abstract: Despite the safe and effective use of attenuated vaccines for over fifty years, measles virus (MV) remains an insidious threat to global health. Problematically, infants less than one year of age, who are the most prone to severe infection and death by measles, cannot be immunized using current MV vaccines. For this dissertation, I generated and performed preclinical evaluation of two novel MV vaccine candidates. Based on data from clinical trials that showed increasing the dosage of current MV vaccines improved antibody responses in six-month-old recipients, I hypothesized that increasing the relevant antigenic stimulus of a standard titer dose would allow safe and effective immunization at a younger age. I generated two modified MVs with increased expression of the hemagglutinin (H) protein, the most important viral antigen for inducing protective neutralizing immunity, in the background of a current vaccine-equivalent. One virus, MVvac2-H2, expressed higher levels of full-length H, resulting in a three-fold increase in H incorporation into virions, while the second, MVvac2-Hsol, expressed and secreted truncated, soluble H protein to its extracellular environment. The alteration to the virion envelope of MVvac2-H2 conferred upon that virus a measurable resistance to in vitro neutralization. In initial screening in adult mouse models of vaccination, both modified MVs proved more immunogenic than their parental strain in outbred mice, while MVvac2-H2 additionally proved more immunogenic in the gold standard MV-susceptible mouse model. Remarkably, MVvac2-H2 better induced protective immunity in the presence of low levels of artificially introduced passive immunity that mimic the passive maternal immunity that currently limits vaccination of young infants, and that strongly inhibited responses to the current vaccine-equivalent. Finally, I developed a more physiological infant-like mouse model for MV vaccine testing, in which MV-susceptible dams vaccinated with the current vaccine-equivalent transfer passive immunity to their pups. This model will allow additional preclinical evaluation of the performance of MVvac2-H2 in pups of immune dams. Altogether, in this dissertation I identify a promising candidate, MVvac2-H2, for a next generation measles vaccine. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Molecular and Cellular Biology 2016

A malária é uma das prioridades da pesquisa mundial na área de desenvolvimento de vacinas. Apesar da contínua e crescente atividade de pesquisa nessa área, ainda não existe uma vacina capaz de impedir a infecção pelo Plasmodium spp. Devido ao complexo ciclo de vida deste agente, uma formulação vacinal eficaz para a indução de uma resposta imune protetora deverá conter uma combinação de regiões imunodominantes de antígenos do parasita. Portanto, este trabalho visou caracterizar a resposta imune humoral induzida pela imunização experimental de camundongos com o Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1), região C-terminal da Proteína 1 da Superfície do Merozoíto e a Proteína 3β da Superfície do Merozoíto de P. vivax, administradas isoladamente ou em combinação. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e por cromatografia de troca iônica, posteriormente foram analisadas por RP-HPLC confirmando o elevado nível de pureza das amostras. A imunogenicidade dessas formulações foi avaliada em duas linhagens de camundongos BALB/c e C57BL/6, e na presença de dois adjuvantes Quil A e Poly I:C. Os títulos de anticorpos IgG foram determinados por ELISA. Os camundongos C57BL/6 imunizados com a combinação dos antígenos, emulsificados em Quil A ou Poly I:C apresentaram altos títulos de anticorpos (log10>4), assim como os camundongos imunizados com os antígenos administrados individualmente. Em contraste, os camundongos BALB/c imunizados com a combinação dos antígenos apresentaram títulos de anticorpos mais baixos contra a proteína MSP119 ou contra as proteínas MSP119 e AMA-1 quando administradas na presença dos adjuvantes Quil A e Poly I:C, respectivamente. Interessantemente, observamos um aumento significativo nos títulos de anticorpos dos camundongos C57BL/6 imunizados com a combinação dos antígenos emulsificados em Poly I:C contra a proteína MSP3β. A razão entre as subclasses de IgG mostraram um perfil de reposta mista Th1/Th2, em todos os grupos testados. Os anticorpos específicos mantiveram-se elevados por 6 meses após a última imunização, mostrando que a resposta imune induzida pelas imunizações experimentais foi duradoura. Nossos dados, em conjunto, demonstram que a combinação de antígenos pode ser uma estratégia promissora