Orientador : Marcelo de Carvalho Ramos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-31T19:08:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_AlexandreMacedode_M.pdf: 1837263 bytes, checksum: 7f98952a1bb0aac6c5058995386f2241 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A caracterização das bactérias em níveis subespecíficos, relacionando isolados em cepas, tem grande aplicação no estudo das infecções dentro do ambiente hospitalar. Permite fazer inferências sobre a extensão de surtos, rotas de transmissão e avaliação de medidas empregadas para controle. Os métodos de tipagem podem ser divididos em fenotípicos, quando se baseiam em características expressas pelo organismo, ou genotípicos, quando a comparação se dá pelo seu material genético. Estes últimos apresentam vantagens sobre os primeiros pois são baseados em características mais estáveis e menos sujeitas a pressões ambientais. O Staphylococcus aureus é um germe bastante comum tanto no ambiente hospitalar, quanto na comunidade, sendo responsável por quadros clínicos de gravidade variável. A técnica considerada de escolha para a genotipagem desse microorganismo é a Eletroforese em Gel com Campo Pulsátil, PFGE. Esse método exige aparato caro, é trabalhoso e fornece resultados somente após 4-5 dias de trabalho. E, portanto, importante a padronização de métodos mais simples e que forneçam resultados em prazos menores de tempo. Com o objetivo de avaliar a tipabilidade, reprodutibilidade e poder discriminatório para a tipagem de Staphylococcus aureus pela amplificação da região 16S - 23S do RNA ribossomal, ribotipagem por PCR, desenvolveu- se o presente estudo. O primeiro passo foi a escolha do par de iniciadores. Escolheu-se o par que produzia menores fragmentos e facilitava a interpretação dos resultados. A reprodutibilidade e tipabilidade foram também avaliadas e mostraram ser bastante satisfatórias. A etapa seguinte foi tipar 88 isolados de S. aureus obtidos do Hospital Municipal Dr. Mário Gatti, um hospital terciário em Campinas, SP. Dentre os 27 isolados oxacilina sensíveis, foi possível identificar 22 genótipos distintos. O coeficiente de similaridade por "Simple Matching" variou de 45 a 100%. Obteve-se apenas um único perfil genotípico dentre os 61 isolados oxacilina resistentes. Estes resultados demonstram que, por possuir boa tipabilidade, reprodutibilidade, ser de fácil execução e interpretação, a técnica de ribotipagem por PCR deve ser considerada para a tipagem de Staphylococcus aureus oxacilina sensíveis. No grupo de bactérias oxacilina resistentes, houve monotonia no padrão genotípico, fato que ocorre também com outras técnicas. Existe necessidade do desenvolvimento de técnicas, talvez como seqüenciamento de regiões conservadas do genoma, para que possam ser feitas inferências sobre a ancestralidade de isolados / Abstract: Strain typing represents an important tool for understanding the epidemiology of nosocomial infections. It is useful to determine the extension of outbreaks and routes of transmission, for example. The available techniques nowadays can be based on characteristics expressed by the organisms, fenotyping methods, or on genomic material, genotyping methods. The former ones are based on more stable characteristics and provide better results in terms of reproducibility, typeability, and discriminatory power. Staphylococcus aureus is a major pathogen both in community and in hospital setting. Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE, is the current method of choice for this bacteria but it is laborious, requires expensive apparatus, and the results are available only after 4 to 5 work-days. It is necessary to develop simpler methodologies, that can give results in shorter periods of time. We evaluate in this study the polymorphism in the spacer regions between the 16S and 23S units of the rRNA genes, PCR based ribotyping, as a strain typing technique for S. aureus. The first step was to choose the most suitable primer pair and the technique was then checked for reproducibility, stability and typeability. These preliminary results were satisfactory. We had chosen the primer pair that produced the smallest amplicons, which allowed better analysis. The discriminatory power was assessed using a collection of 88 isolates from Hospital Municipal Dr. Mário Gatti, a general tertiary-care hospital in Campinas, São Paulo State, Brazil. The results obtained from the 61 methicillin resistant isolates produced one single pattern, but it was possible to identify 22 different patterns among the 27 methicillin sensitive isolates. The bands could be visualized in the agarose gels with simple Ethidium Bromide staining, which permits the use of computer based software to compare band patterns. Given the results and the technical simplicity, PCR based ribotyping appears to be useful in strain typing S. aureus methicillin sensitive isolates, but