Made available in DSpace on 2016-03-01T13:50:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 rayane_freitas_ioc_mest_2015.pdf: 2814197 bytes, checksum: 266f348b6b9d4af76ccdbcb2de423f6a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Mosquitos apresentam ritmos de atividade locomotora e alimentação sanguínea, que são cruciais para a transmissão de diversos patógenos e estão sob o controle de um relógio circadiano endógeno. Estímulos externos exercem uma importante modulação neste relógio, possibilitando o ajuste das funções endógenas com o ambiente. Um dos principais indicadores ambientais capaz de sincronizar o relógio circadiano são os ciclos de temperatura. Em laboratório, pesquisas no modelo Drosophila melanogaster vêm mostrando que ciclos de temperatura retangulares (com mudanças abruptas de temperatura) produzem um perfil de atividade diferente de ciclos com variações de temperatura graduais mais próximas ao natural. Assim, procuramos estabelecer um regime seminatural que fosse o mais próximo possível das variações diárias de temperatura ao longo de um dia no Rio de Janeiro. Escolhemos como modelo o mosquito Aedes aegypti, o principal vetor da dengue no Brasil. Essa espécie é conhecida por apresentar hábitos diurnos com picos de atividade durante o amanhecer e o crepúsculo. Os ciclos de temperatura graduais que produzimos foram capazes de sincronizar a atividade de Ae. aegypti, porém com um perfil diferente do que era observado em ciclos de temperatura retangulares. Na presença dos ciclos de claro/escuro, os ciclos temperatura graduais foram determinantes para amplitude dos picos de atividade e fase do pico principal (pico vespertino) As alterações nos padrões de comportamento parecem refletir alterações moleculares na expressão de genes que compõem o relógio circadiano. Possivelmente os genes da primeira alça (per, tim e cry2) seriam importante para a amplitude, enquanto genes da segunda alça (vri, Pdp1 e cyc) participariam do ajuste de fase do pico principal. Nossos resultados sugerem ainda que os ciclos de temperatura sincronizem o relógio através dos órgãos cordotonais. Mosquitos silenciados pela técnica de RNA de interferência para um gene importante no funcionamento dessas estruturas (nocte) apresentaram prejuízos na sincronização de sua atividade pelos ciclos de temperatura. Assim, concluímos que os ciclos de temperatura graduais que construímos são eficientes para a sincronização de Ae. aegypti e possivelmente poderão contribuir nos estudos de comportamento, permitindo em laboratório uma abordagem mais próxima ao natural. A utilização dos ciclos de temperatura graduais confirma a atuação desse indicador ambiental em sinergia com os ciclos de claro/escuro na promoção da completa sincronização dos ritmos de atividade e expressão circadiana dos organismos / Mosquitoes present locomotor activity and blood feeding rhythms, which are crucial for the transmission of many pathogens and are under the control of an endogenous circadian clock. External stimuli play an important modulation in this clock, enabling adjustment of the endogenous fun ctions with the environment. One of the main environmental indicators able to synchronize the circadian clock are temperature cycles. In laboratory, research in Drosophila melanogaster model ha s shown that rectangular temperature cycles (with abrupt temper ature changes) produce a locomotor activity pattern different from cycles with gradual temperature variations, which are closer to those organism in nature . Thus we tried to establish a semi - natural system that was as close as possible to the daily tempera ture variations observed along one day in Rio de Janeiro. We choose as model the mosquito Aedes aegypti , the main dengue vector in Brazil. This species is known to have diurnal activity with peaks at dawn and dusk. The gradual temperature cycles we produce d were able to synchronize the activity of Ae. aegypti , but with a different profile from the one observed for rectangular temperature cycles. In the presence of light / dark cycles, the gradual temperature cycles were determinat in the amplitude of the pe aks of activity and in the phase of the main peak (evening peak). Changes in the behavior patterns seem