Eventos isquêmicos seguidos por reperfusão levam ao dano celular e mitocondrial devido à abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (TPM). Todavia, o pré-condicionamento evita o dano celular por isquemia e reperfusão. Esse efeito protetor é semelhante ao obtido pela abertura do canal mitocondrial de potássio sensível a ATP (mitoKATP). Aqui, nós mostramos os mecanismos de sinalização que ativam o mitoKATP durante o pré-condicionamento, o papel redox destes canais e seu conseqüente mecanismo protetor. Usando células cardíacas HL-1, nós demonstramos que aumentos em espécies reativas de oxigênio (EROs) observadas durante o pré-condicionamento não foram revertidos por antagonistas do mitoKATP, que significativamente evitaram a proteção pelo pré-condicionamento. Isso sugere que essas espécies são formadas anteriormente à abertura do canal. Consistente com essa hipótese, a adição de catalase a corações perfundidos de rato e a células HL-1 promove reversão dos efeitos benéficos do pré-condicionamento, mas não do diazóxido (um agonista do mitoKATP). Por outro lado, 2-mercaptopropionil glicina preveniu a cardioproteção em ambos os casos, sugerindo que este composto deve apresentar outros efeitos além de antioxidante. De fato, verificamos que agentes redutores tiólicos interferem na ativação do mitoKATP mediada pelo diazóxido em mitocôndrias isoladas de coração de rato. Examinando como o mitoKATP pode ser ativado durante o pré-condicionamento, constatamos que EROs endógenas e exógenas fortemente ativaram o mitoKATP, sugerindo que o moderado aumento nas EROs durante o pré-condicionamento pode ativar esse canal. Uma vez ativado, o canal preveniu as condições (captação de Ca2+ e formação de EROs) que favorecem a ocorrência de TPM em situação de isquemia. A atividade deste canal também leva à diminuição de EROs gerados fisiologicamente ou durante períodos de isquemia e reperfusão, evitando o dano celular conseqüente. Este fato não envolveu nenhum aumento nos sistemas de remoção de oxidantes. Por outro lado, a inibição da TPM, usando ciclosporina A, preveniu o estresse oxidativo somente durante a reperfusão, mas protegeu as células de maneira indistinguível da abertura do mitoKATP. Juntos, nossos resultados sugerem que o mitoKATP age como um sensor para as EROs que diminui a sua geração em resposta a níveis aumentados de oxidantes. Em conseqüência, estes canais regulam o balanço redox em condições fisiológicas e previnem o estresse oxidativo em condições patológicas, inibindo com isso a ocorrência de TPM e morte celular isquêmica. / Ischemia followed by reperfusion results in impairment of cellular and mitochondrial functionality due to opening of mitochondrial permeability transition (MPT) pores. Nevertheless, preconditioning rescues cells from ischemic damage. Mitochondrial ATP-sensitive K+ channel (mitoKATP) opening also prevents cardiac ischemic cell death. Here we show the signaling mechanisms that activate mitoKATP during preconditioning, the redox role of these channels and consequent protective mechanisms. Using cardiac HL-1 cells, we found that increases in reactive oxygen species (ROS) observed during preconditioning were not inhibited by mitoKATP antagonists, although these drugs significantly avoided the protection afforded by preconditioning, suggesting their activation occurrs upstream of channel activity. Consistent with this, catalase addition to perfused rat hearts and HL-1 cells reversed the beneficial effects of preconditioning, but not of diazoxide (a mitoKATP agonist). On the other hand, 2-mercaptopropionylglycine prevented cardioprotection in both cases, suggesting this compound may present effects other than scavenging ROS. Indeed, thiol reducing agents impaired diazoxide-mediated activation of mitoKATP in isolated rat heart mitochondria. We found that endogenous or exogenous ROS strongly enhanced mitoKATP activity, suggesting that moderate increments in ROS release during preconditioning may activate mitoKATP. Furthermore, mitoKATP prevented conditions (Ca2+ uptake and ROS formation) that favor the opening of MPT pores under ischemic conditions. MitoKATP opening decreased ROS generation physiologically and during both ischemia and reperfusion, consequently avoiding cellular damage. This prevention does not involve an increase in oxidant removal systems. On the other hand, the inhibition of MPT, using cyclosporin A, prevented oxidative stress only during simulated reperfusion, but protected cells in a manner indistinguishable from mitoKATP opening. Collectively, our results suggest that mitoKATP acts as a ROS sensor that decreases mitochondrial ROS generation in response to enhanced local levels of oxidants. As a result, these channels regulate mitochondrial redox state under physiological conditions and prevent oxidative stress under pathological conditions, inhibiting MPT opening and ischemic cardiac damage.