the discriminatory power among the methicillin resistant isolates seems to be poor. There is a crescent need to develop and standardize new techniques to genotype bacteria, such as DNA sequencing, in order to evaluate the relatedness among isolates / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Luiz Roberto G. Britto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T13:15:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paez-Espinosa_EnmaVeronica_M.pdf: 23050245 bytes, checksum: 0cc0c8d17ecaa21297b9c739206fa1f9 (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: A utilização de marcadores celulares para mapeamento das regiões cerebrais tem resultado em importantes avanços no estudo da organização morfofuncional do sistema nervoso. No presente trabalho, foram empregadas duas técnicas de marcação, a histoquímica para NADPH-diaforase, que revela neurônios que contêm óxido nítrico (NO) e a técnica imuno-histoquímica para proteínas ligantes de cálcio (CaBPs), com o propósito de se determinar a eventual colocalização neuronal dessas substâncias no cérebro de camundongos, já que ambas parecem estar envolvidas em processos fisio-patológicos semelhantes. A metodologia foi efetuada em cortes frontais do cérebro de 14 camundongos C57BL/6) previamente anestesiados e perfundidos com salina e 4% paraformaldeído. A imuno-histoquímica para as CaBPS(calbindina, parvalbumina e calretinina) foi baseada na técnica de avidina-biotina-peroxidase (ABC) e imuno-fluorescência. Em seguida, os cortes foram processados pela técnica histoquímica para NADPH-diaforase, utilizando nitrobluetetrazolium como cromógeno. Neuropeptídeo Y, cuja co-Iocalização com NADPH-diaforasetem sido amplamente demonstrada, serviu como controle positivo, que mostrou a validade das técnicas utilizadas. Nossos resultados demonstraram, a nível de cortex, caudado-putamen, vias visuais subcorticais, amígdala e hipocampo, hipotálamo, bulbo olfatório e cerebelo, sub-populações de neurônios independentes para a reação de diaforase e CaBPS.Essesresultados indicam que, apesar de as CaBPse o NO estarem envolvidos em processos neuronais fisio-patológicos similares, eles estão presentes em diferentes sistemas neuronais nesses animais / Abstract: Both nitric oxide (NO) and calcium binding proteins (CaBPs) seem to be involved in some neuropathologicalprocesses. In this study, we sought to investigate if NO and CaBPs are colocalizated in neurons of the mouse brain. Fourteen C57BL/6J mice were deeply anesthetized and perfused with 4% paraformaldehyde and their brains were processed for NADPH-diaphorase histochemistry to detect NO and also subjected to immunohistochemistrywith antibodies against calbindin-28kD, parvalbumin and calretinin. Both fluorescence and peroxidase methods were employed. Colocalization of neuropeptide Y (NPY) with NOS was performed as intensity of staining control. NADPH-diaphorase neurons were seen in several brain regions, which include the cerebral cortex, basal amygdala, hippocampus, olfactory bulb, cerebellum and subcortical visual pathways. CaBPs were also distributed in many brain regions, some of wich contained NADPH-diaphorase. However, no double-labeled cells were seen in the mouse brain, when considering diaphorasepositivity and either one of the CaBPstested. These data suggest that despite the fact that NO and CaBPs appear to be involved in similar neuropathologies, they are present in different neuronal populations in the mouse brain and thus might participate in different neural processes / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:02:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo967_1.pdf: 5089215 bytes, checksum: e6ee7003879dd48f890db14779497896 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Introdução: O Papilomavírus Humano (HPV) e o Herpesvírus Humano-8 (HHV- 8) podem influenciar na carcinogênese de lesões anogenitais e orofaríngeas na mulher e no homem. Métodos: A amostra foi de trinta e um casais heterossexuais. Foram avaliados condições sócio-econômicas, hábitos gerais e sexuais e história prévia de doenças sexualmente transmissíveis, seguido da coleta de esfregaço peniano de lesões malignas e/ou potencialmente malignas possivelmente associadas ao HPV. As respectivas parceiras foram submetidas a coleta de esfregaço de vagina/colo uterino, exame de colposcopia e citologia cervical, exame clínico e coleta de esfregaço de mucosa oral. A pesquisa do HPV e HHV-8 foi realizada através da reação da cadeia de polimerase (PCR) com a utilização dos primers MY09 e MY11 e primers KS1 e KS2. Resultados: Foi amplificado HPV-DNA a partir de esfregaço de pênis (P) de 22/31 (71%); 18/31 (58,1%) das amostras de vagina/colo (V) e 17/31 (54,8%) mucosa oral (B). Com relação ao HHV-8, foi amplificado DNA em 1/31 (3,2%) indivíduos avaliados (P), 0/31 (0%) (V) e 3/31 (9,7%) (B). Observamos que entre o mesmo casal não houve amplificação do HHV-8-DNA em mais de um sítio estudado. De todos os casos positivos para HPV (P, V e B) e HHV-8 (P e B) foi observada associação significante (p=0,030). Conclusão: Pode haver uma co-infecção entre o HPV e HHV-8 em diferentes sítios. Não foi observado a transmissão sexual em casais heterossexuais não-infectados pelo HIV, devendo existir outras rotas de transmissão neste grupo estudado