to reflect molecular alterations in the expression of the circadian clock genes. Possibly, genes from the first regulatory loop ( per , tim and cry2 ) woul d be important for the amplitude, while the genes from the second regulatory loop ( vri , Pdp1 and cyc ) would participate in the phase adjustment of the main peak. Our results also suggest that temperature cycles synchronize the clock through chordotonal org ans. Mosquitoes silenced by RNA interference assay for a n important gene in the functioning of these structures ( nocte ) presented loss in the synchronization of their activity temperature cycles. Thus, we conclude that the gradual temperature cycles we produced are effective for synchronizing Ae. aegypti and may possibly contribute to studies of behavior, allowing a more natural app roach in the laboratory. The use of gradual temperature cycles confirms the importance of this environmental indicator in synergy with the cycles of light / dark to promote full synchronization of the organisms circadian expression and activity rhythms

Made available in DSpace on 2015-10-21T12:23:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 paulo_amoretty_ioc_mest_2010.pdf: 2975859 bytes, checksum: 06f8ce008cd108bb1b64d2c7a0ec4c5d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O relógio circadiano, presente em diversos organismos, é um mecanismo que controla ritmos diários na fisiologia e comportamento, os quais são mantidos mesmo na ausência de estímulos externos. Estudos em Drosophila melanogaster revelaram genes envolvidos diretamente com este relógio biológico. Tais genes formam alças de autoregulação negativa que promovem a transcrição cíclica de alguns dos seus próprios componentes assim como de outros genes que controlam uma variedade de aspectos fisiológicos e comportamentais. A principal alça regulatória é composta por dois ativadores transcricionais, Clock (Clk) e Cycle (Cyc), que após formarem um heterodímero, promovem a transcrição de period (per) e timeless (tim). Por sua vez, as proteínas Period (Per) e Timeless (Tim) também formam dímeros, entram no núcleo e interagem com Clk e Cyc, causando a desestabilização destes ativadores transcricionais e, consequentemente, a repressão de suas próprias transcrições. Nosso grupo tem estudado genes do relógio circadiano em Lutzomyia longipalpis, principal vetor da Leishmania chagasi (= Le. infantum) nas Américas. Comparações entre nossos resultados e o que é conhecido em D. melanogaster revelaram diferenças interessantes. Em D. melanogaster, a proteína Clk possui uma cauda de ativação formada por um domínio poli-Q, que está ausente no mutante arrítmico Clk jrk . Em L. longipalpis, Clk parece não possuir esta cauda de ativação. Contudo, a proteína Cyc deste inseto possui uma região homóloga ao domínio de ativação encontrada em proteínas ortólogas de outros insetos e vertebrados, mas que está ausente na proteína Cyc de D. melanogaster Finalmente, o gene cyc é expresso de modo distinto em cada espécie: em L. longipalpis, o mRNA de cyc oscila quantitativamente ao longo do dia ao passo que, em D. melanogaster, apresenta expressão constitutiva. Uma construção contendo o gene cyc de L. longipalpis (llcyc) foi permanentemente introduzida em D. melanogaster utilizando a transformação mediada pelo elemento de transposição \201CP\201D. Utilizando o sistema UAS-GAL4, analisamos a atividade locomotora de moscas transformadas expressando esta construção em diferentes grupos neuronais e backgrounds genéticos de D. melanogaster. Embora L. longipalpis seja um inseto crepuscular/noturno e D. melanogaster diurno, a presença de llcyc não tornou as moscas transformadas mais noturnas. Contudo, o padrão de atividade em ciclos de claro-escuro sofreu mudanças e o período endógeno foi reduzido quando expostas à escuridão constante. Os resultados sugerem que a proteína Cyc de L. longipalpis, com sua cauda de ativação, interfere no funcionamento do relógio circadiano de D. Melanogaster / he circadian clock , present in several organisms , is a mechanism that control s daily physiological and behavioral rhythms which are maintained even in the absence of external stimuli. Studies on Drosophila melanogaster revealed genes directly involved