Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-22T17:53:29Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4424231 bytes, checksum: 751c03b840d885ffe4706122e3be0086 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-22T17:53:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4424231 bytes, checksum: 751c03b840d885ffe4706122e3be0086 (MD5) Previous issue date: 2016-08-31 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Viruses of phytophatogens are present in the most diverse groups of hosts, infecting from Spiroplasma to nematode and playing an important role in the ecology of these hosts. Because of the potential as biological control agents, the discoveries about these viruses have increased which encourages the ecological management of plant diseases. In this context, this study aimed: isolate and characterize viruses that infect plant pathogenic fungi (1) and Ralstonia spp. in the Americas (2) and investigate antiviral defense mechanisms in Ralstonia spp. (3). In this thesis, three viruses were characterized at biological and molecular level. Two viruses infect bacteria, Ralstonia spp. and the third infect a fungus, Alternaria alternata. The bacterial virus displayed two propagation modes: pseudolysogenic for the RsIBR1 inovirus (Inoviridae) and lytic for the phiAP1 phikmvvirus (Podoviridae). RsIBR1 has been shown to dramatically change the phenotype of the host, while not causing cell lysis, converting the phytopathogenic R. pseudosolanacearum into a commensal bacterium. PhiAP1 was characterized as a new member of the genus Phikmvvirus, and the presence of exolisinas, in addition to the bactericidal properties and EPS degradation make this virus attractive for future proposals of the bacterial wilt management. In A. alternata, it was characterized Alternaria alternata parititivirus 1 (AtPV1), a new divergent mycovirus related to genus Gammapartitivirus. Its persistent lifestyle prevented to dissect completely the interaction, because in the absence of isogenic lineage, it is unclear whether the viral infection led to a conversion of a pathogen in a epiphytic or still if is responsible for controlling phenotypic plasticity expressed by the host. The presence of canonical CRISPR loci in Ralstonia spp. isolates suggested that, in these hosts, this system could compose the antiviral defense arsenal. However, here was demonstrated that in R. solanacearum, the CRISPR-Cas system is unable to acquire new spacers or interfere with foreign DNA, even in a state of priming. The expression of the Cas genes was not detected; indicating that Cas operon apparently is a suppressed transcriptional unit. Two genes h-ns, expressed in R. solanacearum CFBP2957 are candidates to the putative transcriptional repression of CRISPR. The BIMs (Bacteriophages Insensitive Mutants) who escaped of infection by an alternative strategy to the CRISPR, were less competent, but still permissive to viral adsorption, and were able to survive under high inoculum pressure, which excludes the presence of abortive systems. Viral replication was also not detected and sequencing of two BIMs genome revealed the presence of particular mutations in genes encoding components of the secretory and motility pathways (such as Type II and Type IV), potentially involved in the antiviral resistance. Additional analyzes are being conducted to characterize in detail this defense strategy. In conclusion, the discovery and characterization of viruses infecting phytopathogens in Brazil expand the information on this diversity, little known in America, exposes the biotechnological potential of these natural enemies and reveals the important role of these viruses in the modulation and evolutionary course of their hosts / Vírus que infectam fitopatógenos são encontrados nos mais diversificados grupos de hospedeiros, infectando desde spiroplasmas a nematóides e desempenhando papel relevante na ecologia desses hospedeiros. Graças ao potencial como agentes de controle biológico, as descobertas sobre esses vírus tem aumentado o que amplia as perspectivas do manejo ecológico de doenças de plantas. Neste contexto, este trabalho objetivou: Isolar e caracterizar vírus que infectam fungos fitopatogênicos (1) e os que infectam Ralstonia spp. no continente americano (2) e Investigar mecanismos de defesa