Orientador : Fernando Galembeck / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-16T22:35:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rubira_AdleyForti_D.pdf: 7721666 bytes, checksum: 392875c784557abbf2c805ad14625a2d (MD5) Previous issue date: 1988 / Doutorado

Esta dissertação de mestrado descreve os resultados obtidos acerca da aplicação de reações de acoplamento entre aldeídos, aminas e alquinos (A3) visando a síntese de alcalóides indolizidínicos de ocorrência natural, como a desoxicastanospermina e a swainsonina. A reação de acoplamento-A3 é uma poderosa ferramenta de construção de ligação carbono-carbono e carbono-heteroátomo, permitindo a preparação de propargilaminas que podem ser exploradas como intermediários de grande potencial sintético. A proposta está baseada na reação de acoplamento de um reagente organometálico, gerado in situ a partir de um alquino e um sal ou complexo metálico, e um eletrófilo nitrogenado, que consiste em uma imina ou sal de imínio também gerado in situ a partir de uma amina e um aldeído. Hidroxialdeídos apropriados foram preparados e empregados no acoplamento-A3 juntamente com alquinóis não-protegidos, de modo que a propargilamina resultante contivesse funcionalizações estrategicamente posicionadas visando permitir duas ciclizações via nitrogênio e a conseqüente formação de esqueletos indolizidínicos. Para este mesmo fim, diversas aminas foram testadas no acoplamento, de forma que fosse possível uma N-desproteção compatível com os demais grupos funcionais necessários à síntese dos alcalóides. Dentre estas, dibenzilamina e dialilamina levaram a bons resultados no acoplamento, utilizando um α-hidroxialdeído O-protegido ou um δ-hidroxialdeído livre. Tal metodologia possibilitou a síntese de três propargilaminas a serem utilizadas como intermediários sintéticos na síntese de alcalóides indolizidínicos hidroxilados: 5-(dibenzilamino)-6-((2-metoxietoxi)metoxi)-8- ((tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)oct-3-in-1-ol, 4-(dibenzilamino)oct-2-ino-1,8-diol e 4- (dialilamino)oct-2-ino-1,8-diol; em rendimentos globais de 39% (6 etapas reacionais), 68% (2 etapas) e 57% (2 etapas), respectivamente. Entretanto, no caso específico da propargilamina derivada da dibenzilamina, não obteve-se sucesso nas tentativas de desproteção do nitrogênio e concomitante redução seletiva da ligação tripla à dupla por hidrogenação. / This Masters thesis concerns the results obtained toward the application of amine-aldehyde- akyne coupling reactions (A3) aiming at the synthesis of naturally occurring indolizidine alkaloids, such as deoxycastanospermine and swainsonine. The A3- coupling reaction is a powerful tool for the construction of carbon-carbon and carbon-heteroatom bonds, allowing the preparation of functionalized propargylamines that may be explored as synthetically useful intermediates. The proposal is centered on the coupling reaction between an organometallic reagent, generated in situ from an alkyne and a metallic salt or complex, and a nitrogenated electrofile, consisting of an imine or imminium salt that is also generated in situ from an amine and an aldehyde. Appropriate hydroxyaldehydes were prepared and used in the A3-coupling along with unprotected alkynols, so that the resulting propargylamine contained strategically placed functionalizations aiming to allow two annulations to occur via the nitrogen atom and the consequent formation of indolizidine skeletons. For the same end, several amines were tested in the coupling reaction, so that a N-deprotection compatible with the other funcional groups necessary to the synthesis of the alkaloids would be possible. Among these, dibenzylamine and diallylamine led to satisfactory results in the coupling reaction, using either a O-protected α-hydroxyaldehyde or an unprotected δ-hydroxyaldehyde. This methodology led to the preparation of three propargylamines to be used as synthetic intermediates in the synthesis of hydroxylated indolizidine alkaloids: 5-(dibenzylamine)-6-((2- methoxyethoxy)methoxy)-8-((tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)oct-3-yn-1-ol, 4- (dibenzylamine)oct-2-yne-1,8-diol and 4-(diallylamine)oct-2-yne-1,8-diol; in overall yields of 39% (6 synthetic steps), 68% (2 steps) and 57% (2 steps), respectively. However, in the particular case of the dibenzylamine-derived propargylamine, no success was achieved in the attempts of nitrogen deprotection and concomitant selective reduction of the triple to double bond via hydrogenation.

O cromito de lantânio (LaCrO3) é atualmente o material mais indicado e estudado para utilização como interconector em células a combustível de óxido sólido (HTSOFC). Devido às várias configurações possíveis para este tipo de célula e a complexidade de formas, a utilização de técnicas de conformação envolvendo suspensões cerâmicas concentradas torna-se adequada, pois, se bem controladas, auxiliam na obtenção de peças homogêneas, reprodutivas e de geometrias complexas. Deste modo, os estudos envolvendo o comportamento superficial, as condições de estabilidade das suspensões e o comportamento frente às condições de conformação, ou seja, quanto ao escoamento, fornecem importantes subsídios para controle dos processos na fabricação dos interconectores, onde as configurações mais aplicadas apresentam sulcos e canais para a passagem dos gases. Desta forma realizou-se estudos sobre o comportamento superficial, de estabilidade e reológico de suspensões preparadas com água e etanol, a partir do LaCrO3 dopado com estrôncio e cobalto (La0,80Sr0,20Cr0,92Co0,08O3), sintetizados no IPEN/SP, pela rota de síntese por combustão. A influência dos parâmetros: pH (água), concentração de dispersante, tempos e condições de homogeneização, concentração de sólidos, distintas relações ligante:plastificante, na estabilidade e no comportamento ao fluxo das suspensões cerâmicas preparadas, foram avaliadas. As peças de La0,80Sr0,20Cr0,.92Co0,08O3, obtidas por colagem em moldes porosos a partir de suspensões aquosas utilizando-se pH alcalino e polieletrólito aniônico e, as fitas obtidas utilizando-se etanol como meio dispersor após sinterização a 1600ºC/4 horas apresentaram densidade teórica > 94%, adequadas para utilização como interconector em HTSOFC. / Lanthanum chromite (LaCrO3) is currently the most studied material for applications such as solid oxide fuel cell interconnector (HTSOFC). The complexity of microstructures and geometries of HTSOFC devices, require a precise control of processing parameters to get the desired combination of properties and this, the use of techniques involving concentrated ceramic slips conformation are appropriate, therefore, is well controlled, assist in obtaining homogeneous parts, reproductive and complex geometries. Thus, studies involving the surface chemistry, the stability conditions and slips flow behaviour in the forming conditions, provide important elements for processes control in the interconnectors manufacture, where more applied settings have slots and channels for the gases passage. Thus, surface chemistry, stability and rheological behaviour of strontium and cobalt doped LaCrO3 (La0.80Sr0.20Cr0.92Co0.08O3) slips prepared with ethanol and water, were studied. The doped lanthanum chromite was produced by combustion synthesis in the IPEN/SP labs. The influence of parameters: pH (water), dispersant concentration, homogenization times and conditions, solid concentration, different ratios binder:plasticizer in the stability and the flow behavior of ceramic suspensions prepared were evaluated. The La0.80Sr0.20Cr0.92Co0.08O3 products obtained by casting aqueous slips in a plaster mould, using alkaline pH and anionic polyelectrolyte and tapes obtained by using ethanol as a dispersant medium, after sintering at 1600ºC/4hours presented theoretical density > 94%, suitable for use as HTSOFC interconnector. SUMÁRIO

Esta dissertação de mestrado descreve os resultados obtidos acerca da aplicação de reações de acoplamento entre aldeídos, aminas e alquinos (A3) visando a síntese de alcalóides indolizidínicos de ocorrência natural, como a desoxicastanospermina e a swainsonina. A reação de acoplamento-A3 é uma poderosa ferramenta de construção de ligação carbono-carbono e carbono-heteroátomo, permitindo a preparação de propargilaminas que podem ser exploradas como intermediários de grande potencial sintético. A proposta está baseada na reação de acoplamento de um reagente organometálico, gerado in situ a partir de um alquino e um sal ou complexo metálico, e um eletrófilo nitrogenado, que consiste em uma imina ou sal de imínio também gerado in situ a partir de uma amina e um aldeído. Hidroxialdeídos apropriados foram preparados e empregados no acoplamento-A3 juntamente com alquinóis não-protegidos, de modo que a propargilamina resultante contivesse funcionalizações estrategicamente posicionadas visando permitir duas ciclizações via nitrogênio e a conseqüente formação de esqueletos indolizidínicos. Para este mesmo fim, diversas aminas foram testadas no acoplamento, de forma que fosse possível uma N-desproteção compatível com os demais grupos funcionais necessários à síntese dos alcalóides. Dentre estas, dibenzilamina e dialilamina levaram a bons resultados no acoplamento, utilizando um α-hidroxialdeído O-protegido ou um δ-hidroxialdeído livre. Tal metodologia possibilitou a síntese de três propargilaminas a serem utilizadas como intermediários sintéticos na síntese de alcalóides indolizidínicos hidroxilados: 5-(dibenzilamino)-6-((2-metoxietoxi)metoxi)-8- ((tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)oct-3-in-1-ol, 4-(dibenzilamino)oct-2-ino-1,8-diol e 4- (dialilamino)oct-2-ino-1,8-diol; em rendimentos globais de 39% (6 etapas reacionais), 68% (2 etapas) e 57% (2 etapas), respectivamente. Entretanto, no caso específico da propargilamina derivada da dibenzilamina, não obteve-se sucesso nas tentativas de desproteção do nitrogênio e concomitante redução seletiva da ligação tripla à dupla por hidrogenação. / This Masters thesis concerns the results obtained toward the application of amine-aldehyde- akyne coupling reactions (A3) aiming at the synthesis of naturally occurring indolizidine alkaloids, such as deoxycastanospermine and swainsonine. The A3- coupling reaction is a powerful tool for the construction of carbon-carbon and carbon-heteroatom bonds, allowing the preparation of functionalized propargylamines that may be explored as synthetically useful intermediates. The proposal is centered on the coupling reaction between an organometallic reagent, generated in situ from an alkyne and a metallic salt or complex, and a nitrogenated electrofile, consisting of an imine or imminium salt that is also generated in situ from an amine and an aldehyde. Appropriate hydroxyaldehydes were prepared and used in the A3-coupling along with unprotected alkynols, so that the resulting propargylamine contained strategically placed functionalizations aiming to allow two annulations to occur via the nitrogen atom and the consequent formation of indolizidine skeletons. For the same end, several amines were tested in the coupling reaction, so that a N-deprotection compatible with the other funcional groups necessary to the synthesis of the alkaloids would be possible. Among these, dibenzylamine and diallylamine led to satisfactory results in the coupling reaction, using either a O-protected α-hydroxyaldehyde or an unprotected δ-hydroxyaldehyde. This methodology led to the preparation of three propargylamines to be used as synthetic intermediates in the synthesis of hydroxylated indolizidine alkaloids: 5-(dibenzylamine)-6-((2- methoxyethoxy)methoxy)-8-((tetrahydro-2H-pyran-2-yl)oxy)oct-3-yn-1-ol, 4- (dibenzylamine)oct-2-yne-1,8-diol and 4-(diallylamine)oct-2-yne-1,8-diol; in overall yields of 39% (6 synthetic steps), 68% (2 steps) and 57% (2 steps), respectively. However, in the particular case of the dibenzylamine-derived propargylamine, no success was achieved in the attempts of nitrogen deprotection and concomitant selective reduction of the triple to double bond via hydrogenation.

The objective of this study was to analyze comparative ly the kinetics of transesterification of soy bean oils and castor oil mixed with respect to the submitted oil to the interesterification process of the same starting oils. Initially, it was done the transesterification of the mixture of oils and determination of their income; then, the starting oils were subjected to interesterification process and the obtained oil was transesterified by determining incomes of it as methylesters (biodiesel). In both cases, the reactions were carried out under the same reaction conditions, but at different times. Transesterifications were performed at 5, 10, 15, 30, 45, 60, 120 and 180 minutes. Both the mixture of those oils and the interesterified oil were subjected to chromatographic analysis, infrared spectroscopy Fourier transform, nuclear magnetic resonance of hydrogen, determination of kinematic viscosity. Analogous procedures have been developed for biodiesel obtained from the mixture and the interesterified oil. For purposes of obtaining the correction factor were produced biodiesel standards (B100) for both the mixture and for the interesterified oil. In the latter, the standard had to be done again five times to obtain the desired B100. The result of analyzes confirmed that the transesterification of interesterified oil is not the best route for the production of biodiesel, for comprise more costly and time consuming, complex and presents greater difficulties in reaction than the transesterification of the mixture of soy bean oil and castor oil. / O objetivo deste trabalho foi analisar, comparativamente, a cinética da transesterificação de óleos de soja e de mamona misturados em relação ao óleo gerado no processo de interesterificação desses mesmos óleos de partida. Inicialmente, fez-se a transesterificação da mistura dos óleos e determinação do seu rendimento; em seguida, os óleos de partida foram submetidos ao processo de interesterificação e o óleo obtido foi transesterificado, determinando-se os seus rendimentos em termos de ésteres metílicos (biodiesel). Nos dois casos, as reações foram realizadas nas mesmas condições reacionais, sendo variados apenas os tempos reacionais. Foram feitas transesterificações em 5, 10, 15, 30, 45, 60, 120 e 180 minutos. Tanto a mistura de óleos quanto o óleo interesterificado foram caracterizados porcromatografia gasosa, viscosidade cinemática e índice de acidez. Os biodieseis obtidos, a partir da mistura e do óleo interesterificado, foram caracterizados por cromatografia gasosa,espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier e ressonância magnética nuclear de hidrogênio. Para fins de obtenção do fator de correção foram produzidos padrões de biodiesel (B100) tanto para a mistura quanto para o óleo interesterificado. Desse último, o padrão precisou ser refeito cinco vezes até a obtenção do B100 desejado. Verificou-se que a simples obtenção da composição em ácidos graxos de uma mistura de óleos, não é suficiente para a previsão cinética da reação. Verificou-se, igualmente, que o óleo interesterificado a partir da mistura de óleos de mamona e soja (1:1) tem características diferentes, quanto a sua composição em TAGs, daquele da simples mistura original. A viscosidade desses óleos e a cinética de reação são significativamente diferentes, mesmo que levem ao mesmo produto final.

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:04:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 23.pdf: 6208595 bytes, checksum: 560226dd418c8b7cdf79aa7955f3ab5c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / A detecção precoce das leishmanioses e a rápida instituição do tratamento são de suma importância para os indivíduos e comunidades afetadas, visto que pacientes contribuem para a manutenção do ciclo da doença. Diante das limitações apresentadas pelos métodos tradicionais de diagnóstico, a PCR tem se apresentado como ferramenta promissora para a detecção dos casos. No entanto, perdas de DNA durante o processo de purificação podem afetar mais significativamente o material genético dos parasitos, gerando resultados falso-negativos. Este estudo teve como objetivo desenvolver e avaliar dois protocolos de triplex PCR para investigar possíveis causas de negatividade no diagnóstico molecular das formas visceral (LV) e tegumentar (LT) das leishmanioses. Pares de primers para detecção de um controle interno (gene G3PD) e dois controles externos (DNA genômico de M. pachydermatis e plasmídeo comercial pUC18 foram adaptados a protocolos de PCR convencionais validados para a detecção de L. infantum e L.(V.) braziliensis e duas reações triplex foram otimizadas. Dados de sensibilidade (S), especificidade (E) e eficiência (e) dos novos sistemas foram calculados em 186 amostras de sangue coletadas de cães em áreas endêmicas, utilizando como referência protocolos de PCR e PCR em tempo real (qPCR) consagrados na literatura / A concordância entre os novos testes e os testes de referência foi determinada pelo cálculo do índice de Kappa. A tríplex PCR para o diagnóstico da LV mostrou S = 78.68 por cento, E= 85.29 por cento e e= 81.05 por cento com boa concordância (K = 0.60, p < 0.0001) com o conjunto de resultados PCR/qPCR. Para o diagnóstico da LT observou-se S = 97.29 por cento, E = 79.16 por cento, e = 90.16 por cento, com K = 0.78, (p < 0.0001) indicando excelente nível de concordância entre os testes. As novas ferramentas apresentadas podem ser aplicadas para aumentar a acurácia no diagnóstico das leishmanioses, contribuindo para a rápida implementação do tratamento e, reduzindo a longo prazo os índices de mortalidade e morbidade das leishmanioses

Made available in DSpace on 2016-03-08T14:00:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 daniela_pereira_ioc_dout_2010.pdf: 4935523 bytes, checksum: a1a6007d45d89b72eecfd82e24256149 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / No presente estudo, a metodologia de PCR multiplex seguida de hibridização não radioativa direcionada para a região conservada dos minicículos do kDNA (gênero Leishmania) e para o gene constitutivo cacophony de flebotomíneo (gênero Lutzomyia) foi inicialmente empregada para a avaliação da taxa de infecção natural em flebotomíneos provenientes de diferentes áreas endêmicas de LT e LV do Brasil, as quais apresentam diferentes graus de endemicidade e transmissão para uma ou outra forma da doença. Para a determinação do índice de infecção natural, considerou-se o mínimo de 1 (um) inseto infectado em cada pool positivo. Em Saquarema, foram constituídos polls de Lu. Intermédia (13\2642 / 30\2640) e Lu. Migonei (0\2642 / 3\2640), sendo que nehum grupo de fêmea foi positivo para infecção por Leishmania spp. O mesmo ocorreu em Além Paraíba e Rio Bonito, onde foram coletados exemplares apenas de Lu. Intermédia, totalizando a formação de pools consistindo de 11\2642 / 30\2640 e 8\2642 / 27\2640, respectivamente. No município do Rio de Janeiro foram constituídos polls de Lu. intermedia (27\2642 / 32\2640 ), onde 5/32 (15,6%) grupos de fêmeas forampositivos (dois da localidade Pau da Fome e três de Colônia Juliano Moreira), e Lu. Migonei (8\2642 / 5\2640) com 3/5 (60%) polls de fêmeas positivos (um de Colônia Jmoreira e 2 de Pau da Fome). Os ensaios de hibridização confirmaminfecção por L. (V.) braziliensis nos 8/37 pools positivos, indicando un índice mínimo de infecção natural de cerca de 2% nos flebótomos avaliados. Em Porto Alegre também foram obtidos resultados positivos para infecção por L. (V.) braziliensis em 3/98 (3,1%) grupos de fêmeas de Lu. Neivai e 2/52 correspondentes à Lu. Fischerii (3,8%), representando um índice mínimo de infecção natural de cerca de 0,3% para as duas espécies de flebótomos. Não foram obtidos resultados positivos para os pools de fêmeas de Lu. Migonei (n=28) e Lu. Lanei (n=2) coletados na região. Os resultados de Porto Alegre permitiram confirmar estudos prévios que sugeriram Lu. Neivai como principal vetor de LTA no municipio. Em Corumbá foram formados polls para as espécies Lu. Cruzi (12\2642 / 13\2640) e Lu. Foratinii (6\2642 / 14\2640). Nesse município identificamos infecção por L. Infantum chagasi em 2/13 (15,4%) amostras de fêmeas de Lu. Cruzi e em 1/14 (7,1%) de Lu. Forattinii, representando um índice total de infecção natural de 1,1% (3/27). Os dados obtidos em Corumbá reafirmaram a importância de Lu. Cruzi como principal espécie vetora de LV no município, além de sugerir o papel de Lu. Forattinii como segunda espécie transmissora da doença nesta região. Visando o estudo da estimativa da carga parasitária nos pools de fêmeas que foram positivos pelos ensaios de PRC multiplex-hibridização, padronizamos a metodologia de PRC em tempo real, utilizando o sistema de detecção SYBR Green (para os dois alvos separadamente \2013 cacophony e kDNA), o qual nos permitiu detectar, quantificar e também diferenciar os parasitos no nível de subgênero, através da curva de dissociação dos produtos amplificados dos kDNA. Em relação às amostras provenientes de Corumbá, os polls positivosapresentaram uma quantificação de cerca de 100 parasitos/pool (2 de Lu. Cruzi e 1 de Lu. Foratinii). Além desses, dois novos polls de Lu. Foratinii foram positivos, com cerca de 10 e 1 parasitos cada. Em Porto Alegra, dos 5 pools positivos pela PCR multiplex, 3 foram quantificados com cerca de 100 parasitos (2 Lu. Neivai e 1 Lu fischerii), os outros 2 apresentaram uma média de 10 parasitos (1 lu. Neivai e 1 Lu. Fischeri). As amostras coletadas no Rio de Janeiro apresentaram uma quantidade média de 10 parasitos cada (4 de Lu. Intermedia e 3 de Lu. Migonei), sendo que um polls de Lu. Intermedia positivo pelo diagnóstico qualitativo não pôde ser avaliado quantitativamente. A análise das curvas de dissociação para a determinação dos valores de Tm dos produtos amplificados do kDNA de promastigotas de L. (V.) braziliensis e L. (L.)chagasi, corroboraram os resultados prévios de diagnóstico pelos ensaios de PRC multiplex-hibridização. Investigações diagnósticasque possibilitem a detecção, correta identificação e quantificação de carga parasitária por Leishmania spp na fauna flebotomínea em áreas com notificações de LTA e/ou LVA em humanos ou reservatórios animais, certamente contribuem para uma maior visão do quadro de veiculação das espécies de parasitos nas distintas áreas, fornecendo dados importantes para a compreensão da eco-epidemiologia dessas doenças nas respectivas áreas / In this study, t he multiplex PCR methodology was initially established with the purpose of assessing the natural infection rate in sand flies from different endemic areas of CL and VL in Brazil, which consist of various degrees of endemicity and transmission to all the fo rms of the disease. It is followed by non - radioactive hybridization, focused on the conserved area of kDNA minicircle ( Leishmania ) and the constitutive gene cacophony of sand fly ( Lutzomyia genus ). To determine the rate of natural infection, it was conside red a minimum of one (1) infected insect to each positive pool. In Saquarema, pools of Lu. intermedia (13 ♂ / 30 ♀) and Lu. migonei (0 ♂ / ♀ 3) were identified and no female groups were positive for infection with Leishmania spp. It also occurred in Além Paraíba and Rio Bonito, where there were only collected specimens of Lu. intermedia , leading to the es tablishment of pools, comprising of 11 ♂ / 30 ♀ and 8 ♂ / 27 ♀, respectively. In the district of Rio de Janeiro there were pools of Lu. intermedia (27 ♂ / 32 ♀), in which 5 / 32 (15.6%) females groups were positive (two from Pau da Fome and three from Colo nia Juliano Moreira), as well as 3 / 5 (60%) positive females pools of Lu. migonei (8 ♂ / ♀ 5) (one of them from Colonia Juliano Moreira and the other two from Pau da Fome). Hybridization tests have confirmed the infection by L. (V.) braziliensis in 8 / 37 of the positive pools, indicating a minimum rate of natural infection of approximately 2% of the evaluated sand flies. In Porto Alegre, positive results were also obtained for infection by L. (V.) braziliensis in 3 / 98 (3.1%) females groups of Lu. neivai and 2 / 52 corresponding to Lu. fischerii (3.8%), representing a minimum rate of natural infection of approximately 0.3% for the two species of sand flies. No positive results were obtained for females pools of Lu. migonei (n = 28) and Lu. lanei (n = 2) w hich were collected in the area. The results from Porto Alegre helped to confirm previous studies suggesting Lu.neivai as the district’s main vector of leishmaniasis. In Corumbá, there were obtained pools for the species Lu. cruzi (12 ♂ / 13 ♀) and Lu. for atinii (6 ♂ / 14 ♀). We identified an infection by L. infantum chagasi in 2 / 13 (15.4%) samples from females of Lu. cruzi and 1 / 14 (7.1%) females of Lu. foratinii , representing a total rate of natural infection of 1.1% (3 / 27). The obtained data in Cor umbá reassured the importance of Lu. cruzi as the district’s VL main vector species and also suggested the role of Lu. forattinii as the second disease transmitter species in this area. Aiming at the estimate study of parasite load in positive females poo ls, according to multiplex PCR - hybridization, we standardized the real - time PCR methodology, using SYBR Green detection system (for both targets individually - cacophony and kDNA), which allowed us to detect, quantify and differentiate the level of parasit es in the subgenus by means of kDNA amplified products dissociation curve. Regarding Corumbá’s samples, the positive pools showed an amount of approximately 100 worms / pool (2 Lu. cruzi and 1 Lu. foratinii ). Furthermore, two new Lu. foratinii pools were positive approximately with 10 and 1 parasite respectively. In Porto Alegre, from a total of 5 positive pools, 3 of them were identified according to multiplex PCR in approximately 100 parasites (2 Lu. neivai and 1 Lu.fischerii ) and the other 2 had an av erage of 10 parasites (1 Lu. neivai 1 and Lu. fischerii ). The samples collected in Rio de Janeiro had an average amount of 10 parasites each (4 Lu. Intermedia and 3 Lu migonei ). One of them, which was positive according to qualitative diagnosis, could not be quantitatively evaluated. The analysis of dissociation curves for determining the Tm values of kDNA amplified products of promastigotes of L. (V.) braziliensis and L. (L.) chagasi corroborated the previous results of diagnostic testing by means of PCR multiplex hybridization. Thus, it is important to highlight that diagnostic investigations will certainly contribute to a greater view of the scope of the establishment of parasite species in different areas, providing important data for the understanding of the eco - epidemiology of these diseases. This process allows the detection, proper identification and quantification of parasite burden in Leishmania spp sand fly fauna in areas reporting ACT and / or AVL in humans or animal reservoirs