The reperfusion injury is responsible for 50% of infarct size, being the main cause of cardiac changes caused by calcium overload and oxidative stress occurring in the ischemia-reperfusion process. Prevention or limitation of this area becomes a target for heart protection. In this context, the diosmin to be a flavonoid that has wide biological activity, especially cardioprotective, presents itself as a substance to be used for the prevention of these injuries. The aim of this study was to evaluate the antioxidant effect of diosmin in reperfusion injury. Was used aortic perfusion system of the type Langendorff constant pressure to induce cardiac global ischemia model. Male Wistar rats (250-300 g) were used and the procedures were approved by the Ethics Committee on Animal Research of the UFS (04/2013). The animals were divided into 4 experimental groups: 01 - Sham: 20 minutes of stabilization, 100 minutes of perfusion with vehicle solution (Krebs-Ringer solution plus dimethylsulfoxide - DMSO 0.02%); Group 02 - I-R + Vehicle: 20 minute of stabilization, 10 minute perfusion with vehicle solution, followed by 30 minutes of ischemia and then reperfusion 60 minutes more with the same solution, 10 minutes of perfusion with vehicle solution, followed by 30 minutes of ischemia and then more 60 minutes of reperfusion with the same solution. Group 03 - I-R + Diosmin: 20 minutes of stabilization, perfusion for 10 minutes with vehicle solution, followed by 30 minutes of ischemia and subsequently a further 60 minutes of reperfusion with diosmin solution (0.1 mol / L) and Group 04 - I-R + NAC: 20 minutes of stabilization, perfusion for 10 minutes with vehicle solution, followed by 30 min ischemia and after 60 minutes of reperfusion with the positive control NAC (N-acetylcysteine - 24 mmol / L). Was evaluated the effect of diosmin on cardiac contractility, by measuring the left intraventricular pressure (PVE) and arrhythmia severity index (ASI). Furthermore, was analyzed the area of injury making a mark on the infarct location, and measurement of the enzymes creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH). Also, it was analyzed the effect of diosmin in lipid peroxidation (TBARS, total hydroperoxides) and antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) in the hearts studied. Finally, we observed the expression of caspase-3 protein by western blot. As a result we obtained the restoration of PVE when compared to the sham group, as well as verified reduction of ASI (p< 0.01) compared to hearts were reperfused with the vehicle. We also observed a decrease (p< 0.01) of the infarcted area and the overall activity of the enzymes CK and LDH. Lipid peroxidation and the concentration of hydroperoxides shown to be reduced (p< 0.01) compared to reperfused hearts with the vehicle. In addition, the activity of antioxidant enzymes SOD, CAT, GPx and GR also were reduced (p< 0.01) compared to reperfused hearts with the vehicle. Also demonstrated reduction (p< 0.01) the expression of caspase-3 protein compared to the group in which the hearts were reperfused with the vehicle. These results together show that the diosmin reduces the changes arising from cardiac ischemia-reperfusion for their antioxidant activity. / A lesao de reperfusao e responsavel por 50% do tamanho do infarto, sendo a principal responsavel pelas alteracoes cardiacas ocasionadas pela sobrecarga de calcio e estresse oxidativo que ocorrem no processo de isquemia-reperfusao. A prevencao ou limitacao desta area torna-se um alvo para a protecao cardiaca. Neste contexto, a diosmina por ser um flavonoide que apresenta ampla atividade biologica, principalmente cardioprotetora, apresenta-se como uma substancia a ser utilizada para a prevencao dessas lesoes. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito antioxidante da diosmina na lesao de reperfusao. Utilizou-se o sistema de perfusao aortico do tipo Langendorff pressao constante para a inducao do modelo de isquemia global cardiaca. Foram utilizados ratos Wistar machos (250-300 g) e os procedimentos foram aprovados pelo Comite de Etica em Pesquisa com Animais da UFS (04/2013). Os animais utilizados foram divididos em 4 grupos experimentais: Grupo 01 - Sham: 20 minutos de estabilizacao, 100 minutos de perfusao com solucao veiculo (solucao de Krebs-Ringer acrescida de dimetilsulfoxido - DMSO 0,02 %); Grupo 02 - I-R + Veiculo: 20 minutos de estabilizacao, 10 minutos de perfusao com solucao veiculo, seguido por 30 minutos de isquemia e, posteriormente, mais 60 minutos de reperfusao com a mesma solucao; Grupo 03 - I-R + Diosmina: 20 minutos de estabilizacao, perfusao por 10 minutos com solucao veiculo, seguido por 30 minutos de isquemia e, posteriormente, mais 60 minutos de reperfusao com solucao de diosmina (0,1 Êmol/L) e Grupo 04 - I-R + NAC: 20 minutos de estabilizacao, perfusao por 10 minutos com solucao veiculo, seguido por 30 minutos de isquemia e posteriormente, 60 minutos de reperfusao com o controle positivo NAC (N-acetilcisteina - 24 Êmol/L). Foi avaliado o efeito da diosmina sobre a contratilidade cardiaca, atraves da mensuracao da pressao intraventricular esquerda (PVE) e do indice de severidade de arritmia (ASI). Alem disso, foi analisada a area de lesao fazendo-se a marcacao do infarto, e mensuracao da atividade das enzimas creatina quinase (CK) e lactato desidrogenase (LDH). Tambem, foi analisado o efeito da diosmina na peroxidacao lipidica (TBARS, hidroperoxidos totais) e das enzimas antioxidantes superoxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) nos coracoes estudados. E por fim, foi observada a expressao da proteina caspase-3 pela tecnica de western blot. Como resultados obtivemos o reestabelecimento da PVE quando comparada ao grupo Sham, assim como verificamos reducao do ASI (p< 0,01) em relacao aos coracoes que foram reperfundidos com o veiculo. Observamos, ainda, diminuicao (p< 0,01) da area de infarto e da atividade das enzimas CK total e LDH. A peroxidacao lipidica e a concentracao de hidroperoxidos mostraram-se reduzidas (p< 0,01) em relacao aos coracoes reperfundidos com o veiculo. Alem disso, a atividade das enzimas antioxidantes SOD, CAT, GPx e GR, tambem encontravam-se reduzidas (p< 0,01) em relacao aos coracoes reperfundidos com o veiculo. Demonstramos tambem reducao (p< 0,01) da expressao da proteina caspase-3 quando comparado ao grupo em que os coracoes foram reperfundidos com o veiculo. Estes resultados em conjunto evidenciam que a diosmina reduz as alteracoes decorrentes da isquemia-reperfusao cardiaca por sua acao antioxidante.

Eventos isquêmicos seguidos por reperfusão levam ao dano celular e mitocondrial devido à abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (TPM). Todavia, o pré-condicionamento evita o dano celular por isquemia e reperfusão. Esse efeito protetor é semelhante ao obtido pela abertura do canal mitocondrial de potássio sensível a ATP (mitoKATP). Aqui, nós mostramos os mecanismos de sinalização que ativam o mitoKATP durante o pré-condicionamento, o papel redox destes canais e seu conseqüente mecanismo protetor. Usando células cardíacas HL-1, nós demonstramos que aumentos em espécies reativas de oxigênio (EROs) observadas durante o pré-condicionamento não foram revertidos por antagonistas do mitoKATP, que significativamente evitaram a proteção pelo pré-condicionamento. Isso sugere que essas espécies são formadas anteriormente à abertura do canal. Consistente com essa hipótese, a adição de catalase a corações perfundidos de rato e a células HL-1 promove reversão dos efeitos benéficos do pré-condicionamento, mas não do diazóxido (um agonista do mitoKATP). Por outro lado, 2-mercaptopropionil glicina preveniu a cardioproteção em ambos os casos, sugerindo que este composto deve apresentar outros efeitos além de antioxidante. De fato, verificamos que agentes redutores tiólicos interferem na ativação do mitoKATP mediada pelo diazóxido em mitocôndrias isoladas de coração de rato. Examinando como o mitoKATP pode ser ativado durante o pré-condicionamento, constatamos que EROs endógenas e exógenas fortemente ativaram o mitoKATP, sugerindo que o moderado aumento nas EROs durante o pré-condicionamento pode ativar esse canal. Uma vez ativado, o canal preveniu as condições (captação de Ca2+ e formação de EROs) que favorecem a ocorrência de TPM em situação de isquemia. A atividade deste canal também leva à diminuição de EROs gerados fisiologicamente ou durante períodos de isquemia e reperfusão, evitando o dano celular conseqüente. Este fato não envolveu nenhum aumento nos sistemas de remoção de oxidantes. Por outro lado, a inibição da TPM, usando ciclosporina A, preveniu o estresse oxidativo somente durante a reperfusão, mas protegeu as células de maneira indistinguível da abertura do mitoKATP. Juntos, nossos resultados sugerem que o mitoKATP age como um sensor para as EROs que diminui a sua geração em resposta a níveis aumentados de oxidantes. Em conseqüência, estes canais regulam o balanço redox em condições fisiológicas e previnem o estresse oxidativo em condições patológicas, inibindo com isso a ocorrência de TPM e morte celular isquêmica. / Ischemia followed by reperfusion results in impairment of cellular and mitochondrial functionality due to opening of mitochondrial permeability transition (MPT) pores. Nevertheless, preconditioning rescues cells from ischemic damage. Mitochondrial ATP-sensitive K+ channel (mitoKATP) opening also prevents cardiac ischemic cell death. Here we show the signaling mechanisms that activate mitoKATP during preconditioning, the redox role of these channels and consequent protective mechanisms. Using cardiac HL-1 cells, we found that increases in reactive oxygen species (ROS) observed during preconditioning were not inhibited by mitoKATP antagonists, although these drugs significantly avoided the protection afforded by preconditioning, suggesting their activation occurrs upstream of channel activity. Consistent with this, catalase addition to perfused rat hearts and HL-1 cells reversed the beneficial effects of preconditioning, but not of diazoxide (a mitoKATP agonist). On the other hand, 2-mercaptopropionylglycine prevented cardioprotection in both cases, suggesting this compound may present effects other than scavenging ROS. Indeed, thiol reducing agents impaired diazoxide-mediated activation of mitoKATP in isolated rat heart mitochondria. We found that endogenous or exogenous ROS strongly enhanced mitoKATP activity, suggesting that moderate increments in ROS release during preconditioning may activate mitoKATP. Furthermore, mitoKATP prevented conditions (Ca2+ uptake and ROS formation) that favor the opening of MPT pores under ischemic conditions. MitoKATP opening decreased ROS generation physiologically and during both ischemia and reperfusion, consequently avoiding cellular damage. This prevention does not involve an increase in oxidant removal systems. On the other hand, the inhibition of MPT, using cyclosporin A, prevented oxidative stress only during simulated reperfusion, but protected cells in a manner indistinguishable from mitoKATP opening. Collectively, our results suggest that mitoKATP acts as a ROS sensor that decreases mitochondrial ROS generation in response to enhanced local levels of oxidants. As a result, these channels regulate mitochondrial redox state under physiological conditions and prevent oxidative stress under pathological conditions, inhibiting MPT opening and ischemic cardiac damage.