antiviral in Ralstonia spp (3). Nesse trabalho, três vírus foram caracterizados a nível biológico e molecular. Dois deles infectam bactérias do complexo Ralstonia spp. e o terceiro infecta um fungo, Alternaria alternata. Os virus de bacterias isolados possuem dois modos de propagação distintos: pseudolisogênico, o inovírus RsIBR1 (Inoviridae) e lítico, o phikmvvirus phiAP1 (Podoviridae). RsIBR1 demonstrou ser capaz de alterar drasticamente o fenótipo do hospedeiro, convertendo a bactéria fitopatogênica R. pseudosolanacearum em uma comensal. PhiAP1 foi caracterizado como um novo membro do gênero Phikmvvirus, e a presença de exolisinas em adição as propriedades bactericida e de degradação de EPS o tornam atrativo para futuras propostas de manejo da murcha-bacteriana. Em A. alternata, foi caracterizado o Alternaria alternata parititivirus 1 (AtPV1), um novo micovírus divergente, relacionado ao gênero Gammapartitivirus. Seu estilo de vida persistente impediu dissecar por completo a interação, pois na ausência da linhagem isogênica, não foi possível confirmar se a infecção viral conduziu a uma conversão de um patógeno em um epifítico ou ainda se é responsável pelo controle da plasticidade fenotípica manifestada pelo hospedeiro. A presença de loci CRISPR canônicos entre isolados de Ralstonia spp. sugeriu que nesses hospedeiros esse sistema pudesse compor o arsenal de defesa antiviral. No entanto, aqui foi demonstrado que em R. solanacearum, o sistema CRISPR é incapaz de adquirir novos spacers ou interferir com DNA invasor, mesmo em estado de priming. A expressão dos genes Cas não foi detectada, indicando que o operon Cas aparentemente é uma unidade transcricional reprimida. Dois genes h-ns, expressos em R. solanacearum CFBP2957 são candidatos na execução da provável repressão do CRISPR. Foram obtidos BIMs (Bacteriophages Insensitive Mutants) que escaparam da infecção por uma estratégia alternativa ao CRISPR. Os BIMs foram menos competentes, mas ainda permissivos a adsorção viral, e foram hábeis para sobreviver sob alta pressão de inóculo, o que exclui a presença de sistemas abortivos. A replicação viral também não foi detectada e o sequenciamento do genoma de dois BIMs revelou a presença de algumas mutações em genes que codificam proteínas componentes das maquinarias de secreção e motilidade bacteriana (Tipo II e Tipo IV), potencialmente envolvidas com o fenótipo da resistência. Análises adicionais estão sendo conduzidas para caracterizar em detalhes essa(s) estratégia(s) de defesa. Em conclusão, a descoberta e caracterização de vírus que infectam fitopatógenos no Brasil, além de ampliar as informações sobre essa diversidade, pouco conhecida na América, expõe o potencial biotecnológico desses inimigos naturais e revela o papel relevante desses vírus na modulação e curso evolutivo dos seus hospedeiros.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-graduação em Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2012-10-21T10:43:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Polihidroxialcanoatos (PHAs) são polímeros sintetizados por vários microrganismos e armazenados na forma de reserva de energia e carbono. Sua produção se dá sob condições desfavoráveis de crescimento, como limitação de nitrogênio ou fósforo, e na presença de excesso de fonte de carbono. Polihidroxibutirato P(3HB) é o polímero mais estudado dentre os PHAs, possuindo características próximas às encontradas no polipropileno. Os PHAs chamam atenção devido à sua biodegradabilidade e possibilidade de substituição dos plásticos petroquímicos. Embora os PHAs apresentem vantagens ambientais sobre os plásticos de origem petroquímica, a sua principal desvantagem é o alto custo de produção, principalmente relativo ao substrato, recuperação e extração do polímero. A utilização de resíduos agro-industriais é uma possibilidade atrativa para a diminuição deste custo, pois o reduz com relação ao substrato. Este trabalho teve como objetivo estudar a viabilidade da utilização de melaço cítrico como substrato para a produção de PHA. Os experimentos foram conduzidos em culturas descontínuas em frascos aletados e biorreator utilizando como microrganismo produtor à bactéria Ralstonia eutropha DSM 545. O processo foi dividido em duas fases sendo a primeira um crescimento balanceado e a segunda um crescimento

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos. / Made available in DSpace on 2012-10-20T11:04:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 197135.pdf: 1218237 bytes, checksum: 2e286818cfdb73116aedefa3217cc82f (MD5) / Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) [P(3HB-co-3HV)] é um biopolímero acumulado por muitos microrganismos, como reserva de carbono e energia, em condições desbalanceadas do meio. Possui propriedades termoplásticas semelhantes às dos plásticos petroquímicos e a vantagem de ser biocompatível e completamente biodegradável. Entretanto, possui custo elevado de produção frente aos plásticos convencionais, o que limita seu uso. Diversas estratégias de produção de P(3-HB-co-3HV) por Ralstonia eutropha foram estudadas, com o objetivo de aumentar a produção de polímero, visando à redução de seus custos. A alimentação do elemento limitante, fosfato, durante a fase de produção, aumentou o acúmulo de polímero. Demonstrou-se que a melhor velocidade de produção de biomassa (rx) a ser mantida na fase de produção é de 0,02 gXr.L-1h-1. O monitoramento do potencial redox indicou as mudanças metabólicas do microrganismo e sinalizou o momento da limitação da cultura. Esta sinalização facilita o processo produtivo, permitindo que as alimentações de fosfato e ácido propiônico sejam realizadas a partir do momento exato do início da fase de produção, sem desperdício de co-substrato. Estudou-se a utilização de suplementos nutricionais na produção de polímero, como o ácido linoleico e oleico, na concentração de 0,3 g.L-1, os quais mostraram-se eficientes, levando a um aumento de cerca de 11% de acúmulo de polímero. Óleos vegetais que possuem esses ácidos graxos em sua composição também foram testados, na concentração equivalente a 0,3 g ácido oleico.L-1, em frascos agitados. Os óleos de canola e oliva apresentaram os maiores aumentos de produção de polímero. Por fim, a caracterização dos polímeros produzidos em biorreator neste estudo, mostrou que suas propriedades térmicas são semelhantes às do biopolímero comercial.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-01-05T14:35:38Z No. of bitstreams: 1 2016_MaurícioRossato.pdf: 3410176 bytes, checksum: deb7c72c5b63bb15ba465dfeee816c69 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-08T21:24:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MaurícioRossato.pdf: 3410176 bytes, checksum: deb7c72c5b63bb15ba465dfeee816c69 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-08T21:24:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MaurícioRossato.pdf: 3410176 bytes, checksum: deb7c72c5b63bb15ba465dfeee816c69 (MD5) / A murcha bacteriana, atualmente reconhecida como sendo causada por um complexo de espécies do gênero Ralstonia (Ralstonia solanacearum, R. pseudosolanacearum e R. syzygii) apresenta uma ampla diversidade, podendo ser dividida em raças, biovares, filotipos e sequevares. O objetivo deste trabalho foi: (i) ampliar os conhecimentos sobre o importante complexo de espécies de Ralstonia por meio da caracterização biológica, bioquímica e molecular do isolado CNPH-RS 488, que se mostrou capaz de suplantar a resistência da linhagem ‘Hawaii 7996’; (ii) gerar um novo protocolo de identificação de biovares por meio de técnicas moleculares, visando aumentar a eficiência do processo e reduzir os custos associados com o teste de biovar; (iii) identificar novas fontes de resistência em tomateiro à murcha bacteriana em germoplasma selvagem de Solanum, considerando o melhoramento antecipatório contra possíveis novos variantes do patógeno, como o isolado CNPH-RS 488; (iv) gerar informações sobre o patossistema Coffea – Ralstonia. No presente estudo, o isolado CNPH-RS 488 foi classificado quanto ao biovar e filotipo, e foram caracterizados o seu perfil de virulência, a capacidade de suplantar de resistência da linhagem ‘Hawaii 7996’, a produção de EPS e de biofilme, bem como a sensibilidade a antibióticos e sua gama de hospedeiras. Os sistemas de marcadores RAPD/SCAR em associação com a estratégia de bulk segregant analysis foram inicialmente empregados visando o desenvolvimento de primers específicos para identificação de biovares. Para a busca por novas fontes de resistência avaliou-se uma coleção de 75 genótipos de Solanum peruvianum em comparação com as linhagens controle ‘Hawaii 7996’ (resistente) e ‘L390’ (suscetível). Os genótipos foram inoculados com os isolados CNPH-RS 488 (biovar 2A) e CNPH-RS 489 (biovar 1). O status do cafeeiro como hospedeira do complexo de espécies de Ralstonia foi demonstrado em bioensaios com nove isolados em três cultivares de Coffea arabica, comparando com a resposta do tomateiro suscetível ‘San Vito’. A confirmação da capacidade de suplantação da resistência do ‘Hawaii 7996’ pelo CNPH-RS 488 não pôde ser explicada pelos testes de produção de exopolissacarídeo e biofilme. Foi também constatado que o isolado apresenta uma maior virulência sobre espécies mais resistentes como jiló e berinjela. Onze primers RAPD foram selecionados com potencial valor diagnóstico para identificação de biovares. Amplicons obtidos com quatro primers que geraram marcadores estáveis foram clonados e a informação de sequência foi utilizada para o desenho dos primers do tipo SCAR. Os primers J1-B1-B e SCAR-i18-B2A apresentaram especificidade parcial para isolados de biovar 1 e 2A, respectivamente. Para a biovar 3, foi empregada uma estratégia de subtração in silico que permitiu o desenho de um par de primers específico para a região do gene polS (codificador da enzima sorbitol desidrogenase). Sete genótipos dos 75 de S. peruvianum foram considerados como promissoras fontes para o melhoramento do tomateiro visando à resistência à murcha bacteriana. O cafeeiro se mostrou suscetível exclusivamente a isolados de R. pseudosolanacearum, indicando os potenciais riscos que a murcha bacteriana pode apresentar para a cafeicultura brasileira. O presente trabalho destaca que a existência de isolados capazes de suplantar a resistência do tomateiro, como o CNPH-RS 488, e isso implica em potenciais riscos da disseminação dos mesmos pelo país, podendo inviabilizar as cultivares de tomateiro atualmente disponíveis no mercado e que usam a linhagem ‘Hawaii 7996’ como parental. Estudos adicionais sobre esse variante do patógeno serão necessários bem como o desenvolvimento de programas de melhoramento com novas fontes de resistência efetivas contra isolados com um perfil de virulência similar ao apresentado pelo CNPH-RS 488. / The bacterial wilt is currently recognized as being caused by a complex of three species: Ralstonia solanacearum, R. pseudosolanacearum, and R. syzygii. The causal agents of the bacterial wilt display a wide diversity, being classified in races, biovars, phylotypes, and sequevars. The objective of the present thesis was: (i) add new information about this important bacterial complex via biological, biochemical and molecular characterization of the isolate R. solanacearum CNPH-RS 488, which was found to be able to break down the resistance of the tomato (Solanum lycopersicum) inbred line ‘Hawaii 7996’; (ii) develop a new protocol for molecular characterization of biovars, focusing on making a faster and cheaper biovar identification test; (iii) search for new sources of resistance to bacterial wilt disease within a germplasm collection of wild Solanum (section Lycopersicon) species, using the preemptive breeding and developing new resistant cultivar to new and atypical strains like the CNPH-RS 488; (iv) study and characterize a new pathosystem: Coffea – Ralstonia. Studies with the isolate R. solanacearum CNPH-RS 488 involved different approaches: (1) determination of its biovar and phylotype; (2) determination of its virulence profile, including the capability of breaking down the resistance of ‘Hawaii 7996’; (3) production of exopolysaccharides (EPS) and biofilm; (4) antibiotic sensitivity, and (5) host range. The RAPD/SCAR marker systems in association with bulk segregant analysis was the strategy initially employed aiming to develop biovar-specific PCR-based markers. The search for new sources of resistance to bacterial wilt was carried using 75 Solanum peruvianum accessions and two standard lines ‘Hawaii 7996’ (resistant) and ‘L390’ (susceptible). Bioassays were carried out with two isolates, CNPH-RS 488 (biovar 2A) and CNPH-RS 489 (biovar 1). For the study of coffee as a host of the Ralstonia species complex, plants of three C. arabica cultivars were inoculated with a collection of nine isolates and their reactions were compared with that of the susceptible standard (tomato ‘San Vito’). The ‘Hawaii 7996’-resistant breaking ability of the isolate CNPH-RS 488 could not be explained by EPS and biofilm production. In addition, it was found that this isolate displayed a wider virulence profile being also able to infect accessions of scarlet eggplant and eggplant (which are naturally more tolerant to bacterial wilt). Eleven RAPD primers with potential diagnostic value for biovar were selected. Four stable amplicons (generated by four RAPD primers) were gel-purified and cloned. The sequence information was used for the design of SCAR-like primers. The primers J1-B1-B and SCAR-i18-B2A displayed partial specificity to isolates biovar 1 and 2A, respectively. For the biovar 3, it was employed the in silico subtraction technique, which allowed the design of a polS (sorbitol dehydrogenase) gene-specific primer. Seven out of the 75 S. peruvianum accessions were considered as promising sources for future use in tomato breeding programs to bacterial wilt resistance. Coffee accessions were susceptible exclusively to R. pseudosolanacearum isolates, indicating the potential risk of the bacterial wilt for the Brazilian coffee production. The present work emphasizes the existence of isolates (such as the CNPH-RS 488), which are able to break down the major sources of resistance available in tomato breeding programs. The present work also points out the potential risks of the spread of isolates with similar virulence profile across the country, which may preclude the employment of ‘Hawaii 7996’ as parental material. More studies on these variants will be necessary aiming to help the tomato breeding programs in the search for new sources of resistance to isolates with virulence profiles similar to CNPH-RS 488.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-10-19T13:25:55Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1740275 bytes, checksum: dbf657dfff35fdf68a02c45937d7f4ba (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-19T13:25:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1740275 bytes, checksum: dbf657dfff35fdf68a02c45937d7f4ba (MD5) Previous issue date: 2014-08-22 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum, causa perdas diretas e indiretas na produção de várias culturas. Apesar de o uso de variedades resistentes ser a melhor opção para o manejo da doença, nãoraro encontram-se relatos de suplantação da resistência. O primeiro relato de murcha bacteriana no Brasil é antigo, porém pouco se conhece sobre os biovares, filotipos, sequevares e variabilidade genética do patógeno. Por essa razão realizou-se o presente estudo. Isolados brasileiros de R.solanacearum foram caracterizados como biovar 1, 2 e 3, filotipo II, que está disperso por todo o país e filotipo I, que encontra-se predominantemente na região Norte. Sete sequevares foram identificados: 1, 4, 18, 27, 28, 41 e 50. Além disso, nós classificamos quatro novos sequevares no filotipo IIB como sequevar 53, 54, 55 e 56. Inicialmente, utilizou-se rep-PCR para estimar a variabilidade. Obtiveram- se 282 haplótipos. Uma possível explicação para o alto número de haplótipos é a ocorrência de recombinação. Isolados das regiões Sul, Sudeste e Central formam um grande grupo genético, enquanto aqueles das regiões Norte e Nordeste formam outro grupo. Tal fato evidencia fluxo gênico entre essas regiões, provavelmente mediado pelo transporte de tubérculos e mudas contaminadas. Detectou-se diferenciação genética entre isolados de tomate e batata coletados na região Sul-Sudeste-Central. Os mecanismos evolutivos foram parametrizados a partir de análises de genealogia de genes por processo coalescente utilizando sequências parciais de sete genes. Detectou- se evidência de subdivisão dos filotipos I, IIA e IIB, mas não subdivisão por hospedeiro. O fluxo gênico é mais intenso da região Sul para a região Norte. O filotipo II é uma linhagem ancestral que teve origem no Brasil e o filotipo I foi recentemente introduzido, possivelmente por ação antropogênica. O filotipo IIA deu origem ao filotipo IIB e essa diferenciação ocorreu possivelmente devido a fatores ecológicos que precisam ser eBacterial wilt, caused by the Ralstonia solanacearum, cause direct and indirect losses in several crops. Planting of resistant varieties is the best option for disease management, but reports of resistance breakdown are commonly found in the literature. Although many years have passed after the first report of this pathogen in Brazil, information on biovars, phylotypes, sequevars and genetic variability of the pathogen is scarce. In the present study isolates were characterized as biovar 1, 2 and 3. Phylotype II is spread throughout Brazil and phylotype I is predominantly found in the North. Seven sequevars were identified: 1, 4, 18, 27, 28, 41 and 50. Moreover, we classified four new sequevars in the phylotype IIB as sequevar 53, 54, 55 and 56. Initially, we used rep-PCR to estimate the variability of the pathogen and 282 haplotypes were obtained. The high number of haplotypes could be due to the occurrence of recombination. Isolates of the South/Southeast/Central regions formed a genetically related cluster. Isolates from the North/Northeast regions formed another group. Gene flow occurs through the transportation of contaminated tubers and seedlings. Genetic differentiation was detected among isolates from tomato and potato collected in the South/Central/Southeast regions. In addition, gene genealogies based on the coalescent process were used to infer about evolutionary mechanisms. We detected evidence of subdivision of phylotypes I, IIA and IIB, but no subdivision by hosts. The gene flow is predominantly from the southern to the northern regions. We confirmed that phylotype II is an ancestral lineage that originated in Brazil and probably phylotype I was recently introduced by anthropogenic actions. Phylotype IIA originated phylotype IIB and this difference was probably due to ecological factors that need to be studied in more detail. Mutation, migration, recombination and selection occur in the population of R. solanacearum in Brazil, however mutation is more important than recombination. We conclude that the use of resistant varieties is a major challenge in all regions and hosts. studados com mais detalhes futuramente. Detectaram-se evidências de mutação, migração, recombinação e seleção na população de R.solanacearum no Brasil. Entretanto, mutação é mais importante que recombinação. Conclui-se que a utilização de variedades resistentes será uma grande desafio em todas regiões e hospedeiros. / Bacterial wilt, caused by the Ralstonia solanacearum, cause direct and indirect losses in several crops. Planting of resistant varieties is the best option for disease management, but reports of resistance breakdown are commonly found in the literature. Although many years have passed after the first report of this pathogen in Brazil, information on biovars, phylotypes, sequevars and genetic variability of the pathogen is scarce. In the present study isolates were characterized as biovar 1, 2 and 3. Phylotype II is spread throughout Brazil and phylotype I is predominantly found in the North. Seven sequevars were identified: 1, 4, 18, 27, 28, 41 and 50. Moreover, we classified four new sequevars in the phylotype IIB as sequevar 53, 54, 55 and 56. Initially, we used rep-PCR to estimate the variability of the pathogen and 282 haplotypes were obtained. The high number of haplotypes could be due to the occurrence of recombination. Isolates of the South/Southeast/Central regions formed a genetically related cluster. Isolates from the North/Northeast regions formed another group. Gene flow occurs through the transportation of contaminated tubers and seedlings. Genetic differentiation was detected among isolates from tomato and potato collected in the South/Central/Southeast regions. In addition, gene genealogies based on the coalescent process were used to infer about evolutionary mechanisms. We detected evidence of subdivision of phylotypes I, IIA and IIB, but no subdivision by hosts. The gene flow is predominantly from the southern to the northern regions. We confirmed that phylotype II is an ancestral lineage that originated in Brazil and probably phylotype I was recently introduced by anthropogenic actions. Phylotype IIA originated phylotype IIB and this difference was probably due to ecological factors that need to be studied in more detail. Mutation, migration, recombination and selection occur in the population of R. solanacearum in Brazil, however mutation is more important than recombination. We conclude that the use of resistant varieties is a major challenge in all regions and hosts.

Ph.D. (Biochemistry) / Please refer to full text to view abstract

La bactérie phytopathogène du sol, Ralstonia solanacearum cause la maladie du flétrissement bactérien sur un grand nombre de plante hôtes. Un des déterminants clefs de son pouvoir pathogène est le système de sécrétion de type III. Celui-ci permet à la bactérie d'injecter des protéines directement dans les cellules de l'hôte. Dans ma thèse je me suis attaché à décrire et analyser finement la contribution au pouvoir pathogène de la bactérie de certains de ces substrats de l'appareil de sécrétion de type III (RipAX2, RipH2, RipH3 et RipG). Des expériences de double-hybride nous ont permis d'identifier des protéines des plantes hôtes pouvant être ciblées par ces effecteurs de type III. Dans une autre partie de mon travail j'ai contribué à l'étude de RipAX2 qui est induit spécifiquement la résistance dans des lignées d'aubergines porteur d'un locus de résistance. J'ai également travaillé sur l'identification des cellules de plantes soumises à l'injection de type III dans une interaction compatible. Pour cela j'ai utilisé la plante hôte Medicago truncatula, en exprimant dans certaines lignées cellulaires un effecteurs (RipG7) pour lequel nous avions démontré que son expression constitutive das M. truncatula pouvait restaurer l'infection de ces plantes par un mutant bactérien dans ce même effecteur. Enfin, j'ai aussi contribué à l'analyse structure-fonction fine de l'effecteur RipG7 dans sa fonction de contribution au pouvoir pathogène de R. solanacearum sur la plante hôte M. truncatula. Ce travail nous a permis d'identifier les acides aminés de RipG7 qui sont sous sélection positive, et parmi ceux-là, ceux qui contribuent directement à la fonction de RipG7 sur M. truncatula. / The soil-borne pathogen Ralstonia solanacearum causes bacterial wilt in a broad range of plants. The type III secretion system (T3SS) and its associated type III effectors (T3Es) are the main virulence determinants of R. solanacearum. In my PhD study, to understand the mode of action of several "core" effectors (RipH2, RipH3, RipG7, RipG6) from R. solanacearum in host cells. We performed yeast two-hybrid screening of plant cDNA library to identify their protein targets. Besides, we also collaborated on the identification and characterization of a specific type III effector RipAX2 which is an avirulence factor that triggers a hypersensitive response in specific Eggplant lines. To understand which plant root cells are actually subjected to type III injection during the compatible interaction, I have generated transiently transformed Medicago truncatula lines (hairy root), expressing a host specificity and core T3E RipG7 in different root cell layers. When the transformed plant expressing RipG7 under 35S promoter, the plant can be infected and colonized by the ripG7 single mutant strain. The study could be refined by using specific root cell layer promoter to identify the root cell layers that are key players in this interaction. We also worked on the characterization of the structure-function of RipG7 from R. solanacearum. Our work revealed the genetic and functional variation of RipG7. Furthermore, positive selection study and mutagenesis analysis enabled us to identify essential functional residues which likely to have been differentially selected during the host-pathogen co-evolution. The potential plant targets of RipG7 were also studies further in our study by differential yeast two-hybrid.

Les bactéries phytopathogènes produisent des effecteurs de type III qui sont des facteurs de virulence injectés dans la cellule hôte afin de moduler les défenses et ainsi favoriser l'infection. L'effecteur PopP2 de Ralstonia solanacearum possède une activité acétyl-transférase qui est perçue par la paire de protéines de résistance RRS1-R et RPS4 dans le noyau des cellules végétales. Cette étape de perception conduit à l'activation des réponses de défenses. GTE9 et GTE11, deux protéines à bromodomaine d'Arabidopsis thaliana, s'apparentent à des lecteurs épigénétiques ciblés par PopP2. Nos données démontrent que ces protéines GTEs (i) interagissent avec PopP2 dans le noyau des cellules végétales et (ii) sont acétylées en présence de l'effecteur. De plus, GTE9 et GTE11 se lient in vivo et in vitro à des histones H4, suggérant que PopP2 interfère avec des processus de remodelage de la chromatine. / Microbial pathogens infect host cells by delivering virulence factors (effectors) that interfere with defenses, thereby favouring infection. The Ralstonia solanacearum PopP2 effector displays an acetyltransferase activity perceived by the Arabidopsis immune receptor pair, RRS1-R with RPS4, in the plant nucleus. This recognition step leads to the activation of immunity. Two Arabidopsis bromodomain-containing proteins , called General Transcription factor with Extra-terminal domain 9 and 11 (GTE9 and GTE11), were identified as PopP2-interacting partners. GTE9 and GTE11 are considered as epigenetic readers. Our data demonstrate that these GTEs proteins (i) interact with PopP2 in the plant nucleus and (ii) are acetylated in presence of the effector. Moreover, bromodomains of GTE9 and GTE11 bind in vivo and in vitro to Histone H4. Together, these data suggest that PopP2, through the targeting of GTE9 and GTE11, likely interfere with chromatin remodeling processes to affect ETS and/or ETI-related processes.

Please read the abstract in the section 00front of this document / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2008. / Plant Science / unrestricted

Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-11-01T13:24:40Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1410315 bytes, checksum: 018838e11a8a7e3cca3d440cf4f025db (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-01T13:24:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1410315 bytes, checksum: 018838e11a8a7e3cca3d440cf4f025db (MD5) Previous issue date: 2018-09-27 / Ralstonia spp. são conhecidas por causar murcha bacteriana em várias plantas de interesse econômico. O patógeno possui alta variabilidade genética, ampla variedade de hospedeiros e pode sobreviver no solo mesmo na ausência de hospedeiros. A compreensão das potenciais fontes de inóculo, que contribuem para a variabilidade genética no centro de origem do patógeno é interessante para o manejo da doença. O papel dos rios, plantas daninhas e da população nativa de Ralstonia spp. em áreas de vegetação natural no desenvolvimento de epidemias de murcha bacteriana é pouco compreendido. A variabilidade genética entre cepas de Ralstonia spp. em uma região onde a doença é endêmica pode elucidar a contribuição dos meios de dispersão e fatores associados à sobrevivência. No presente estudo, a detecção de Ralstonia spp. em rios de diferentes biomas do Brasil revelou o potencial destes recursos naturais para dispersar o patógeno. As plantas invasoras mostraram ser importantes reservatórios de ambas as espécies de Ralstonia que ocorrem no Brasil e colaboram para sua sobrevivência. Métodos de detecção não foram sensíveis para confirmar a presença de Ralstonia spp. em amostras de solo de áreas sem ocorrência de murcha bacteriana. Quando se analisaram 204 isolados de R. solanacearum e 60 isolados de R. pseudosolanacearum obtidos do município de Coimbra, Minas Gerais, constatou-se haver baixa variabilidade genotípica e clonalidade. Nenhuma estruturação foi observada para as regiões do município, mas a composição genotípica variou entre os anos amostrados. Para o controle alternativo da murcha bacteriana, cinco fagos pertencentes à família Siphoviridae, ordem Caudovirales, foram isolados em amostras de solo. A análise molecular e a gama de hospedeiros com diferentes isolados de Ralstonia spp., representando o Brasil, revelaram diferenças entre os vírus. Adicionalmente, houve diferenças quanto à gama de hospedeiros quando os cinco fagos foram expostos a 24 isolados de Ralstonia spp. Os fagos não foram capazes de prevenir a infecção e controlar o número de células de Ralstonia spp. no solo. Outros métodos de aplicação são necessários para avaliar a eficiência dos fagos no controle da murcha bacteriana. / Ralstonia spp. are known to cause bacterial wilt in several plants of economic interest. The pathogen has high genetic variability, wide host range and can survive in the soil even in the absence of hosts. Understanding potential inoculum sources that contribute to genetic variability in the center of origin is interesting to the management of the disease. The importance of rivers, weeds and native population of Ralstonia spp. in areas of natural vegetation in the development of epidemics of bacterial wilt is poorly understood. Genetic variability among strains of Ralstonia spp. in a local region where the disease is endemic can elucidate the contribution of the means of dispersal and factors of survival. In the present study, the detection of Ralstonia spp. was attempted in water of rivers of different biomes of Brazil and revealed the potential of these natural resources to disperse the pathogen. Weeds were important reservoirs of both species of Ralstonia that occur in Brazil, and collaborate to their survival. Methods of detection were not sensitive to confirm the presence of Ralstonia spp. in soil samples from areas without the occurrence of bacterial wilt. The genetic variability of 204 strains of R. solanacearum and 60 strains of R. pseudosolanacearum from the municipality of Coimbra, Minas Gerais, was low and there was evidence of clonality in the population. The population was not genetically structured according to the geographic region in the municipality, however the genotypic composition varied in time. To assess an alternative measure to control bacterial wilt, five phages were isolated. All phages belong to the Siphoviridae family, Caudovirales order. Molecular analysis and host range with different R. solanacearum strains revealed differences among the viruses. There were differences in the host range when the five phages were exposed to 24 Ralstonia spp. strains. The phages were not able to prevent tomato infection and control the number of cells of Ralstonia spp. in the soil. Other methods of application are necessary to evaluate the efficiency of the phages to control of bacterial wilt.