from bacteria and the fungal intergenic region (ITS2). Furthermore, metagenomics and metatranscriptomics approaches were used to evaluate the enrichment of specific members of the microbial community in the ruminal fiber and genes related to lignocellulolytic enzymes. The liquid and fiber fractions of the O. aries rumen revealed a microbial community dominated mainly by Firmicutes and Bacteroidetes throughout the experimental period. The genera Prevotella and Ruminococcus accounted for 20% and 4% of the bacterial community of rumen, respectively. In the fungal community, the phylum Neocallimastigomycota accounted for 91% of sequences and its main genera adhered on the ruminal fiber were Piromyces, Neocallimastix, Orpinomyces, Anaeromyces, Caecomyces and Cyllamyces. The genus Caecomyces was significantly more abundant in the ruminal fiber in animals fed on sugarcane bagasse. Furthermore, there was a significant increase in the frequency of enzymes, such as α-1,4-glucan, α-galactosidase, endo- 1,4-β-xylanase, β-xylosidase, xylose isomerase, cellobiose phosphorylase and α- Narabinofuranosidase in the bagasse treatment. Considering that the recovery of enzymes from ecosystems naturally evolved for degradation of biomass is a promising strategy to overcome the current inefficient enzymatic action in industrial production of biofuels, the results of this study bring great possibilities to increase the discovery and or recovery of enzymes from ruminants, as well as the possibility of the ruminal microbiome structure manipulation to be used as source of an enriched inoculum for biomass degradation in industrial processes.

Micoplasmas e ureaplasmas têm sido isolados de pequenos ruminantes, mas existem poucos estudos. O Mycoplasma ovine/caprine sorotipo 11, conhecido como cepa 2D, ainda não classificado como espécie, vem sendo relacionado a casos de vulvovaginite e problemas reprodutivos em ovinos e caprinos. Os ureaplasmas apresentam a habilidade em induzirem doenças no trato genital, confirmada por inoculações experimentais de isolados obtidos de animais doentes em animais saudáveis, resultando em moderada granularidade e hiperemia na vulva. Estes ureaplasmas não receberam ainda a designação de espécie, sendo apenas conhecidas suas características sorológicas, nas quais é fundamentada a classificação em nove sorotipos, sendo o IX relacionado a infertilidade e aborto em ovelhas. Este trabalho teve como objetivo o isolamento de micoplasmas e ureaplasmas do trato reprodutivo de fêmeas e machos das espécies caprina e ovina e tipificação genotípica dos isolados por meio de PFGE e sequenciamento do gene 16S rRNA. Foram obtidos 20 isolamentos de ureaplasma no trato reprodutivo de fêmeas e machos da espécie ovina, um isolamento de micoplasma e sete com crescimento misto de micoplasma e ureaplasma. Nas fêmeas da espécie caprina foram obtidos cinco isolamentos, sendo quatro de ureaplasma e um de micoplasma. Dos isolados submetidos a PFGE , 11 de origem ovina resultaram em oito diferentes perfis confirmando a capacidade da técnica em tipificar ureaplasma de origem ovina. O sequenciamento do gene 16S rRNA, analisado pelo UPGMA, permitiu agrupar seis isolados ao Ureaplasma diversum ATCC 49782, e quatro não foram agrupados com nenhuma outra espécies de ureaplasma, quando utilizado o ponto de corte 97%. Em nosso estudo, os isolados de ovino e caprino agrupados às referências de U. diversum não permite concluir que sejam da mesma espécie. A utilização do gene 16S rRNA gera grande quantidade de informações úteis para inferências filogenéticas e pode ser a primeira escolha na investigação de novas espécies. Técnicas filogenéticas como sequenciamento do espaço intergênico 16S-23S rRNA, e gene da urease podem auxiliaram futuramente na classificação dos isolados obtidos de ovino e caprino. / Mycoplasmas and or ureaplasmas have been isolated from small ruminants but are few studied. Mycoplasma ovine/caprine serotype 11, known as 2D strain, has not been classified yet as specie. However, it has been associated to vulvovaginitis and reproductive disorder in caprine and ovine. Ureaplasmas may cause genital tract diseases. Experimental infections with isolates recovered from sick animals resulted in granularity and hyperemia of the vulva. These have not been designated as specie but are divide in nine serological characteristics types. The serotype IX is associated to infertility and abortion in sheep. The present study aims the isolation of mycoplasmas and ureaplasmas from reproductive tract of ovine and caprine, genotyping of isolates by PFGE, and sequencing of their 16S rRNA. Ureaplasma isolates were recovered from the reproductive tract of 20 ovine, being them, male and female. Mycoplasma was isolated alone in one sample. A mixture of mycoplasma and ureaplasma was obtained in seven samples. On the material obtained from female caprine, five isolations were performed. Four of them were ureaplasma and one was a mycoplasma. Eleven isolates from ovine showed eight distinct profiles at PFGE, confirm that the method can typify ovine origin ureaplasmas. Six isolates were grouped to the Ureaplasma diversum ATCC 49782, through the sequencing of their 16S rRNA using the UPGMA. However, when using a 97% cutoff, four isolates could not be grouped to none of the ureaplasma specie. The isolates from ovine and caprine grouped to U. diversum, do not allow conclude that they are all the same specie. The use of 16S rRNA sequencing showed many useful information to phylogenetic inference, and can be the first choice for when investigating new species. Phylogenetic techniques, as sequencing of the intergenic space 16S-23S rRNA and urease gene, can be used to help the classification of new ureaplasma isolates from ovine and caprine.

Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2018-07-24T16:47:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Silvia Ap F Albuquerque.pdf: 2057064 bytes, checksum: ca90a9ed638cc415e9baf99ff0b848ab (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-24T16:47:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Silvia Ap F Albuquerque.pdf: 2057064 bytes, checksum: ca90a9ed638cc415e9baf99ff0b848ab (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Rizobactérias promotoras do crescimento vegetal (PGPR) estimulam o desenvolvimento das plantas hospedeiras, e a planta, por sua vez, em conjunto com as condições de cultivo, têm um significativo efeito sobre a estrutura da comunidade bacteriana da rizosfera. Nesse estudo, foi analisada a diversidade de rizobactérias isoladas de milho inoculado com diferentes biofertilizantes e cultivado na presença de diferentes doses de nitrogênio. Além disso, foi avaliado o perfil dos isolados por espectrometria de massa e o potencial de tais isolados na produção de sideróforos, protease, compostos indólicos, cianeto e celulase e na solubilização de fosfato; atividades relacionadas à promoção do crescimento vegetal. Os setenta e sete isolados bacterianos obtidos a partir do uso de cinco diferentes meios de cultivo (JMV, JNFb, NFb, LGI e LGI-P) livres de amônia, foram identificados pelo sequênciamento parcial do gene 16S rRNA. O biofertilizante e as dosagens de nitrogênio não interferiram significativamente na composição da comunidade de bactérias diazotróficas isoladas da rizosfera de milho. O meio JNFb permitiu o isolamento de um número maior de indivíduos, e esses apresentaram maior riqueza e diversidade. Dentre os isolados, houve a predominância das classes β e γProteobacteria, sendo Burkholderia o gênero mais abundante. A análise por espectrometria de massa mostrou potencial para separar gêneros bem representados em nível de estirpe. Mais da metade dos isolados produziram sideróforos (58%) e protease (50,7%); solubilização de fosfatos (36,2%) e aproximadamente um quarto deles (23,1%) foram capaz de produzir celulase. A produção de cianeto de hidrogênio se mostrou bastante rara, sendo detectada em apenas 4,3% dos isolados, todos pertencentes ao gênero Pseudomonas sp. Todas as bactérias analisadas apresentaram ao menos uma atividade e 55% apresentam três ou mais. Análises de componentes principais indicaram que (1) os gêneros Burkholderia sp. e Luteibacter sp., tem correlação significativa (p <0,05 ou p<0,001) com a produção de protease, sideróforos e solubilização de fosfato, (2) Bacillus sp. e Luteibacter sp., com produção de compostos indólicos e celulase e (3) Pseudomonas sp., com produção de protease, cianeto e sideróforos, compostos indólicos e celulase. Diante da demanda de biofertilizantes de gramíneas capazes de substituir parcialmente ou integralmente o uso de fertilizantes químicos, os isolados que apresentaram diversas atividades promotoras do crescimento vegetal se mostram promissores para aplicação como biofertilizante. / Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) stimulate the development of their host plant, and the plant, in turn, together with the culture conditions has a significant effect on rhizospheric bacterial community structure. In this study, the diversity of cultivable bacteria associated with the rizosphere of maize inoculated with different biofertilizers and growth in different nitrogen doses was analyzed. It was also evaluated the mass spectrometry profile of the isolates and their potential to produce siderophores, protease, indole compounds, cyanide and cellulose, and to solubilize phosphate, all activities related to plant growth promotion. The seventy seven bacterial isolates obtained by the use of five different nitrogen-free media (JMV, JNFb, NFb, LGI e LGI-P) were identified by partial sequencing of the 16S rRNA gene. The biofertilizers and the nitrogen doses did not interfere in the composition of the isolated diazotrophs from maize rhizosphere. JNFb medium permitted the isolation of a greater number of individuals, and they presented the highest richness and diversity. Among the isolates, there was a predominance of β e γ-Proteobacteria classes, being Burkholderia the most abundant genus. Mass spectrometry analysis showed potential to separate well represented genus into strain, evidencing new species of the Burkholderia genus. More than half of the isolates produced siderophores (58%) and protease (50.7%); solubilize phosphate (36.2%) and approximately a quarter of them (23.1%) were able