de vacinação contra a malária. / Malaria is one of the priorities of global research in the area of vaccine development. In spite of the continuing and growing research activity in this area, there is still no vaccine to prevent infection by Plasmodium spp. Due to the complex life cycle of this agent, an effective vaccine formulation to elicit protective immune responses should contain a combination of immunodominant regions of parasite antigens. Therefore, this study aimed at characterizing the humoral immune response induced by experimental immunization of mice with Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1), C-terminal region of the Merozoite Surface Protein 1 and Merozoite Surface Protein 3β of P. vivax, provided either alone or as a combination. The recombinant proteins were purified by affinity and ion exchange chromatography, subsequently were analyzed by RP-HPLC to confirm the high purity of the samples. The immunogenicity of these formulations was evaluated in BALB/c and C57BL/6 mice, administered in the presence of two different adjuvants, Quil A or Poly I:C. The humoral immune response was measured by IgG antibody titers using ELISA. C57BL/6 mice immunized with the recombinant antigen combination in the presence of Quil A or Poly I:C adjuvants showed high antibody titers (log10>4) similar to mice inject with a single antigen alone. In contrast, BALB/c mice immunized with the recombinant antigen combination had lower antibody titers to MSP119 or to MSP119 and AMA-1 when administered in the presence of Quil A or Poly I:C adjuvants, respectively. Interestingly, we observed a significant increased in the antibody titers of the C57BL/6 mice receiving the combination of antigens against MSP3β protein in Poly I:C. The ratio between the IgG subclasses profile showed a mixed Th1/Th2 response in all groups tested. Specific antibodies were still high six months after the last immunizing dose indicating a long lived immune response. Together, our data show that the combination of antigens may be an effective strategy for immunization against malaria.

A malária é um problema de saúde pública no Brasil e no mundo. Em 2016, o número de casos estimado pela Organização Mundial de Saúde foi de 216 milhões. Plasmodium falciparum é a espécie mais prevalente e responsável pelo maior número de mortes no mundo, sobretudo no continente africano. Por outro lado, o Plasmodium vivax é conhecido por sua ampla distribuição geográfica, sendo a espécie que predomina nas Américas, incluindo o Brasil. Nos últimos 20 anos, nosso grupo tem gerado e caracterizado diversas proteínas recombinantes baseadas em antígenos imunodominantes de P. vivax que podem servir como base para o desenvolvimento de uma vacina contra malária. Entre os antígenos de merozoítas, uma das principais proteínas em estudo pelo nosso grupo é o Antígeno 1 de Membrana Apical de P. vivax (PvAMA-1), caracterizado previamente como altamente imunogênico em infecções naturais e em camundongos imunizados, na presença de diferentes adjuvantes. O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da diversidade antigênica dessa proteína no reconhecimento por anticorpos específicos e na indução de imunidade contra o parasita. Para isso, foram geradas seis novas proteínas representando diferentes alelos descritos na natureza: PvAMA-1-Belem, PvAMA-1-Sal-I, PvAMA-1-Chesson-I, PvAMA-1-SK0814-apical, PvAMA-1-Indonesia-XIX e PvAMA-1-PNG_62_MU. As proteínas recombinantes foram expressas em leveduras Pichia pastoris e purificadas em duas etapas cromatográficas. Em seguida, as imunizações em camundongos C57BL/6 foram realizadas com as proteínas administradas de forma isolada, ou em combinação, na presença do adjuvante agonista de TLR3 (Poly I:C). Por ELISA, observamos que todas as formulações foram capazes de induzir anticorpos IgG contra as proteínas homólogas e heterólogas, o que sugere que a diversidade antigênica entre as formas alélicas não compromete o reconhecimento. Os dados gerados no presente trabalho sugerem que uma formulação contendo mistura de diferentes alelos representando a proteína AMA-1 pode ser explorada para o desenvolvimento de uma vacina de ampla cobertura contra o P. vivax. / Malaria is a public health problem in Brazil and throughout the world. In 2016, the World Health Organization estimated there were 216 million cases of malaria. Plasmodium falciparum is the most prevalent species and is responsible for the largest number of deaths, especially in the African continent. However, Plasmodium vivax is known for its wide geographic distribution, being the species that prevails in the Americas, including Brazil. In the last 20 years, our group has generated and characterized several recombinant proteins based on immunodominant antigens of P. vivax that can serve as a basis for the development of a malaria vaccine. Among the merozoite antigens, one of the main proteins studied by our group is P. vivax apical membrane antigen-1 (PvAMA-1), previously characterized as highly immunogenic in natural infections and immunized mice, in the presence of different adjuvants. The objective of this study was to investigate the effect of antigenic diversity of this protein in the recognition of specific antibodies and the induction of immunity against the parasite. For this, six new proteins were generated representing different alleles described in nature: PvAMA-1-Belem, PvAMA-1-Sal-i, PvAMA-1-Chesson-i, PvAMA-1-SK0814-apical, PvAMA-1-Indonesia-XIX, and PvAMA-1-PNG_62_MU. Recombinant proteins were expressed in Pichia pastoris yeast and purified by two chromatographic stages. Then, C57BL/6 mice were immunized with these proteins administered in isolation or in combination, in the presence of the TLR3 agonist adjuvant, Poly I:C. Using an enzyme-linked immunosorbent assay, we observed that all formulations induced IgG antibodies against homologous and heterologous proteins. This indicates that antigenic diversity between allele forms does not compromise recognition. This finding suggests that a formulation containing a mixture of different alleles representing the PvAMA-1 protein can be exploited for developing of a wide coverage vaccine against P. vivax.

O avanço no desenvolvimento de uma vacina contra o Plasmodium vivax exige a identificação de antígenos capazes de induzir uma resposta imune protetora contra a malária. O presente estudo avalia o potencial da proteína-3 da superfície de merozoítos de P. vivax (PvMSP-3), como candidata a vacina. As proteínas recombinantes representando a região C-terminal da MSP-3α e diferentes regiões (N e C-terminal e proteína inteira) da MSP-3β de P. vivax foram utilizadas como antígeno. A imunogenicidade destas proteínas recombinantes foi avaliada em camundongos BALB/c, utilizando adjuvantes agonistas de TLR (flagelina FliC de Salmonella Typhimurium e CpG ODN) ou adjuvantes convencionais, tais como hidróxido de alumínio, saponinas, TiterMax Gold e adjuvante incompleto de Freund. Os títulos de anticorpos IgG foram determinados por ELISA utilizando soros de camundongos coletados duas semanas após cada dose de imunização. Nossos resultados demonstraram que a MSP-3α e a MSP-3β foram capazes de induzir altos títulos de anticorpos em camundongos na presença de diferentes adjuvantes, incluindo agonistas de TLR. Dentre as formulações testadas, aquelas contendo os adjuvantes CPG ODN 1826, Quil A, TiterMax e adjuvante incompleto de Freund foram mais imunogênicas e, portanto, mais promissoras para os ensaios pré-clínicos em primatas não-humanos. Usando camundongos TLR-4 KO, nós demonstramos que a proteína MSP-3β tem uma propriedade adjuvante intrínseca que é independente do TLR4 e que a contaminação por LPS na proteína purificada não desempenha qualquer papel no nosso sistema. / The advance in the development of a vaccine against Plasmodium vivax requires the identification of immunodominant antigens able to induce a protective immune response against malaria. The present study evaluates the potential of the Merozoite Surface Protein 3 of P. vivax (PvMSP-3) as vaccine candidate. Recombinant proteins representing the C-terminal region of MSP-3α and different regions of MSP-3β (N and C-terminal and full-length protein) of P. vivax were used as antigen. The immunogenicity of these recombinants was evaluated in BALB/c mice using as adjuvant TLR agonists (FliC flagellin of Salmonella Typhimurium and CpG motif-containing DNA) or conventional adjuvants such as Aluminum hidroxide, Saponins, TiterMax Gold and Incomplete Freund\'s Adjuvant. The IgG antibodies were determined by ELISA in sera from mice two weeks after each immunizing dose. Our results demonstrated that MSP-3α and MSP-3β were able to induce high antibody titres in mice in the presence of different adjuvants, including TLR agonists. Among the tested formulations, the adjuvants CPG ODN 1826, Quil A, TiterMax and Incomplete Freund\'s Adjuvant were more immunogenic, therefore more promising for pre-clinical trials in non-human primates. Using TLR-4 KO mice, we demonstrated that the MSP-3β protein has an intrinsic adjuvant property that is independent of TLR4 and that contaminating LPS in the purified protein did not play any role in our system.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:38:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_samuel_felix.pdf: 602038 bytes, checksum: eceae88e84666382061d981461317748 (MD5) Previous issue date: 2009-11-27 / Leptospirosis is a disease caused by pathogenic spirochetes of the Leptospira genus. It is the most widespread zoonosis in the world, representing a veterinarian and public health problem especially in developing countries. From a veterinarian point of view, leptospirosis is important both as a medical problem, mainly in dogs, which can suffer the ailment as well as transmit it, and as an economic problem, mainly in cattle and pigs, where it causes direct production and reproductive losses. Vaccination of these animals is largely applied, however protection is limited. Conventional vaccines confer protection restricted to the sorovars present in the preparation and fail to protect against renal infection, allowing seemingly healthy animals to shed bacteria, and produce short term protection requiring frequent revaccination. The vaccines are also available for humans, but are used only in a few countries such as Cuba and China. The goal of this work was to test the immune protective potential of recombinant Leptospira interrogans proteins produced in Escherichia coli, using the hamster model. Twenty recombinant vaccine candidates were produced and inoculated in hamsters in two doses, fourteen days apart. Two weeks after the second dose all animals were challenged with 100 leptospires (~2xLD50). After the challenge, animals were observed daily for disease. Of all the proteins tested, seven protected animals to some extent, ranging from 16.7% to 50%. Two proteins presented promising results, and were recommended for further studies, as potential leptospira subunit vaccine candidates. / A leptospirose é uma doença causada por espiroquetas do gênero Leptospira. Ela é a zoonose mais difundida no mundo, sendo um problema de saúde pública e veterinária, principalmente em países em desenvolvimento. Na área de veterinária, a leptospirose é preocupante do ponto de vista clínico e econômico, devido ao risco à saúde pública, perdas reprodutivas e óbitos. A vacinação animal é amplamente realizada como medida de prevenção da enfermidade. Entretanto, a proteção conferida pelas vacinas convencionais é limitada aos sorovares nelas presentes, não evitando o estado portador, mantendo assim o potencial transmissor desses animais, para humanos e outros animais. Por outro lado, vacinas para humanos estão disponíveis e empregadas em alguns países como a China e Cuba. O objetivo deste trabalho foi avaliar, em modelo animal, proteínas recombinantes de Leptospira interrogans quanto ao seu potencial imunoprotetor. Para tanto, vinte proteínas foram expressas em Escherichia coli e, após a adsorção em hidróxido de alumínio, foram administradas em hamsters através da via intramuscular, em duas doses, com intervalo de 14 dias. Duas semanas após a segunda dose realizou-se o desafio dos animais com 100 leptospiras (~2xDL50). Após o desafio, os animais foram observados diariamente para o aparecimento de sinais clínicos da enfermidade e óbitos, e após 24 dias procedeu-se a eutanásia e necropsia dos animais sobreviventes. Como resultado da avaliação realizada, sete proteínas conferiram proteção ao modelo animal que variou de 16,7% a 50%. Das proteínas que apresentaram maiores níveis de proteção, duas foram indicadas como possíveis candidatas à vacina recombinante contra leptospirose.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_daiane_drawanz_hartwig.pdf: 4007239 bytes, checksum: 7d50e5824c8c66e23049bd005ad56ea6 (MD5) Previous issue date: 2010-12-20 / Leptospirosis is a serious infectious disease caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira, it is classified as a zoonosis of worldwide distribution. This disease results morbidity and mortality in humans and animals, justifying the application of prophylactic strategies. Current vaccines against leptospirosis are composed of inactivated bacteria and do not stimulate cross-protection. Thus, there is need to develop a safe and effective vaccine. In this study, we used the outer membrane proteins LigANI e LipL32, because they have been identified as vaccinogens. These, in their recombinant form, are usually expressed in Escherichia coli and as subunit vaccines have shown variable efficacy. We describe in this work the use of Pichia pastoris as an alternative expression system. The genes ligANI and lipL32 were cloned into vector pPICZαB, which allowed the secretory expression of proteins in P. pastoris. The protein yield in this system was 276 mg/L for LigANI and 285 mg/L for LipL32. The recombinant proteins were glycosylated and remained antigenic. The immunoprotective potential was evaluated in the hamster model, challenged with virulent L. interrogans serovar Copenhageni. Both proteins induced high levels of antibodies (P < 0.001). The animals immunized with LigANI and LipL32 using aluminium hydroxide as adjuvant, showed no protection against challenge, but showed a significant increase in survival (P < 0.001). In conclusion, the yeast P. pastoris has proved an efficient heterologous expression system of LigANI and LipL32 L. interrogans proteins. The secreted and glycosylated LigANI protein may be used in the control of leptospirosis, although additional studies are needed. / Leptospirose é uma doença infecciosa grave causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, sendo classificada como uma zoonose de ampla distribuição mundial. Esta doença resulta morbidade e mortalidade em humanos e animais, justificando a aplicação de estratégias profiláticas. As vacinas atuais contra a leptospirose são compostas por bactérias inativadas e não estimulam proteção cruzada. Assim, existe a necessidade de desenvolver uma vacina efetiva. No presente estudo, as proteínas de membrana externa LigANI e LipL32 foram utilizadas, pois são apontadas como potenciais vacinógenos. Estas, em sua forma recombinante, costumam ser expressas em Escherichia coli e, como vacina de subunidade tem apresentado eficiência variável. Nós descrevemos neste trabalho a utilização da levedura Pichia pastoris como sistema de expressão alternativo. Os genes ligANI e lipL32 foram clonados no vetor pPICZαB, que permitiu a expressão secretória das proteínas em P. pastoris. O rendimento das proteínas neste sistema foi de 276 mg/L para LigANI e 285 mg/L para LipL32. As proteínas recombinantes foram glicosiladas e mantiveram-se antigênicas. O potencial imunoprotetor das proteínas foi avaliado em modelo hamster desafiado com cepa virulenta de L. interrogans sorovar Copenhageni. Ambas as proteínas induziram altas taxas de anticorpos (P < 0,001). Os animais imunizados com LigANI e LipL32, utilizando hidróxido de alumínio como adjuvante, não apresentaram proteção contra o desafio, mas demonstraram um aumento significativo na sobrevida (P < 0,001). Em conclusão, a levedura P. pastoris demonstrou ser um eficiente sistema de expressão heterólogo das proteínas LigANI e LipL32 de L. interrogans. A proteína LigANI secretada e glicosilada pode ser utilizada no controle da leptospirose, embora estudos adicionais sejam necessários.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_andre_grassmann.pdf: 1497268 bytes, checksum: 73f55a329ef2c9be70227b63b45785a2 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Leptospirosis is an infectious disease that affects humans, wild and domestic animals worldwide. Pathogenic spirochetes from the Leptospira genus are the causative agents of this zoonosis. The several Leptospira species have noted antigenic diversity, even within the same species. This is the main reason current bacterin vaccines have limitations, such as adverse effects and short term immunity, restricting their use in human populations. The need for effective leptospirosis vaccines promoted studies on characterization of new vaccine candidates. The 32 kDa outer membrane lipoprotein, LipL32, is the most abundant protein in the whole leptospira proteome, it is conserved in all pathogenic serovars and absent in saprophytes. This protein is immunogenic and able to bind to mammalian extracellular matrix. However, LipL32 subunit vaccines did not protect animals against challenge. In an attempt to solve this, we use LipL32 fused and coadministered with B subunit of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LTB) to enhance the immune response. LTB is a non-toxic molecule with immunoestimulatory and immunomodulatory properties. The recombinant proteins rLTB, rLipL32 and rLTB::LipL32 were expressed in E. coli, purified and characterized. Female hamsters were distributed in groups as follows: rLTB; rLTB+rLipL32; rLTB::LipL32, homologous bacterin; PBS. The serum from each animal was collected for humoral immune response determination by ELISA. The animals were challenged with 5×LD50 dose of Leptospira interrogans strain Fiocruz L1-130. Both treatments induced high titers of anti-rLipL32 antibodies. The rLTB+rLipL32 and rLTB::LipL32 treatments afforded significant protective response upon challenge, when compared to control groups (p<0.05). No prior study with leptospirosis had used LTB as the adjuvant, or fused antigens in an attempt to control this disease. Furthermore, this is the first report of a protective subunit vaccine using rLipL32 as the antigen, and an important contribution towards the development of improved leptospirosis vaccines. / A leptospirose é uma doença infecciosa que afeta humanos e animais silvestres e domésticos em todo mundo. As espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira são os agentes causadores desta zoonose. As diversas espécies de leptospiras possuem notada diversidade antigênica, inclusive em uma mesma espécie. Esta característica resulta em limitação das atuais vacinas bacterinas que não induzem proteção cruzada entre os diferentes sorovares. Além disso, estas vacinas geram efeitos adversos e imunidade de curta duração, restringindo seu uso em populações humanas. A necessidade de novas vacinas eficazes contra a leptospirose estimulou estudos para caracterizar novos antígenos vacinais. A lipoproteína de membrana externa de 32 kDa, LipL32 é a proteína mais abundante no proteoma total da leptospira, conservada entre todos os sorovares patogênicos e ausente nas leptospiras saprófitas. Esta proteína é imunogênica e possui habilidade de ligar-se à matriz extracelular de mamíferos. Porém, animais inoculados com vacinas de subunidade utilizando LipL32 não sobrevivem ao desafio. Em função disso, utilizamos LipL32 fusionada e co-administrada com a subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB) para melhorar a resposta imune. LTB é uma molécula atóxica com reconhecida atividade imunoestimuladora e imunomoduladora. As proteínas recombinantes rLTB, rLipL32 e rLTB::LipL32 foram produzidas em E. coli, purificadas e caracterizadas. Hamsters fêmeas foram distribuídas em grupos e inoculadas com duas doses, da seguinte forma: rLTB; rLTB+rLipL32; rLTB::LipL32, bacterina homóloga e PBS. Soro foi coletado individualmente para determinação da resposta imune humoral por ELISA. Os animais foram desafiados com uma dose de 5×DL50 de Leptospira interrogans cepa Fiocruz L1-130. Os tratamentos induziram altos títulos de anticorpos anti-rLipL32. Os tratamentos rLTB+rLipL32 e rLTB::LipL32 induziram resposta protetora significativa frente ao desafio quando comparados com os grupos controle (p<0,05). Nenhum estudo anterior usou LTB como adjuvante para uma vacina contra leptospirose, tampouco antígenos fusionados com o intuito de controlar esta doença. Além disso, este é o primeiro relato de indução de imunidade protetora utilizando rLipL32 como vacina de subunidade, uma importante contribuição para o desenvolvimento de vacinas mais eficazes contra leptospirose.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-09-23T20:38:26Z No. of bitstreams: 2 Cavalcanti, Marcos Antonio Rocha - Tese - 2013.pdf: 964919 bytes, checksum: 063182e6e38ba2cb24520dc287625492 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-09-23T20:48:47Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Cavalcanti, Marcos Antonio Rocha - Tese - 2013.pdf: 964919 bytes, checksum: 063182e6e38ba2cb24520dc287625492 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-23T20:48:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Cavalcanti, Marcos Antonio Rocha - Tese - 2013.pdf: 964919 bytes, checksum: 063182e6e38ba2cb24520dc287625492 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-03-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The development of new vaccines in the control of various diseases in cattle has been increasing the marketing of animals and animal products. Thus we tested two vaccines, a biotherapy homeopathicvaccine and other recombinantallopathic vaccine,using mycobacteria in their formulations that were subsequently tested in mice and cattle. In order to study the prophylactic effect of homeopathic vaccine and the potency to be used as a vaccine, we used a model of immunizations and infections. To this end, we used mice female of BALB / c lineage which were distributed in 15 groups of three animals each. To assess the possible immune mechanisms involved in homeopathic biotherapy vaccinations we used Mycobacterium massiliense. The biotherapics were prepared from mycobacterial M. massiliense. After infections and immunizations, the animals were euthanized and their livers and spleens were harvested, macerated, homogenized, plated and incubated at 37 ° C for five days. Then we did the counting of colony forming units (CFU) of bacteria recovered from organs and according to the results obtained were selected the potencies11cH and 19cH to be tested as vaccine, because they have shown more homogeneous results. In the animals that were immunized with 19 cHthere were induction of IgG2a class antibodies specific to M. massiliense similar to (0.18 ± 0.07) infections alone (0.19 ± .02). To assess allopathic vaccine protection was used mycobacterium (Mycobacterium smegmatis mc2155 with PLA71/Fusion) in cattle. After allopathic vaccinations, blood was collected and serum was removed for ELISA test. Animals that received the recombinant live vaccine expressing protein of fusion showed greater levels of specific antibodies (p <0.01). This study evaluated the effect ofhomeopathic biotherapy vaccine composed of M. massiliense and allopathicvaccine formulated with M.smegmatis recombinant in different animal models, thus concluding that both vaccines and vaccines homeopathic and allopathic using different kinds of mycobacteria can induce humoral immune response in an animal model. / O desenvolvimento de novas vacinas no controle de várias doenças na bovinocultura vem incrementando a comercialização de animais e produtos de origem animal. Com isso testaram-se duas vacinas, uma vacina bioterápica homeopática e outra vacina alopática recombinante, utilizando micobacterias em suas formulações que posteriormente foram testadas em camundongos e bovinos. Com o objetivo de estudar o efeito profilático da vacina homeopática e a potência a ser utilizada como vacina, foi empregado um modelo de imunizações e infecções. Para tal, utilizou-se camundongos fêmeas da linhagem BALB/c as quais foram distribuídas em 15 grupos com três animais cada. Para avaliar os possíveis mecanismos imunológicos envolvidos nas vacinações bioterápicas homeopáticas utilizou-se Mycobacterium massiliense. Os bioterápicos foram preparados a partir de micobactérias M. massiliense. Após as imunizações e infecções, os animais foram eutanaziados e deles colheram-se os fígados e baços, os quais foram macerados, homogeneizados, plaqueados e incubados a 37ºC durante 5 dias. Em seguida, fez-se a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) das bactérias recuperadas dos órgãos e de acordo com os resultados obtidos foram selecionadas as potências 11cH e 19cH para serem testadas como vacina, por apresentarem resultados mais homogêneos. Nos animais imunizados com 19 cH houve indução da produção de anticorpos da classe IgG2a específicos para M. massiliense semelhantes à (0,18 ± 0,07) infecção sozinha (0,19 ± 0,02). Para avaliar a proteção da vacina alopática, foi utilizada a micobactéria (Mycobacterium smegmatis mc2155 com PLA71/Fusão), em bovinos. Após as vacinações alopáticas foi coletado sangue e retirou-se o soro para o teste de ELISA. Animais que receberam a vacina viva recombinante expressando a proteína de fusão apresentaram níveis maiores de anticorpos específicos (p< 0,01). Com este estudo avaliou-se os efeitos da vacina bioterápica homeopática composta de M. massiliense e de vacina alopática formulada com M. smegmatis recombinante em diferentes modelos animais, concluindo assim que tanto as vacinas homeopáticas e vacinas alopáticas usando diferentes tipos de micobactérias podem induzir resposta imune humoral em modelo animal.

Le Gallid herpesvirus 2 (GaHV-2), responsable de lymphomes T du poulet, est contrôlé par le vaccin CVI988/Rispens. Mes travaux de thèse ont montré que le vaccin était composé, au contraire des souches virulentes, d’une population dynamique de variants viraux majoritairement délétés de la région promotrice et d’une partie variable de l’extrémité 5’ du gène LAT codant des microARN et associé à la latence virale. Dans une approche vaccinale, un virus recombinant correspondant à l’un des variants majoritaires du vaccin CVI988/Rispens a été généré à partir d’une souche GaHV-2 hypervirulente, clonée en bacmide. Nous avons montré que ce recombinant, présentant une perte de pathogénicité presque totale, était capable de protéger significativement les poulets lors d’une épreuve avec des souches GaHV-2 hypervirulentes. Ces travaux posent les bases du développement de nouveaux vaccins à partir de souches hypervirulentes émergentes. / Gallid herpesvirus 2 (GaHV-2), responsible for T-cell lymphomas chicken, is controlled by the vaccine CVI988/Rispens. My work has shown that the vaccine contains, unlike virulent strain, a viral variants population mostly deleted from the promoter region and a variable portion of the 5' end of the gene LAT encoding microRNA and associated with viral latency. In a vaccine approach, a recombinant virus corresponding to a majority variant of the CVI988/Rispens vaccine was generated from a hypervirulent strain GaHV-2, cloned as bacmid. We showed that recombinant, with an almost total loss of pathogenicity, was able to significantly protect chickens against challenge with virulent strains GaHV-2. This work lays the basis for the development of new vaccines from emerging virulent strains.

Orientadores: Marcelo Brocchi, Fabio Trindade Maranhão Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T03:58:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franzin_FernandaMaria_M.pdf: 1412458 bytes, checksum: 2fe89ebc9e03c37ffcc48000024a232d (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A malária é uma doença tropical causada pelo parasita Plasmodium spp e é considerada um sério problema de saúde pública. São aproximadamente 500 milhões de casos anuais e mais de um milhão de mortes, especialmente na África e Ásia. No Brasil, são 500 mil novos casos por ano, principalmente na região Amazônica. Esses elevados índices de mortalidade e morbidade são motivadores da busca por estratégias de controle e eliminação dessa doença. A vacinação é uma ferramenta promissora no controle e prevenção da malária, entretanto, uma vacina segura e efetiva ainda não está disponível, em parte devido ao complexo ciclo de vida do parasita e a expressão de diferentes antígenos em cada fase. O antígeno de membrana similar ao ligante de eritrócitos (MAEBL), é um forte candidato a ser usado no desenvolvimento de uma vacina efetiva contra a malária, uma vez que esse antígeno é expresso em diferentes períodos do ciclo de vida do parasita. Neste estudo, o domínio M2 do antígeno MAEBL de Plasmodium yoelli foi expresso em linhagens vivas atenuadas de Salmonella enterica Typhimurium (?3987, ?4550 e H683) e o uso dessas bactérias como vacina recombinante potencialmente indutora de proteção contra malária murina foi avaliado. Essas linhagens foram obtidas após construção e transdução do plasmídio pYA3137trc contendo a região m2 do gene maebl e a expressão do antígeno foi confirmada por immunoblotting. A administração oral das linhagens recombinantes a camundongos BALB/c/AnUnib resultou na colonização dos tecidos hospedeiros apenas pela linhagem H683. Essa linhagem foi então avaliada em termos de indução de resposta imune humoral contra M2 e capacidade de imunização no modelo murino. Apesar da resposta humoral contra M2 ter sido detectada in vivo, a linhagem recombinante não demonstrou proteção potencial contra a infecção por Plasmodium yoelii no modelo murino. / Abstract: Malaria is a tropical disease caused by the parasite Plasmodium spp and is considered a serious public health problem. There are about 500 million annual cases and more than one million of deaths, especially in Africa and Asia. In Brazil, there are 500.000 new cases per year, mainly in the Amazon region. Those high rates mortality motivate the search for strategies of control and elimination of this illness. The vaccination is a promising tool in the control and prevention of malaria; however, a safe and effective vaccine is not available yet, in part due to the complex life cycle of the parasite and expression of different antigens in each phase. Membrane antigen erythrocyte binding like (MAEBL) is a strong candidate to be used in the development of an effective vaccine against malaria, since this antigen is expressed in different periods of the parasite life cycle. In this work, the M2 domain of Plasmodium yoelli MAEBL antigen was expressed in attenuated strains of Salmonella enterica Typhimurium (?3987, ?4550 e H683) and the use of these bacterias as potential inductor of protection against murine malaria was evaluated. These strains were obtained by construction and transduction of the plasmid pYA3137trc carrying the m2 region of the maebl gene and the antigen expression was confirmed by immunoblotting. The oral administration of the recombinant strains to BALB/c/AnUnib mice resulted in the colonization of host tissues only for the H683 strain. This strain was further evaluated in terms of induction of humoral immune response against M2 and immunization capacity in murine model. Even though humoral response against M2 was detected in vivo, the recombinant strains did not shown protective potential against the infection of Plasmodium yoelii in murine model. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular