A conjugação por polietilenoglicol (PEG) mascara a superfície das proteínas e aumenta o tamanho molecular do polipeptídio, reduzindo assim sua ultrafiltragem renal, impedindo a aproximação de células processadoras de antígenos ou anticorpos e reduzindo a degradação por enzimas proteolíticas. O PEG transfere para as moléculas suas propriedades físico-químicas e, conseqüentemente, modifica também a biodistribuição e a solubilidade de drogas peptídicas e não peptídicas. As soluções de proteínas são facilmente desnaturadas (muitas vezes irreversivelmente) pelo aparecimento de numerosos eventos que podem afetar a estabilidade das soluções, tais como: aquecimento, agitação, congelamento, mudanças no pH e exposição a interfaces ou agentes desnaturantes, resultando geralmente na perda da eficácia clínica e aumento do risco de efeitos colaterais adversos. A solução prática para o dilema da estabilidade da proteína é a remoção da água. A liofilização é o método mais comumente utilizado para a preparação de proteínas desidratadas, as quais, teoricamente, devem apresentar uma estabilidade adequada por um longo período de armazenagem em temperaturas ambientes. A proteína utilizada neste estudo foi a albumina sérica bovina (BSA), amplamente estudada no campo da bioquímica. Através da espectroscopia Raman associada com análise térmica por DSC, análise colorimétrica, e a determinação do teor de umidade, verificou-se que o congelamento rápido (30 °C/min.) favoreceu a manutenção da estrutura conformacional da proteína após a liofilização, porém aumentou o tempo de secagem primária em sete horas em relação ao congelamento lento (2,5 °C/min.). Após a modificação da albumina bovina por reação com o metoxi-PEG verificou-se que a BSA-PEG (1:0,25) apresentou um menor grau de alteração estrutural e conseqüentemente uma menor variação das características físico-químicas, além de otimizar as condições de liofilização e armazenamento da proteína quando comparada com a BSA-PEG (1:0,5) . / PEG conjugation masks the proteins surface and increases the molecular size of the polypeptide, thus reducing its renal ultrafiltration, preventing the approach of antibodies or antigen processing cells and reducing the degradation by proteolytic enzymes. The PEG conveys to molecules its physico-chemical properties and therefore modifies also biodistribution and solubility of peptide and non-peptide drugs. This property opens new techniques in biocatalysis and in pharmaceutical technology where many insoluble drugs are solubilized by PEG conjugation and thus more easily administered. Aqueous protein solutions are readily denatured (often irreversibly) by numerous stresses arising in solution, e.g., heating, agitation, freezing, pH changes, and exposure to interfaces or denaturants, usually resulting in lost of clinical efficacy and increase the risk of adverse side effects. Even if its physical stability is maintained, a protein can be degraded by chemical reactions (e.g., hydrolysis and deamidation), many of which are mediated by water. The practical solution to the protein stability dilemma is to remove the water. Lyophilization is most commonly used to prepare dehydrated proteins, which, theorecally, should have the desired long-term stability at ambient temperatures. The protein used in this study was the bovine serum albumin (BSA), largely studied in the biochemical field. Through Raman spectroscopy associated with thermal analysis using DSC, Colorimetric analysis and the determination of water content It was observed that the fast freezing (30 °C/min.) favored the maintenance of the conformational structure in the protein after lyophilization, however increased the primary drying in seven hours with regard to the slow freezing (2,5 °C/min.). After the modification of bovine serum albumin with methoxy-PEG it was observed that the BSA-PEG (1:0,25) showed a lower degree of structural alterations and consequently a lower variation on the physical-chemical characteristics, moreover optimized the conditions during the lyophilization process and storage of the protein when it was compared to BSA-PEG (1:0,5).

A conjugação por polietilenoglicol (PEG) mascara a superfície das proteínas e aumenta o tamanho molecular do polipeptídio, reduzindo assim sua ultrafiltragem renal, impedindo a aproximação de células processadoras de antígenos ou anticorpos e reduzindo a degradação por enzimas proteolíticas. O PEG transfere para as moléculas suas propriedades físico-químicas e, conseqüentemente, modifica também a biodistribuição e a solubilidade de drogas peptídicas e não peptídicas. As soluções de proteínas são facilmente desnaturadas (muitas vezes irreversivelmente) pelo aparecimento de numerosos eventos que podem afetar a estabilidade das soluções, tais como: aquecimento, agitação, congelamento, mudanças no pH e exposição a interfaces ou agentes desnaturantes, resultando geralmente na perda da eficácia clínica e aumento do risco de efeitos colaterais adversos. A solução prática para o dilema da estabilidade da proteína é a remoção da água. A liofilização é o método mais comumente utilizado para a preparação de proteínas desidratadas, as quais, teoricamente, devem apresentar uma estabilidade adequada por um longo período de armazenagem em temperaturas ambientes. A proteína utilizada neste estudo foi a albumina sérica bovina (BSA), amplamente estudada no campo da bioquímica. Através da espectroscopia Raman associada com análise térmica por DSC, análise colorimétrica, e a determinação do teor de umidade, verificou-se que o congelamento rápido (30 °C/min.) favoreceu a manutenção da estrutura conformacional da proteína após a liofilização, porém aumentou o tempo de secagem primária em sete horas em relação ao congelamento lento (2,5 °C/min.). Após a modificação da albumina bovina por reação com o metoxi-PEG verificou-se que a BSA-PEG (1:0,25) apresentou um menor grau de alteração estrutural e conseqüentemente uma menor variação das características físico-químicas, além de otimizar as condições de liofilização e armazenamento da proteína quando comparada com a BSA-PEG (1:0,5) . / PEG conjugation masks the proteins surface and increases the molecular size of the polypeptide, thus reducing its renal ultrafiltration, preventing the approach of antibodies or antigen processing cells and reducing the degradation by proteolytic enzymes. The PEG conveys to molecules its physico-chemical properties and therefore modifies also biodistribution and solubility of peptide and non-peptide drugs. This property opens new techniques in biocatalysis and in pharmaceutical technology where many insoluble drugs are solubilized by PEG conjugation and thus more easily administered. Aqueous protein solutions are readily denatured (often irreversibly) by numerous stresses arising in solution, e.g., heating, agitation, freezing, pH changes, and exposure to interfaces or denaturants, usually resulting in lost of clinical efficacy and increase the risk of adverse side effects. Even if its physical stability is maintained, a protein can be degraded by chemical reactions (e.g., hydrolysis and deamidation), many of which are mediated by water. The practical solution to the protein stability dilemma is to remove the water. Lyophilization is most commonly used to prepare dehydrated proteins, which, theorecally, should have the desired long-term stability at ambient temperatures. The protein used in this study was the bovine serum albumin (BSA), largely studied in the biochemical field. Through Raman spectroscopy associated with thermal analysis using DSC, Colorimetric analysis and the determination of water content It was observed that the fast freezing (30 °C/min.) favored the maintenance of the conformational structure in the protein after lyophilization, however increased the primary drying in seven hours with regard to the slow freezing (2,5 °C/min.). After the modification of bovine serum albumin with methoxy-PEG it was observed that the BSA-PEG (1:0,25) showed a lower degree of structural alterations and consequently a lower variation on the physical-chemical characteristics, moreover optimized the conditions during the lyophilization process and storage of the protein when it was compared to BSA-PEG (1:0,5).

Nesta Dissertação de Mestrado foram estudadas as respostas inflamatórias e de reparo de tecido muscular de ratos a implantes de hidróxidos duplos lamelares (HDL) contendo íon cloreto e sulindaco (fármaco anti-inflamatório não-esteroidal - FAINE) em seu espaço interlamelar. As técnicas empregadas nesta investigação foram as espectroscopias Raman e de absorção no infravermelho (FTIR), a difratometria de raios X (XRD) e a análise histomorfológica dos tecidos corados pelas técnicas de Hematoxilina e Eosina (HE) (Michalany, 1990)(Michalany, 1990)(Michalany, 1990) e Picrosirius Red (Picro). Simulações do espectro vibracional foram feitas por DFT usando o pacote computacional Gaussian 09 e as análises estatísticas foram feitas usando o pacote Unscrambler X.10.1. Os experimentos in vivo foram realizados fazendo-se a implantação das pastilhas de HDL por microcirurgia entre as camadas do músculo externo oblíquo de ratos (Wistar) e como experimento controle foi feita a separação de tais camadas simulando um implante. Os tecidos foram coletados após 7, 21, 28 e 35 dias de pós operatório, divididos em duas porções (uma para análise histomorfológica e outra para análise por espectroscopia Raman). Inicialmente foram feitos os cálculos teóricos e a caracterização espectroscópica do sulindaco, que possibilitou melhorar sua atribuição vibracional encontrada na literatura. O mesmo ocorreu com as matrizes de HDL, de Zn(II) e de Mg(II), intercaladas com íons cloreto, o que também resultou em um aprimoramento da atribuição que é encontrada na literatura. Os dois HDLs intercalados com sulindaco também foram caracterizados espectroscopicamente e os espectros Raman mostraram grande semelhança com a espécie do fármaco desprotonado. O difratograma obtido dos intercalatos mostra expansão do espaçamento basal (de 7 Å para 26 Å) compatível com a intercalação do sulindaco inclinado em relação ao plano das lamelas. Os espectros Raman do tecido controle mostram alterações mais significativas nas banda amida I e amida III com o tempo de pós-operatório e por PCA foi possivel observar a nítida separação do grupo que apresenta um processo inflamatório agudo (7 dias). Os tecidos expostos à pastilha de HDL intercalada com íons cloreto, mostraram resposta inflamatória reduzida em relação ao tecido controle e as alterações espectrais observadas evidenciam a presença de colágenos, o que indica uma aceitação da pastilha por parte do organismo (biocompatibilidade). As pastilhas também foram analisadas espectroscopicamente e mostraram que houve incorporação de íons CO32- no espaço interlamelar, indicado pela presença da banda Raman em 1060 cm-1 (estiramento simétrico C-O nesse íon), mas não foi possivel determinar se eventuais variações no pH local exerceram efeitos na resposta inflamatória. No caso dos tecidos expostos à pastilha de HDL com sulindaco, a análise por microscopia Raman mostrou que o processo inflamatório foi significativamente reduzido, evidenciando uma ação local do fármaco, além do crescimento de colágenos do tipo III. A pastilha de HDL com sulindaco implantado foi analisada por FT-Raman e a liberação do fármaco foi confirmada. Os resultados de espectroscopia Raman de tecidos foram confirmados pela análise histomorfológica, que mostrou haver de fato um acúmulo de colágeno do tipo III nas regiões próximas às pastilhas implantadas, assim como a formação de invaginações e neovascularização. / In this Master\'s Thesis the inflammatory responses and tissue repair of rat muscles caused by implants of Lamellar Double Hydroxides (LDH) containing chloride ion and sulindac (anti-inflammatory non-steroidal drug - NSAID) in its interlayer space was studied. The techniques used in this research were the Raman spectroscopy and infrared absorption spectroscopy (FTIR), the X-ray diffraction (XRD) and the histomorphological analysis of tissues stained by techniques of Hematoxylin and Eosin (HE) and Picrosirius Red (Picro). Simulations of vibrational spectrum were made by DFT using the computational package Gaussian 09 and the statistical analyzes were performed using the Unscrambler X.10.1 package. In vivo experiments were performed by making the implantation of HDL tablets by microsurgery between the layers of the external oblique muscle of rats (Wistar) and as a control experiment the separation of the layers to simulate an implant was conducted. The tissues were collected after 7, 21, 28 and 35 days postoperatively, divided into two parts (one for histomorphological analysis and the other for analysis by Raman spectroscopy). Initially, theoretical calculations and spectroscopic characterization of sulindac where made, which enabled improving its vibrational assignment in the literature. The same happened for the LDH matrices, Zn(II) and Mg(II), both with chloride ions in the interlamelar space, which also resulted in an improving of it vibrational assignment found in the literature. Both LDH intercalated with sulindac were also characterized spectroscopically and their Raman spectra showed great agreement to the deprotonated species of thedrug. The diffraction pattern obtained from intercalated compounds shows an expansion of the basal spacing (7 Å to 26 Å) compatible with the hypothesis of the sulindac inclined relative to the lamelar plane. The Raman spectra control tissues show the most significant changes in the band amide I and amide III after diferente surgery times and through PCA was possible to observe the clear separation of the group that presenting an acute inflammatory process (at 7 days). Tissues exposed to LDH pellet intercalated with chloride ions showed a reduced inflammatory response relative to control tissue and the spectral changes demonstrate the presence of collagen, which indicates an acceptance of the insert by the body (biocompatibility). The pellets were also analyzed spectroscopically and showed that there was incorporation of CO32- ions in the interlayer space, indicated by the presence of the Raman band at 1060 cm-1 (symmetric stretch C-O of this ion), but it was not possible to determine if changes in local pH affect the inflammatory response. In the case of tissues exposed to LDH tablet with sulindac, analysis by Raman microscopy showed that inflammation was significantly reduced, indicating a local action of the drug, in addition, the collagen type III growth has been observed. The implanted LDH pellet with sulindac was analyzed by FT-Raman and the drug release was confirmed. The results of Raman spectroscopy of tissues were confirmed by histomorphological analysis, which showed that there is indeed an accumulation of collagen type III in the tissue regions near to the implanted pellets, as well as the formation of invagination and neovacularization.

Nesta Dissertação de Mestrado foram estudadas as respostas inflamatórias e de reparo de tecido muscular de ratos a implantes de hidróxidos duplos lamelares (HDL) contendo íon cloreto e sulindaco (fármaco anti-inflamatório não-esteroidal - FAINE) em seu espaço interlamelar. As técnicas empregadas nesta investigação foram as espectroscopias Raman e de absorção no infravermelho (FTIR), a difratometria de raios X (XRD) e a análise histomorfológica dos tecidos corados pelas técnicas de Hematoxilina e Eosina (HE) (Michalany, 1990)(Michalany, 1990)(Michalany, 1990) e Picrosirius Red (Picro). Simulações do espectro vibracional foram feitas por DFT usando o pacote computacional Gaussian 09 e as análises estatísticas foram feitas usando o pacote Unscrambler X.10.1. Os experimentos in vivo foram realizados fazendo-se a implantação das pastilhas de HDL por microcirurgia entre as camadas do músculo externo oblíquo de ratos (Wistar) e como experimento controle foi feita a separação de tais camadas simulando um implante. Os tecidos foram coletados após 7, 21, 28 e 35 dias de pós operatório, divididos em duas porções (uma para análise histomorfológica e outra para análise por espectroscopia Raman). Inicialmente foram feitos os cálculos teóricos e a caracterização espectroscópica do sulindaco, que possibilitou melhorar sua atribuição vibracional encontrada na literatura. O mesmo ocorreu com as matrizes de HDL, de Zn(II) e de Mg(II), intercaladas com íons cloreto, o que também resultou em um aprimoramento da atribuição que é encontrada na literatura. Os dois HDLs intercalados com sulindaco também foram caracterizados espectroscopicamente e os espectros Raman mostraram grande semelhança com a espécie do fármaco desprotonado. O difratograma obtido dos intercalatos mostra expansão do espaçamento basal (de 7 Å para 26 Å) compatível com a intercalação do sulindaco inclinado em relação ao plano das lamelas. Os espectros Raman do tecido controle mostram alterações mais significativas nas banda amida I e amida III com o tempo de pós-operatório e por PCA foi possivel observar a nítida separação do grupo que apresenta um processo inflamatório agudo (7 dias). Os tecidos expostos à pastilha de HDL intercalada com íons cloreto, mostraram resposta inflamatória reduzida em relação ao tecido controle e as alterações espectrais observadas evidenciam a presença de colágenos, o que indica uma aceitação da pastilha por parte do organismo (biocompatibilidade). As pastilhas também foram analisadas espectroscopicamente e mostraram que houve incorporação de íons CO32- no espaço interlamelar, indicado pela presença da banda Raman em 1060 cm-1 (estiramento simétrico C-O nesse íon), mas não foi possivel determinar se eventuais variações no pH local exerceram efeitos na resposta inflamatória. No caso dos tecidos expostos à pastilha de HDL com sulindaco, a análise por microscopia Raman mostrou que o processo inflamatório foi significativamente reduzido, evidenciando uma ação local do fármaco, além do crescimento de colágenos do tipo III. A pastilha de HDL com sulindaco implantado foi analisada por FT-Raman e a liberação do fármaco foi confirmada. Os resultados de espectroscopia Raman de tecidos foram confirmados pela análise histomorfológica, que mostrou haver de fato um acúmulo de colágeno do tipo III nas regiões próximas às pastilhas implantadas, assim como a formação de invaginações e neovascularização. / In this Master\'s Thesis the inflammatory responses and tissue repair of rat muscles caused by implants of Lamellar Double Hydroxides (LDH) containing chloride ion and sulindac (anti-inflammatory non-steroidal drug - NSAID) in its interlayer space was studied. The techniques used in this research were the Raman spectroscopy and infrared absorption spectroscopy (FTIR), the X-ray diffraction (XRD) and the histomorphological analysis of tissues stained by techniques of Hematoxylin and Eosin (HE) and Picrosirius Red (Picro). Simulations of vibrational spectrum were made by DFT using the computational package Gaussian 09 and the statistical analyzes were performed using the Unscrambler X.10.1 package. In vivo experiments were performed by making the implantation of HDL tablets by microsurgery between the layers of the external oblique muscle of rats (Wistar) and as a control experiment the separation of the layers to simulate an implant was conducted. The tissues were collected after 7, 21, 28 and 35 days postoperatively, divided into two parts (one for histomorphological analysis and the other for analysis by Raman spectroscopy). Initially, theoretical calculations and spectroscopic characterization of sulindac where made, which enabled improving its vibrational assignment in the literature. The same happened for the LDH matrices, Zn(II) and Mg(II), both with chloride ions in the interlamelar space, which also resulted in an improving of it vibrational assignment found in the literature. Both LDH intercalated with sulindac were also characterized spectroscopically and their Raman spectra showed great agreement to the deprotonated species of thedrug. The diffraction pattern obtained from intercalated compounds shows an expansion of the basal spacing (7 Å to 26 Å) compatible with the hypothesis of the sulindac inclined relative to the lamelar plane. The Raman spectra control tissues show the most significant changes in the band amide I and amide III after diferente surgery times and through PCA was possible to observe the clear separation of the group that presenting an acute inflammatory process (at 7 days). Tissues exposed to LDH pellet intercalated with chloride ions showed a reduced inflammatory response relative to control tissue and the spectral changes demonstrate the presence of collagen, which indicates an acceptance of the insert by the body (biocompatibility). The pellets were also analyzed spectroscopically and showed that there was incorporation of CO32- ions in the interlayer space, indicated by the presence of the Raman band at 1060 cm-1 (symmetric stretch C-O of this ion), but it was not possible to determine if changes in local pH affect the inflammatory response. In the case of tissues exposed to LDH tablet with sulindac, analysis by Raman microscopy showed that inflammation was significantly reduced, indicating a local action of the drug, in addition, the collagen type III growth has been observed. The implanted LDH pellet with sulindac was analyzed by FT-Raman and the drug release was confirmed. The results of Raman spectroscopy of tissues were confirmed by histomorphological analysis, which showed that there is indeed an accumulation of collagen type III in the tissue regions near to the implanted pellets, as well as the formation of invagination and neovacularization.

Les oxydes de métaux de transition lamellaires peuvent servir de catalyseurs pour la conversion de la biomasse, mais leur développement nécessite une meilleure compréhension de leurs propriétés. En conséquence, plusieurs matériaux lamellaires, tels que HNbMoO6, HNbWO6, H2W2O7 et H2WO4, ainsi qu'un nouveau type d'oxydes en couches basés sur Nb et W et caractérisés par des phases d'Aurivillius “en escalier” ont été largement caractérisés notamment par spectroscopie DRX et spectroscopie Raman. La possibilité de convertir les solides précurseurs au lithium ou bismuth en phases protonées a été étudiée. Ces oxydes ont la spécificité d'intercaler des molécules entre les couches, ce qui peut contribuer à l’activité catalytique en phase liquide. Pour identifier les rôles respectifs de l’intercalation et des propriétés de surface comme l’acidité, les matériaux ont été caractérisés en phase liquide par spectroscopie Raman en utilisant des bases organiques telles que les n-alkylamines (butylamine et octylamine) et la pyridine. L'intercalation avec des réactifs possibles, les n-alcools et le 2,5-hexanediol, a également été étudiée. L'activité catalytique de ces oxydes lamellaires a été déterminée grâce à une nouvelle réaction: la cyclo-déshdrataion du 2,5-hexanediol en 2,5-diméthyltétrahydrofurane. HNbMoO6 s’est avéré le catalyseur le plus actif, comparé à des catalyseurs acides conventionnels ou aux autres matériaux lamellaires. L’acidité et la capacité d’intercalation de ces divers matériaux lamellaires ont été comparées pour comprendre les différences observées pour l’activité catalytique. / Layered transition metal oxides have a potential as catalysts for biomass conversions, but their development necessitates a better understanding of their properties. Consequently, several layered materials such as HNbMoO6, HNbWO6, H2W2O7 and H2WO4 as well as new types of layered oxides based on Nb and W and characterized by a “stair-like” Aurivillius phases were extensively characterized notably by XRD and Raman spectroscopy. The possibility to convert the as-synthesised lithium or bismuth precursors to protonated phases was also thoroughly evaluated. Layered oxides have the specificity to intercalate molecules within their interlayer regions, which may be a key feature to catalytic activity for reactions in the liquid phase. In order to evaluate the respective roles of intercalation and surface properties such as acidity, the materials were characterized in the liquid phase by Raman spectroscopy using organic bases such as n-alkylamines (butylamine and octylamine) and pyridine. Intercalation with possible reagents, n-alcohols and 2,5-hexanediol, was also studied. The catalytic activity of these layered oxides was evaluated using a novel test reaction: the cyclo-dehydration of 2,5-hexanediol into 2,5-dimethyltetrahydrofuran. HNbMoO6 proved to be the most active catalyst, compared to conventional acidic catalysts or other layered materials. The acidity and intercalation ability of the various layered materials were compared to understand the differences observed for the catalytic activity.

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