to produce cellulase. The hydrogen cyanide production showed to be rare, being detected in only 4.3% of isolates, all belonging to the genus Pseudomonas sp.. All analyzed bacteria showed at least one activity and 55% showed three or more. Principal component analysis indicated that (1) Burkholderia sp. e Luteibacter sp. genus have significant correlation (p <0,05 or p<0,001) with protease and siderophores production and phosphate solubilization, (2) Bacillus sp. and Luteibacter sp. have significant correlation with indole compounds and cellulase production and (3) Pseudomonas sp. has significant correlation with protease, cyanide, siderophores, indole compounds and cellulase production. Based on the demand for grass biofertilizers able to partially or completely replace chemical fertilizers, the isolates which have several activities that promote plant growth are promising to be used as biofertilizer. Some genus clearly they share at least three equal activities featuring redundant function among them.

Neste trabalho desenvolvemos métodos analíticos e moleculares para a detecção, isolamento e classificação filogenética de Alicyclobacillus spp. a partir de sucos de laranja e frutos ácidos, pelas técnicas: RT-PCR, nested RT-PCR, RAPD, seqüenciamento do 16S rRNA e análise por métodos eletroforéticos. A sensibilidade na detecção dos A. acidoterrestris foi melhorada por meio de reações de nested RT-PCR, utilizando primers internos (amplicon de 191 bp) que foram desenhados a partir do primeiro amplicom de 294 bp. O limite de detecção foi estudado com as reações RT-PCR e nested RT-PCR, sendo capazes de detectar concentrações de 0,1 UFC mL-1 para culturas puras e 2 UFC mL-1 em sucos de laranja artificialmente inoculados. A inibição de esporos de A. acidoterrestris também foi estudada para monitorar a diminuição da viabilidade com tratamento térmico e Sapindus saponaria (200 mg L-1), utilizando RT-PCR e nested RT-PCR. Com o tratamento térmico de 99 oC por 1 h o grau de inibição dos esporos foi de 96,3%. Enquanto que, com a fração purificada de S. saponaria (200 mg L-1) incubada à 45 oC por 2 dias foi de 93,6%, mas com incubação de 99 oC por 1 h foi de 98,7%, na mesma concentração de saponina. Todas as análises de quantificação de produtos de RT-PCR e nested RT-PCR foram analisadas por meio de eletroforese em gel de agarose e eletroforese capilar em microchip no Bioanalyzer 2100 (Agilent), com os kits DNA 500 e DNA 1000 LabChip®, obtendo-se maior sensibilidade nos microchips. A classificação molecular de dezenove cepas, isoladas a partir de diferentes sucos e frutos ácidos, foram estudadas utilizando RAPD-PCR e eletroforese capilar em microchips. Utilizando cinco primers aleatórios nas reações de RAPD, foi possível estudar os polimorfismos analisados nos microchips. Segundo as análises eletroforéticas, as cepas de suco concentrado e diluído de laranja (1, 2, 6) suco concentrado de limão (lim) e suco de laranja in natura (T2, T3), apresentaram similaridades genéticas com a A. acidoterrestris. O estudo de análise filogenética baseada na comparação de seqüências de DNA da região variável do gene 16S rRNA de Alicyclobacillus acidoterrestris, foi utilizado para identificar e agrupar onze cepas isoladas de superfícies e sucos de frutos ácidos. Na árvore filogenética gerada pelo método neighbor joining e bootstrap 1000x, as cepas analisadas mostraram similaridades de 99% entre todas elas, observando-se uma maior similaridade do controle A. acidoterretris (C2) com a cepa isolada de suco concentrado de limão (lim), e uma boa discriminação entre controles das espécies A. acidocaldarius, A. cicloheptanicus, A. sendaiensis e Sulfobacillus acidophilus. / In this work, we developed analytical and molecular methods for detection, isolation and phylogenetic classification of Alicyclobacillus spp. from orange juice and acid fruits using RT-PCR, nested RT-PCR, RAPD and sequencing of 16S rRNA techniques and electrophoretic methods of analysis. The sensitivity on the detection of A. acidoterrestris in orange juice was improved by nested RT-PCR, using internal primers (amplicon of 191 bp) that were designed after sequencing the first amplicon (294 bp). The detection limit was studied with RT-PCR and nested RT-PCR assay, it was able to detect concentrations of 0.1 UFC mL-1 for media culture and 2 UFC mL-1 in inoculated orange juice. The inhibition in spores from A. acidoterrestris was also studied to monitoring the diminution of viability with heat treatment and Sapindus saponaria (200 mg mL-1), using RT-PCR and nested RT-PCR assays. The inhibition by heat treatment at 99 oC for 1 h was 96.3%. However, incubation with S. saponaria at 45 oC for 2 days inhibited 93,6%, however, with incubation of 99 oC for 1 h was 98,7%, in the same concentration of saponin. The quantification of the RT-PCR and nested RT-PCR amplification product were accomplished by capillary electrophoresis in microchips using the Bioanalyzer 2100 in conjunction with the LabChip (TM) DNA 500 and DNA 1000. The molecular classification of nineteen strains isolated from different juice and acidic fruit, were studied using RAPD-PCR and capillary electrophoresis in microchips. Using five random primers in the RAPD assay, it was possible to study the polymorphisms analyzed in microchips. According to electrophoresis analyses, the strains from concentrated and diluted orange juices (1, 2, 6), lemon concentrated juice (lim) and natural orange juice (T2, T3), showed genetic similarities with the A. acidoterrestris. The study of the phylogenetic analyses based on DNA comparison sequences of the variable region of 16S rRNA gene from Alicyclobacillus acidoterrestris, was utilized for the identification and grouping of eleven strains isolated from surface and juice of acid fruits. In the phylogenetic tree produced by neighbor joining and bootstrap 1000, the strains showed similarities of 99% among all strains, showing a high similarity of A. acidoterrestris with a strain isolated from lemon concentrate juice (lim), and a good discrimination between the species A. acidocaldarius, A. cycloheptanicus, A. sendaiensis and Sulfobacillus acidophilus.

Currently, we observe a growing number of researches that seek to unravel the causes, effects and possible biotechnological uses of the rhizosphere microbiota communities modulation in the complex interactions between plants and soil. We also know that the attack of herbivorous insects is a factor of considerable damage to agriculture and that has well established evolutionary relationships in natural systems. The present work tried to test some hypotheses about the direct connection between the rhizosphere microbiota and the insect pest attack. Beginning from the point that plants have well- established defense mechanisms against insects, it was verified that the rhizosphere microbiota seems to contribute actively to this system and thus to establish holobionte relationships. We had broad access to communities of the fungi and bacterial domain, through the new generation sequencing for rRNA 16S gene, region V3, and intergenic region ITS amplicons on soil, semi-soil and, insect gut samples from pest insects with general behavior (Order: Lepidoptera). Our results from the data analysis to Illumina Miseq sequencing outputs and, additional experiments, resulted in three articles presented here in chapters. In the first chapter, we discuss the modulating effect from the pest insect attack (Spodoptera frugiperda), on the Arabidopsis thaliana microbiota rhizosphere, for different physiological plant\'s stages. As a result, it was possible to discuss the differences between the modulation in the structure of bacterial communities and the modulation in the structure of the fungal communities after the attack of herbivorous insects. In the second chapter, we highlight the difference in the modulation of the bacterial community structure for different plant families. We used seedlings of Arabidopsis thaliana, Zea mays Sh2, Faseolus vulgaris, Solano lycopersicum and, Beta vulgaris exposed to the attack of Trichoplusia ni for one week. The rhizosphere microbiota analysis for each host plant groups, suggests that the influence of the plant species should be considered on the bacteria rhizosphere communities modulation after the insect attack. Besides, specific plant species may be less susceptible to rhizosphere modulation by insect attack. Another highlight was the microbiota rhizosphere effect in the biomass loss for plants sown on transplanted semi-soil. Based on the phenotypic data, we suggest the rhizosphere microbiota modulation after the herbivore may be involved in the plant biomass inhibition on the next seedlings generation. Finally, in the third chapter, we explore the Trichoplusia ni gut microbiota modulation through the microbial load obtained in the restricted feeding. The T. ni larvae from the same original population were divided into three populations. Each population was fed individually and restrictively with leaves of A. thaliana, S. lycopersicum or artificial caloric diet. We accessed the gut microbiota in T. ni after three generations of restricted feeding, and we verified that the gut microbiota in caterpillars of general behavior, could be altered due the obtaining of microbial load through alimentary diet. This modulation may be related to the degradation of metabolites that may be harmful to insect homeostasis. The gut microbiota of each population can also directly influence the food preferences of successive generations. In summary, all our results presented in each one of the chapters are important points that can help to clarify the complex relationships between plants/insects/microorganisms and, contributing to a better understanding of this holobiont system. / Atualmente observamos um crescente número de pesquisas que buscam desvendar as causas, os efeitos e as possíveis utilizações biotecnológicas da modulação de comunidades da microbiota de rizosfera nas interações complexas entre plantas e solo. Sabemos também que o ataque de insetos herbívoros é um fator de considerável prejuízo para a agricultura e que tem relações evolutivas bem estabelecidas em sistemas naturais. O presente trabalho procurou testar algumas hipóteses a cerca da relação direta entre a microbiota de rizosfera e o ataque de insetos praga. Partindo do ponto de que plantas possuem mecanismos de defesa contra insetos, bem conhecidos, foi verificado que a microbiota de rizosfera parece contribuir ativamente para esse sistema, e assim estabelecer relações holobiontes. Tivemos um profundo acesso á comunidades do domínio bactéria e fungi, através da tecnologia de sequenciamento de nova geração para amplicons do gene RNAr 16S, região V3 e região intergênica ITS em amostras de solo, semi- solo e intestino de insetos praga (Ordem: Lepidoptera) de comportamento generalista. Nossos resultados, resultaram em três artigos aqui apresentados em capítulos. No primeiro capítulo é discutido o efeito modulador da herbívora da praga agrícola Spodoptera frugiperda na microbiota de rizosfera de Arabidopsis thaliana em diferentes estágios fisiológicos da planta. Como resultados foi possível perceber que o efeito na modulação da estrutura de comunidades de bactérias é diferente do efeito na modulação de comunidades de fungos após o ataque de insetos herbívoros. Os efeitos são diferentes tanto em abundância relativa quando na diversidade para cada um dos domínios de microrganismos estudados. No segundo capítulo destacamos a diferença na modulação da estrutura de comunidades de bactérias para diferentes famílias de plantas. Utilizamos mudas de A. thaliana, Zea mays Sh2, Phaseolus vulgaris, Solanum lycopersicum e Beta vulgaris, expostas ao ataque de Trichoplusia ni durante uma semana. As análises da microbiota de rizosfera de cada um dos grupos de plantas hospedeiras, sugere que a influência da espécie vegetal deve ser considerada na modulação das comunidades de bactérias da rizosfera após a herbívora. Adicionalmente, determinadas espécies de plantas podem ser menos susceptíveis a modulação da rizosfera pela herbívora. Outro destaque foi o efeito da modulação da microbiota de rizosfera, na perda de biomassa de plantas semeadas em semi-solo transplantado. Com base nos dados fenotípicos das diferentes espécies de plantas avaliadas, sugerimos que a modulação da microbiota de rizosfera após a herbívora, pode estar envolvida na inibição da produção de biomassa vegetal na geração seguinte de plântulas. Por fim, no terceiro capítulo exploramos a modulação na microbiota no intestino de larvas de Trichoplusia ni através da carga microbiana obtida na alimentação restrita. Larvas T. ni de mesma origem foram divididas em três populações. Cada população foi alimentada de forma específica e restrita com folhas de A. thaliana ou S. lycopersicum ou dieta artificial calórica. Acessamos a microbiota do intestino das larvas, após três gerações de alimentação restrita e verificamos que a microbiota intestinal em lagartas de comportamento generalista, pode ser alterada devido à obtenção de carga microbiana por via alimentar. Essa modulação pode estar relacionada a degradação de metabólitos que podem ser prejudiciais à homeostase dos insetos. A microbiota intestinal de cada população também pode influenciar diretamente as preferências alimentares de gerações sucessivas. Em resumo, todos os nossos resultados, apresentados em cada um dos capítulos a seguir, são chaves no conhecimento e podem ajudar a clarificar as complexas relações entre plantas, insetos e microrganismos. Contribuindo assim para um maior entendimento desse tipo de sistema holobionte.

Τα ισόποδα αποτελούν τη μοναδική τάξη οργανισμών ανάμεσα σε όλα τα Καρκινοειδή που πέτυχε να εποικήσει όλους τους τύπους ενδιαιτημάτων, από τα βάθη των ωκεανών μέχρι τα βουνά, τις έρημους και τις τροπικές περιοχές. Παρόλα αυτά, οι φυλογενετικές σχέσεις εντός της τάξης των ισοπόδων παραμένουν σε πολλά σημεία ασαφείς. Η οικογένεια Tylidae, που περιλαμβάνει 27 αμφίβια είδη, ανήκει σύμφωνα με τη σημερινή συστηματική κατάταξη στην υπόταξη Oniscidea, τη μοναδική που περιλαμβάνει αντιπροσώπους με χερσαίο ή ημι-χερσαίο τύπο διαβίωσης. Αν και υπάρχουν αμφιβολίες ως προς τη μονοφυλετική προέλευση αρκετών από τις 9 υποτάξεις που περιλαμβάνουν θαλάσσιους αντιπροσώπους, η προέλευση των Oniscidea θεωρείται αδιαμφισβήτητα μονοφυλετική. Εντούτοις, δεν υπάρχει ακόμη συμφωνία ως προς την ακριβή τοποθέτηση του κλάδου των Tylidae στο φυλογενετικό δέντρο των Oniscidea. Ο βασικός στόχος της παρούσας εργασίας ήταν ο προσδιορισμός των φυλογενετικών σχέσεων των αμφιβίων ισοπόδων της οικογένειας Tylidae με τα υπόλοιπα ισόποδα, με έμφαση στις σχέσεις με τα υπόλοιπα Oniscidea. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν μοριακοί δείκτες από 14 γένη ισοπόδων, τα οποία αντιπροσωπεύουν όλους τους τύπους διαβίωσης, από τον αποκλειστικά θαλάσσιο έως τον αποκλειστικά χερσαίο. Η πειραματική προσέγγιση περιλάμβανε τον πολλαπλασιασμό αλληλουχιών του πυρηνικού γονίδιου 18s rDNA και των μιτοχονδριακών 16s rDNA και COI με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμέρασης (PCR), τον προσδιορισμό της αλληλουχίας τους και τη φυλογενετική ανάλυσή τους με μεθόδους μέγιστης φειδωλότητας, μέγιστης πιθανοφάνειας και μπεϊεσιανής συμπερασματολογίας. Οι μιτοχονδριακές αλληλουχίες εμφανίζουν πολύ υψηλά ποσοστά νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων, και σε συνδυασμό με τη χαμηλή αξιοπιστία των δέντρων που παράγονται φαίνεται πως έχουν απωλέσει εντελώς το φυλογενετικό τους σήμα. Η αλληλουχία του 18s rDNA έχει μήκος 2400-3400 bp και αποτελείται από 4 συντηρημένες περιοχές και 3 υπερ-μεταβλητές. Για τις φυλογενετικές αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν μόνο οι συντηρημένες περιοχές, που συνιστούν ένα σύνολο 1597 διακριτών χαρακτήρων. Στα αποτελέσματα από όλες τις υπολογιστικές μεθόδους η οικογένεια Tylidae τοποθετείται στο τελικό δέντρο σε αδελφό κλάδο του τάξου Crinochaeta της υπόταξης Oniscidea. Εντούτοις, παρατηρήθηκε πως η οικογένεια Ligiidae τοποθετείται σε κλάδο μη-συγγενικό προς τα υπόλοιπα χερσαία ισόποδα, υπονοώντας πως η υπόταξη Oniscidea δεν είναι μονοφυλετική. Για να ελέγξουμε αυτήν την υπόθεση, χωρίσαμε τα δεδομένα μας σε αλληλουχίες από θαλάσσιους και σε αλληλουχίες από χερσαίους αντιπροσώπους, πραγματοποιώντας ένα σύνολο από πρόσθετες αναλύσεις. Από τα αποτελέσματα φαίνεται πως η υπόταξη Oniscidea είναι μονοφυλετική και η αντίθετη αρχική υπόθεση οφείλεται σε ‘θόρυβο’ στο φυλογενετικό σήμα των συντηρητικών περιοχών του 18s rDNA. Τέλος, από τις πρόσθετες αναλύσεις προκύπτουν, με ισχυρή στατιστική στήριξη, φυλογενετικά δέντρα που υποστηρίζουν τη συστηματική κατάταξη που είχε προτείνει ο Erhard από τις μορφολογικές του μελέτες, τοποθετώντας τα Tylidae εντός του τάξου ‘Holoverticata’. / Isopods comprise a unique order among the Crustaceans that has settled effectively all possible habitats on the planet. The phylogenetic relationships, though, between the 10 suborders remain unresolved, as many of them might prove to be non-monophyletic taxa. The family Tylidae consists of 27 amphibian species and is traditionally classified in the suborder Oniscidea, which includes all the terrestrial and semi-terrestrial isopods and that is thought to be unambiguously monophyletic. However, the previous phylogenetic studies have proposed many hypotheses concerning the relations between the Tylidae and the other Oniscidea, lacking any plausible consensus. In order to resolve those phylogenetic relations, we used two mitochondrial sequences (16s, COI) and one nuclear (18s) from 14 genera of isopods. Our experimental approach included PCR amplification, sequencing and computational phylogenetic analyses by means of maximum parsimony, maximum likelihood and Bayesian inference. The mitochondrial sequences present extreme values of nucleotide substitutions and evident saturation, a fact that prohibits their use in further analyses. The 18s sequences vary significantly in size (2400-3400 bp) and consist of 4 conserved and 3 hyper-variable regions. Only the conserved regions were used for analysis, resulting to a dataset of 1597 discrete nucleotide characters. Regardless of the method used, the family Tylidae appeared as a sister-clade of the taxon Crinochaeta (suborder Oniscidea) in the cladograms. We noticed, though, that the taxon Diplochaeta (Oniscidea: Ligiidae) appeared (with low bootstrap values) in a distant clade of all the other Oniscidea, a result that does not support the monophyletic origin of the Oniscidea. In order to test the validity of this result, we splitted our dataset and conducted additional, separate analyses for the sequences of the marine isopods and those of the terrestrial isopods. Our results indicate that the suborder Oniscidea is monophyletic, so the initial opposite hypothesis was due to weak phylogenetic signal. Finally, our cladograms support, with significant confidence, the systematic classification that Erhard (1998) had proposed through his studies on morphological characters of the Oniscidea, placing together the family Tylidae and the taxon Crinochaeta under the name ‘Holoverticata’.

Made available in DSpace on 2015-04-01T12:09:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4073387 bytes, checksum: 8309cf98c379c11892e9d5cd2fae29dd (MD5) Previous issue date: 2011-12-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Soil samples of native pasture (site A) and of soil cultivated with grass Paspalum conjugatum, Bergius (site B) collected from Caatinga vegetation in the semi-arid region in Paraíba state (07°23‟27 S 36°31‟58 W) were utilized for constructing four metagenomic libraries, aiming the evaluation of microbial diversity through amplification of gene 16S rRNA of domains Bacteria and Archaea. The metagenomic DNAs were extracted by utilizing FastDNA® SPIN Kit for Soil (BIO 101), which were amplified by PCR, by using universal primers 27F / 1525R (Bacteria) and 20F / 958R (Archaea). The purified fragments were linked to vector pGEM Teasy and transformed by thermal shock in chemically competent Escherichia coli DH10B. Transformants were cultivated in LB/Ampicillin medium (100 μM/ml), IPTG (800 μg/mL) and XGal (80 μg/mL) at 37ºC/18-20 h. A selection of 250 clones of each library was performed, sequenced and after discarding the low quality sequences and chimerics, 64 and 68 sequences were obtained (Bacteria) and 89 and 141 sequences (Archaea) from soils of sites A and B, respectively, which were compared to public bank of data RDB and NCBI (similarity >95%). In site A the phylum Acidobacteria (48.4%) was the most abundant, followed by phyla Bacteroidetes (10.9%), Proteobacteria (10.9%), and Firmicutes (6.3%). In site B Proteobacteria (45.6%) was the most abundant, followed by Firmicutes (10.3%), Acidobacteria (8.8%), Bacterioidetes (7.3%); and also Cyanobacteria (1.5%) and Planctomycetes (1.5%) which were not found in site A. Among the sequences obtained, 23.4% (site A) and 25.0% (site B) were not classified (similarity <95%). In the domain Archaea the phyla found were Euryarchaeota (3.4 and 45.4%) and Crenarchaeota (2.2 and 3.5%), in sites A and B, respectively; it should be observed that 94.4% and 51.1% of the sequences were not classified (similarity <95%), between sites A and B, respectively. Larger diversity (Shannon‟s índex), richness (Chao 1), and distribution (equity index) of communities were observed at species level, in the phyla Bacteria and Archaea, in both sites. The metagenomic libraries 16S rRNA of Bacteria and Archaea, when compared by using the LIBSHUFF program, differed significantly (p<0.0001). The results of the present study showed the occurrence of a great diversity of bacteria and archaea in that semi-arid environment, with peculiar features of elevated temperature and hydric limitations, emphasizing the possibility of investigations on search of new genes and/or microbial isolates with biotechnological potential. / Amostras do solo da pastagem nativa (sítio A) e sob cultivo do capim marrequinho (Paspalum conjugatum, Bergius) (sítio B), coletadas na região semi-árida do bioma Caatinga, Paraíba, (07°23‟27 S 36°31‟58 O), foram utilizadas para construção de quatro bibliotecas de clones metagenômicos, para avaliação da diversidade microbiana pela amplificação do gene 16S rRNA dos domínios Bacteria e Archaea. Os DNA metagenômicos foram extraídos utilizando FastDNA® SPIN Kit for Soil (BIO 101), os quais foram amplificados por PCR utilizando primers universais, 27F / 1525R (Bacteria) e 20F / 958R (Archaea). Os fragmentos purificados foram ligados ao vetor pGEM Teasy e transformados por choque térmico em Escherichia coli DH10B quimicamente competente. Os transformantes foram cultivados em meio Agar LB/Ampicilina (100 μ/mL), IPTG (800 μg/μL) e XGal (80 μg/μL), a 37ºC/18-20 h. Foram selecionados 250 clones de cada biblioteca os quais foram sequenciados e após descarte das sequências de baixa qualidade e quiméricas, foram obtidas 64 e 68, 89 e 141 sequências para Bacteria e Archaea, nos solos dos sítios A e B, respectivamente, as quais foram comparadas em banco de dados públicos RDB e NCBI (≥95% de similaridade). No sítio A o filo Acidobacteria (48,4%) foi o mais abundante, seguido dos filos Bacteroidetes (10,9%), Proteobacteria (10,9%), e Firmicutes (6,3%). No sítio B Proteobacteria (45,6%) foi o de maior destaque, seguido de Firmicutes (10,3%), Acidobacteria (8,8%), Bacterioidetes (7,3%); e ainda Cyanobacteria (1,5%) e Planctomycetes (1,5%), que não foram encontrados no sítio A. Entre as sequências geradas, 23,4% (sítio A) e 25,0% (sítio B) não foram classificadas (similaridade <95%). No domínio Archaea foram encontrados os filos Euryarchaeota (3,4 e 45,4%) e Crenarchaeota (2,2 e 3,5%), nos sítios A e B, respectivamente; destacando-se que 94,4% e 51,1% das sequências não foram classificadas (similaridade <95%), entre os sítios A e B, respectivamente. Uma maior diversidade (índice de Shannon), riqueza (índice Chao 1) e distribuição (índice de equidade) das comunidades foram observadas no nível de espécies, tanto para Bacteria como para Archaea, nos dois sítios. As bibliotecas de clones metagenômicos 16S rRNA de Bacteria e Archaea, quando comparadas, utilizando-se o programa LIBSHUFF, diferiram significativamente (p<0,0001). Os resultados desse estudo mostraram a ocorrência de uma grande diversidade de bactérias e arqueas, nesse tipo de ambiente pouco estudado e com características peculiares de temperatura elevada e limitações hídricas, com possibilidade de busca de novos genes e/ou isolados microbianos, com potencial biotecnológico.