with this biological clock. These genes form negative feedback loops responsible for the cyclic transcription of some of its own components as well as other genes that control a variety of physiological and behavioral aspect s. The main feedback loop is composed of two transcriptional activators, Clock (Clk) a nd Cycle (Cyc), which after heterodimerizing promote the transcription of period ( per ) and timeless ( tim ) genes. In turn, the Per and Tim proteins also form a heterodimer, enter into the nucleus and interact with Clk and Cyc, causing the destabilization of these transcription activators and, as a consequence, the repression of their own transcription. Our group h a s been studying circadian clock genes in Lutzomyia longipalpis , the main vector of Leis h mania chagasi (= Le. infantum ) in the Americas. Comparison s between our results and what is known in D. melanogaster revealed interesting differences. In D. melanogaster , the Clk protein has an activation tail formed by a poly - Q domain, which is absent in the arrhythmic mutant Clk Jrk . In L. longipalpis , Clk does not seem to have this activation tail. However, the Cyc protein in this insect has a region that is homologous to an activation domain found in orthologous proteins from other insects and vertebrates, but absent in the D. melanogaster Cyc. Finally, the cyc gene is distinctly expressed in each of the species: in L . longipalpis , cyc mRNA shows a daily oscillation in abundance, while in D. melanogaster it is constitutively expressed. A construct containing the L. longipalpis cyc gene ( llcyc ) was permanently i ntroduced into D. melanogaster using “P” element mediated transformation. Using the UAS - Gal4 system , we analyzed the locomotor activity of transgenic flies expressing this construct in different D. melanogaster neuronal groups and genetic background s. A lth ough L. longipalpis is a cr e puscular/nocturnal insect and D. melanogaster is diurnal, the presence of llcyc did not make the transformed flies more nocturnal. However, the activity pattern in light - dark cycles was altered and the endogenous period was redu ced in constant darkness. The results suggest that the presence of L. longipalpis Cyc protein , with its activation tail , interferes in the functioning of the D. melanogaster circadian clock.

Made available in DSpace on 2016-03-15T14:19:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 paulo_amoretty_ioc_dout_2014.pdf: 3200061 bytes, checksum: d380214473d12c7702ab720491d21caf (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os ritmos diários de atividade e repouso de insetos vetores são controlados pelo relógio circadiano. Este mecanismo endógeno que controla diferentes aspectos da fisiologia, metabolismo e comportamento, pode ser sincronizado pela luz (ciclos de claro e escuro) e outros ciclos ambientais como as oscilações diárias na temperatura, disponibilidade de alimentos, etc. Os genes diretamente envolvidos no controle molecular do relógio circadiano foram primeiramente descritos no modelo Drosophila melanogaster. Nosso grupo tem estudado genes do relógio circadiano em insetos vetores utilizando D. melanogaster como modelo, o que tem revelado uma série de diferenças marcantes entre os ortólogos do relógio de insetos. Em Lutzomyia longipalpis, principal vetor da Leishmania infantum nas Américas, e Aedes aegypti, vetor do vírus Dengue, a proteína codificada pelo gene cycle (cyc) possui uma cauda de ativação do tipo BCTR muito semelhante à de vertebrados. Esse sítio (BCTR) corresponde a região de interação de CYC com a proteína CRYPTOCHROME 2, um repressor transcricional encontrado em diversos insetos mas ausente em D. melanogaster. Outra diferença importante entre esses insetos é em relação ao tamanho da cauda poli-Q, implicada na ativação gênica, pois tanto em L. longiplapis quanto em Ae. aegypti esta cauda é reduzida em relação ao modelo Drosophila Isto sugere que durante a evolução o domínio BCTR foi substituído funcionalmente em algumas espécies pelo domínio poli-Q no heterodímero CLOCK/CYCLE (CLK/CYC). Neste trabalho, iniciamos uma investigação dos aspectos relacionados à conservação evolutiva e funcional da principal alça regulatória do relógio circadiano de insetos. Para isto, através de uma análise in vivo, dirigimos a expressão do gene cyc de L. longipalpis (llcyc) na tentativa de reconstruir, em parte, a primeira alça do relógio circadiano de L. longipalpis em mutantes de D. melanogaster. Além disso, utilizamos uma abordagem evolutiva comparando sequencias de diferentes grupos de insetos para investigar as transformações sofridas por CLK-CYC ao longo do processo evolutivo dos insetos. Nossos resultados sugerem que a proteína CYC de L. longipalpis foi capaz de resgatar, ainda que parcialmente, o funcionamento do relógio circadiano de D. melanogaster, embora esses insetos tenham se separado a mais de 250 milhões de anos / D aily rhythms of activity and rest in insect vectors are controlled by the circadian clock. This endogenous mechanism that controls various aspects of physiology, metabolism and behavior can be synchronized by the light (light and dar k cycles) and other environmental cycles as the daily fluctuations in temperature, food availability, etc. The genes directly involved in the molecular circadian clock control were first described in Drosophila melanogaster . Our group has been studying cir cadian clock genes in insect vectors using D. melanogaster as a model, revealing a series of marked differences among the orthologs of the insects clock. In Lutzomyia longipalpis , vector of Leishmania infantum in the Americas, and Aedes aegypti , the Dengue virus vector, the protein encoded by cycle (cyc) ge ne has a BCTR type tail activation, very similar to that of vertebrates. This BCTR tail is the site of interaction with the CRYPTOCHROME 2 protein, a transcriptional repressor found in many insects , but a bsent in D. melanogaster . Another important difference among these insects is relative to poly - Q tail size, implicated in gene activation, since both L. longipalpis and Ae. aegypti have a reduced tail compared to Drosophila . This suggests that during the e volution the BCTR domain was functionally replaced in some species by poly - Q domain in the heterodimer CLOCK/CYCLE (CLK/CYC). In the present work, we have started an investigat ion of aspects related to the evolutionary and functional conservation of the ma in regulatory circadian clock in insects. For this purpose , through an in vivo analysis we drove the L. longipalpis cyc (llcyc) gene expression in an attempt to rebuild, in part, the first circadian clock loop of L. longipalpis in mutants of D. melanogaste r . In addition, we used an evolutionary approach by comparing sequences of different insect groups to investigate the transformations suffered by CLK - CYC along the evolutionary process of insects. Our results suggest that the CYC L. longipalpis protein was able to rescue, at least partially, the functioning of the circadian clock of D. melanogaster , although these insects ha s been separated for more than 250 million years

Made available in DSpace on 2016-03-15T14:20:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcio_pavan_ioc_dout_2013.pdf: 7677814 bytes, checksum: c5a9a9ecaffcd4315201bdc148114cd6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / As dificuldades para a interrupção definitiva da transmissão vetorial do Trypanosoma cruzi decorrem primariamente de eventos de reinfestação por populações silvestres de triatomíneos das casas previamente tratadas com inseticidas e, de maneira secundária, do contato esporádico do homem com vetores infectados que habitam o peridomicílio e o ambiente silvestre. A escrutinização das regiões potenciais de transmissão endêmicas ou hipoendêmicas depende da correta diagnose das espécies vetoras e dos seus limites de ocorrência geográfica. No caso de espécies crípticas, a identificação taxonômica deve ser feita principalmente por métodos moleculares de baixo custo e eficientes, que a partir dos quais seja possível gerar resultados simples de interpretar. A diagnose correta dos vetores é útil para a determinação regional dos riscos potenciais de transmissão vetorial da doença em seres humanos. Contudo, o desenvolvimento de novas estratégias de controle mais eficazes depende do entendimento acerca dos padrões biológicos, ecológicos e evolutivos que estão envolvidos nos processos de domiciliação e especiação desses vetores. Estes padrões estão inseridos em um contexto espacial e temporal complexo, que só pode ser compreendido quando estudos em diferentes escalas geográficas e históricas são realizados. Neste contexto, o complexo de espécies crípticas R. prolixus e R. robustus s.l. serve como um importante modelo, por ser um grupo bem estudado, de filogenia conhecida e ocorrência geográfica previamente estimada Nesta tese foi avaliado o status taxonômico dessas espécies e as possíveis barreiras naturais ao fluxo gênico entre as linhagens determinadas com base em (1) análises filogenéticas, utilizando um marcador mitocondrial (Cytb) e cinco marcadores nucleares (ITS-2, period, timeless, cryptochrome2-I6, cryptochrome2-I8; (2) biogeográficas, utilizando duas calibrações geológicas do relógio molecular relaxado; (3) populacionais, analisando 10 loci de microssatélites; e (4) de comportamento, medindo as atividades locomotoras e estimando o período endógeno do relógio circadiano. Adicionalmente, foi identificado um marcador em um gene nuclear de cópia única (TPS165) que separa as espécies crípticas e de diferentes importâncias epidemiológicas: R. prolixus (imporância primária) e R. robustus s.l. (importância secundária). Ao todo, foram analisados 254 espécimes de R. prolixus e R. robustus s.l. As amostras de R. robustus foram obtidas após duas coletas ao longo de transectos que representam áreas contíguas de ocorrência das linhagens crípticas R. robustus III e IV, e R. robustus II, III e IV, de acordo com o que se conhece sobre a distribuição destes táxons. R. prolixus é uma espécie distinta de R. robustus s.l. e, portanto, válida. R. robustus s.l. é um complexo parafilético de, pelo menos, sete linhagens, das quais três parecem representar três espécies distintas \2013 R. barretti, R. robustus I e R. robustus V. A partir do resultado filogenético incongruente com base na topologia das árvores filogenéticas dos genes analisados das quatro linhagens restantes, R. robustus II, III, IV e sp. nov. representam um complexo de espécies in status nascendi As populações ancestrais de R. prolixus e R. robustus s.l. sofreram cladogêneses decorrentes de eventos geológicos amazônicos ocorridos entre o Mioceno Superior e o Pleistoceno Médio (entre 7 e 0,5 Maa). Apesar de os resultados filogeográficos, genealógicos e populacionais serem em parte concordantes com a hipótese de que R. prolixus e R. robustus s.l. se originaram na região do Orinoco e se diferenciaram possivelmente devido às modificações naturais na região pan-amazônica promovidas pelas \201Eincursões marinhas\201F do Mioceno, as datações obtidas para os eventos cladogenéticos das linhagens são concordantes com os períodos glaciais em que as florestas tropicais úmidas teriam sido reduzidas a \201Erefúgios\201F, durante o Plioceno e Pleistoceno / One of the current challen ges for the interruption of Trypanosoma cruzi transmission relies primarly on re - infestation events of insecticide - treated houses by sylvatic populations of triatomines and secondarily on the sporadic contact between infected sylvatic triatomines and susceptible humans. The scrutinization of regions with endemic or hypoendemic transmission depends on accurate species identification and its geographical boundaries. In the case of cryptic species, devising of simple, efficient and cost - effective methods for their identification is needed. Biological, ecological and evolutionary processes that can be involved in vectorial domiciliation and speciation are also relevant for th e development of innovative surveillance/ control strategies. These processes are embedded in a complex spatial and temporal context, which can be appreciated when historical and geographical approaches are considered in different scales. In this context, the cryptic species complex R. prolixus and R. robustus s.l. serves as a good model, as it is an extensive - studied group, with well - known phylogeny, and its geographical limits were previous estimated. During this thesis the taxonomic status of these linea ges were evaluated and also possible natural barriers for gene flow were determined, based on the following analyses: (1) phylogene tic, using one mitochondrial ( Cy t b) and five nuclear markers ( ITS - 2, period , timeless , cryptochrome 2 - I6, cryptochrome 2 - I8); ( 2) biogeographical, using a „relaxed‟ molecular clock with two geological calibrations; (3) population genetics, analyzing 10 microsatelite loci; and (4) behavioral, measuring locomotor activities and estimating the circadian clock periods. Moreover, it was describe d a non - coding, single - copy nuclear DNA fragment that contains a single - nucleotide polymorphism (SNP) with the potential to distinguish the important domestic Chagas disease vector , Rhodnius prolixus , from members of the sylvatic Rhodnius robus tus cryptic lineages complex . Two hundred and fifty four specimens of R. prolixus and R. robustus s.l. were obtained. R. robustus s.l. sampling were conducted along transects which cross areas of contiguous geographic distribution among R. robustus III and IV, and R. robustus II, III, and IV, based on the previous knowledge about lineages bondaries. R. prolixus is a is a paraphyletic assemblage of , at least, seven different lineages , three of which seem to be different species – R. barretti , R. robus tus I, and R. robustus V. Phylogenetic results of R. robustus II, III, IV, and n.sp. showed incongruent topologies on gene trees, and thus they represent a complex of species in status nascendi . Ancestral populations of R. prolixus and R. robustus s.l. cla dogenesis have probably occurred during geological events between Late Miocene and Middle Pleistocene ( 7 - 0.5 Mya). Although phylogeographical, genealogical, and population results partially agree with the predictions that R. prolixus and R. robustus s.l. w ere originated in the Orinoco biogeographical area and speciated during „mar ine incursions‟ of the Miocene E poch, „relaxed‟ clock analyses showed recent splits estimations, which coincides with the glacial time that occurred the fragmentation of moist fore sts in „refuges‟ during Late Pliocene and Early/Middle Pleistocene.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-12-26T17:36:08Z No. of bitstreams: 1 gustavo_b_s_rivas_ioc_bcm_0009_2010.pdf: 11697677 bytes, checksum: 8a7bcdbcf8c6a40fb417768c6ec46e62 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-26T17:36:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gustavo_b_s_rivas_ioc_bcm_0009_2010.pdf: 11697677 bytes, checksum: 8a7bcdbcf8c6a40fb417768c6ec46e62 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A grande maioria dos seres vivos complexos apresenta um relógio endógeno, conhecido como relógio circadiano, responsável por dirigir as oscilações rítmicas de fisiologia e comportamento dentro de um período de aproximadamente 24 horas. Em insetos, as bases genéticas deste marcapasso têm sido elucidadas em Drosophila melanogaster. Diversos loci já foram identificados e o mecanismo molecular regulando o relógio circadiano consiste de alças regulatórias interligadas que controlam a expressão rítmica de muitos genes. Muitas espécies de mosquitos são vetores de doenças. Elas exibem uma variedade de padrões de atividade e hematofagia, de diurnos a crepusculares e noturnos e estes ritmos são importantes para a dinâmica da transmissãode doenças. Entretanto, apesar da sua importância epidemiológica, pouco se sabe quanto à genética molecular do relógio circadiano que controla seus ritmos de atividade. Nosso grupo tem estudado as bases moleculares do relógio circadiano em duas espécies de mosquitos, Aedes aegyptie Culex quinquefasciatus. Ambos são importantes vetores de doenças tropicais, mas com diferentes padrões de atividade. Ae. aegyptié o vetor diurno da Dengue e da Febre amarela, enquanto Cx. quinquefasciatusé o vetor noturno da Filariose e da Febre do Oeste doNilo. Análises preliminares indicaram uma conservação dos padrões de expressão entre as duas espécies em alguns dos mais importantes genes do relógio em claro-escuro e escuro constante. Entretanto, nós achamos diferenças na expressão do gene cryptochrome2(cry2), um ortólogo dos genes codificando criptocromos de mamíferos e que foi encontrado em muitos insetos, mas que não está presente em Drosophila. Nós sugerimos que cry2pode estar envolvido no controle dos padrões de atividade de Ae. aegyptie Cx. quinquefasciatus, e propusemos um modelo para explicar as diferenças na expressão de cry2. Nós também estudamos a expressão circadiana dos principais genes de relógio, além dos ritmos de atividade locomotora destas duas espécies em ciclos de temperatura. Observamos que ambas são arrastadas pela temperatura e mostram diferenças em seus comportamentos de atividade. Em ciclos de temperatura, a atividade locomotora de Ae. aegyptié mais restrita a termofase, enquanto Cx. quinquefasciatusapresenta sua atividade mais restrita a criofase. Além disso, após o arrastamento em ciclos de claro-escuro, Ae. aegypti mostrou um padrão transiente de atividade por alguns dias em escuro constante com ciclos de temperatura, enquanto Cx. quinquefasciatuspermaneceu estável nesta condição. Também foram observadas, em ciclos de temperatura, algumas diferenças espécies-específicas nos padrões de expressão de cyclee cry2. Finalmente, nós observamos diferenças na fase da expressão circadiana de Ae. aegyptiem ciclos de temperatura e escuro constante entre mosquitos criados com uma combinação de ciclos de claro-escuro e de temperaturacom mosquitos criados em ciclos de claro-escuro com temperatura constante. Isto sugere um importante papel do desenvolvimento na determinação dos padrões de expressão circadiana de insetos adultos submetidos a oscilações de temperatura. / The great majority of complex living organisms present an endogenous timekeeper, known as the circadian clock, responsible for driving rhythmic oscillations in their physiology and behaviour within a period of approximately 24 hours. In insects, the genetic bases of this pacemaker have been elucidated in Drosophila melanogaster. A number of loci have already been identified and themolecular mechanism regulating the circadian clock consists of interlocked feedback loops that control the rhythmic expression of many genes. Many species of mosquitoes are disease vectors. They show a range of activity and blood-feeding patterns, from diurnal to crepuscular and nocturnal, and these rhythms are essential for the dynamics of disease transmission. However, despite their epidemiologic importance, little is known about the molecular genetics of the circadian clock controlling their activity rhythms. Our group has been studying the molecular bases of the circadian clock in two mosquito species, Aedes aegyptiand Culex quinquefasciatus. Both are important vectors of tropical diseases but with different activitypatterns. Ae. aegyptiis a diurnal vector of Dengue and Yellow fever, while Cx. quinquefasciatusis a nocturnal vector of Filariasis and West-Nile fever. Previous analysis has indicated conserved expression patterns between the two species in some of themost important clock genes in light-dark and constant dark. However, we founddifferences in the expression in the mammalian-like cryptochrome2(cry2), a gene found in many insects but missing in Drosophila. We suggest that cry2might be involved in the control of the activity patterns in Ae. aegyptiand Cx. quinquefasciatus, and we proposed a model to explain the differences in cry2expression. We also studied the circadian expression of the main clock genes and locomotor activity rhythms of these two species under temperaturecycles. We observed that both are entrained by temperature and showed some differences in their activity behaviour. Under temperature cycles, the locomotor activity of Ae. aegyptiis more restricted to the termophase while Cx. quinquefasciatushas your activity more restricted to the cryophase. Moreover, after entrainment in light-dark cycles, Ae. aegyptishown a transient activity pattern for a few days in constant dark with temperature cycles, while Cx. quinquefasciatusremains stable in this condition. We also observed under temperature cycles some species-specific differences in cycle and cry2expression patterns. Finally, we observed differences in the phase of Ae. aegypticircadian expression in temperature cycles and constant dark between mosquitoes raised under combined light-dark and temperature cycles to those raised in light-dark cycles with constant temperature. This suggests an important role of development in determining the patterns of circadian expression of adult insects under temperature oscillations.

Orientador: Michel Georges Albert Vincentz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:21:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Viana_AmericoJoseCarvalho_D.pdf: 5804951 bytes, checksum: a3c65fa34ad298641a9b177952050af3 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O fator de transcrição do tipo basic leucine leucine zipper (bZIP) de Arabidopsis thaliana AtbZIP63 faz parte da via de resposta a carência energética coordenada pelas quinases KIN10/11, integradoras centrais dos sinais relacionados ao estado de privação de energia. O mutante de inserção de T-DNA atbzip63-2 apresenta uma redução do crescimento e desenvolvimento das folhas assim como um atraso do florescimento em comparação ao tipo selvagem (TS, acesso Ws) quando cultivado em fotoperíodo de dia curto (10 h/14 h). Condições de fotoperíodo de dia longo ou luz contínua promoveram uma reversão parcial ou completa, respectivamente, do fenótipo mutante para o tipo selvagem, levantando a possibilidade de que este fenótipo seja o resultado de uma carência energética. Plantas silenciadas para expressão de AtbZIP63 por RNAi apresentaram características similares a do mutante atbzip63-2 confirmando o envolvimento deste fator de transcrição no crescimento. O perfil de expressão gênica e os níveis de alguns metabólitos do mutante atbzip63-2 indicaram que AtbZIP63 participa do controle da degradação do amido, pois a expressão de alguns genes centrais na degradação deste carboidrato de reserva está desregulada neste mutante. Mostramos que as oscilações no nível do transcrito AtbZIP63 são reguladas pelo relógio circadiano e a fase da oscilação do AtbZIP63 é aparentemente influenciada pela disponibilidade de carboidratos na célula. Além de estar sob o controle do relógio, AtbZIP63 também atua como um ativador direto da expressão de PRR7, que codifica um dos componentes chave do oscilador central do relógio. Portanto, evidenciamos uma interação recíproca entre o relógio e AtbZIP63 que possivelmente está impactando o processo de degradação do amido à noite. Este conjunto de evidências revela novos aspectos do ajuste do relógio circadiano pelo status de açúcar na célula que estão de acordo com trabalhos recentes mostrando que os açúcares afetam diretamente o funcionamento do relógio. Nossa hipótese é que o AtbZIP63 está agindo como um mediador entre a disponibilidade de viii açúcar e o mecanismo oscilatório do relógio circadiano de A. thaliana. Adicionalmente, verificamos que o perfil de transcritos no final do dia no mutante atbzip63-2 é diferente do observado no final da noite, sugerindo a participação do AtbZIP63 na regulação de genes envolvidos em redes regulatórias distintas em função do período do dia. Dentre os genes desregulados no atbzip63-2 no final do dia, observamos um enriquecimento para genes relacionados com metabolismo secundário e síntese de trealose, o que sugere a participação do AtbZIP63 na regulação da síntese destes compostos durante o dia, e possivelmente reflete a ocorrência de stress no mutante / Abstract: he Arabidopsis thaliana basic leucine zipper domain (bZIP) AtbZIP63 transcription factor is part of the response pathway to energy shortage coordinated by kinases KIN10/11. The T-DNA insertion mutant atbzip63-2 shows a reduction in the growth and development of leaves, as well as a delay in flowering compared to wild type (WT; ecotype Ws), when grown in short-day conditions. Long day or continuous light conditions promoted a partial or complete reversion, respectively, of the mutant to wild-type phenotype, raising the possibility that this phenotype is the result of an energy shortage. Plants silenced for AtbZIP63 showed similar characteristics to the atbzip63-2 mutant, confirming the involvement of this transcription factor in the growth. The gene expression profile and the levels of some metabolites of the atbzip63-2 indicated that AtbZIP63 takes part in the control of starch degradation, regulating the expression of some key genes in starch degradation. Diurnal AtbZIP63 mRNA level fluctuation is regulated by the circadian clock, and the phase oscillation is influenced by the availability of carbohydrates. In addition, to be controlled by the circadian clock, AtbZIP63 directly regulates the expression of PRR7 which encodes one of the key regulators of the core clock. We have therefore identified a reciprocal interaction between the clock and AtbZIP63 which is probably affecting the starch degradation process. This set of evidence reveals new aspects of the entrainment of the circadian clock by sugars, and is consistent with recent studies showing that sugars directly regulate the circadian clock. Our hypothesis is that AtbZIP63 is acting as a mediator between the energy status (availability of sugar) and the oscillatory mechanism of the A. thaliana circadian clock. Additionally, we found that the profile of transcripts at the end of the day in atbzip63-2 mutant is different from that observed in the end of the night, suggesting the involvement of AtbZIP63 in the regulation of genes involved in distinct regulatory networks according to the period of day. Among the genes deregulated in atbzip63-2 at the end of the x day, an enrichment for genes related to secondary metabolism and trehalose biosynthesis was observed. Suggesting the involvement of AtbZIP63 in regulating the synthesis of these compounds during the day, and probably reflects the occurrence of stress in the mutant / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular