A quimioterapia disponível para o tratamento das leishmanioses conta com um número reduzido de fármacos, com efeitos adversos severos e progressivo aumento de resistência. O reposicionamento de fármacos oferece uma grande oportunidade para introdução de novas terapias. Antidepressivos orais têm demonstrado eficácia tanto in vitro quanto in vivo contra espécies de Leishmania spp. Neste estudo, o antidepressivo sertralina (SRT), e o fármaco ciclobenzaprina (CBP), um relaxante muscular de estrutura tricíclica análoga a antidepressivos, foram avaliados quanto a atividade contra Leishmania (L.) infantum. Estudos metabolômicos não dirigidos utilizando multiplataforma analítica, foram combinados a análises de parâmetros celulares, essenciais para obtenção de uma ampla descrição dos mecanismos de ação. A CBP mostrou uma atividade leishmanicida in vitro, com valor de CE50 de 4,3 ?M contra formas promastigotas e 8,6 ?M contra formas amastigotas intracelulares. O fármaco apresentou uma citotoxicidade (CC50) de 70,6 ?M em células NCTC, e um índice de seletividade similar a miltefosina. Os estudos de mecanismo de ação, sugeriram que a CBP se difunde pela membrana plasmática, causando diminuição do ??p e no interior citoplasmático, parece induzir um estresse do RE com liberação de Ca+2; concomitantemente, induz um desacoplamento brando da cadeia respiratória mitocondrial e depleção dos níveis de ATP. Com o efeito prolongado, a liberação de Ca+2 parece ativar a autofagia, e seu influxo para a mitocôndria potencializar os efeitos deletérios, diminuindo o ??m e aumentando a produção de ROS. A longo prazo, o CBP induz uma extensa alteração metabólica, caracterizada aumento dos níveis da maioria dos metabólitos identificados e atividade desregulada de transportadores de membrana, gerando alto gasto energético associado a condições insuficientes de produção de energia mitocondrial, resultando em morte celular. A sertralina também apresentou atividade leishmanicida in vitro, com valor de CE50 de 2 ?M contra formas promastigotas e 3,9 ?M contra formas amastigotas intracelulares. Sua toxicidade em células NCTC foi de 19,6 ?M, resultando em um índice de seletividade similar a miltefosina. Nossos estudos confirmaram a mitocôndria de Leishmania como alvo primário e, o efeito de desacoplamento da cadeia respiratória associado ao colapso energético, estresse oxidativo seguido da despolarização do ??m como a possível origem desta disfunção mitocondrial. Estudos metabolômicos evidenciaram que a extensão do desarranjo metabólico, abrange diminuição da capacidade de detoxificação do metabolismo tiol-redox, uma severa depleção do pool intracelular de aminoácidos e poliaminas, evidenciando uma completa deterioração do metabolismo energético, por meio de um mecanismo multialvo direcionado a vias metabólicas essências do parasita. Finalmente, este estudo descreve a atividade anti-Leishmania de dois fármacos orais aprovados, com mecanismos de ação letais e irreversíveis no parasita, encorajando o prosseguimento para futuros estudos pré-clínicos na leishmaniose visceral americana / The available chemotherapy for the treatment of leishmaniasis has a reduced number of drugs, with severe adverse effects and progressive increase of resistance. The drug repurposing offers a great opportunity for the introduction of new therapies. Oral antidepressants have been demonstrated efficacy both in vitro and in vivo against Leishmania spp. In this study, the antidepressant sertraline (SRT), and the drug cyclobenzaprine (CBP), a muscle relaxant with tricyclic structure analogous to antidepressants, were evaluated against Leishmania (L.) infantum. Untargeted metabolomic studies using multiplataform analysis were combined to cellular parameters to a broad description of the mechanisms of action. Cyclobenzaprine showed an in vitro leishmanicidal activity with an EC50 value of 4.3 ?M against promastigotes and 8.6 ?M against intracellular amastigote forms. The drug showed a cytotoxicity (CC50) of 70.6 ?M in NCTC cells, and a selectivity index similar to miltefosine. Mechanism of action studies suggested that CBP diffuses through the plasma membrane, causing a decrease of the ??p and inside the cytoplasm, the drug seems to induce an ER stress, with release of Ca+2; concomitantly, it induces a mild decoupling of the mitochondrial respiratory chain and depletion of ATP levels. With the prolonged effect, a release of Ca+ 2 appears to activate an autophagy, and its mitochondrial influx results in a potentiation of deleterious effects as decreasing of ??m and increasing ROS production. In long term, CBP induces an extensive metabolic alteration, characterized increased levels of most of the identified metabolites and unregulated activity of membrane transporters. These generates a high energy expenditure associated to limited conditions of mitochondrial energy production, resulting in the cellular death. Sertraline also showed in vitro leishmanicidal activity, with an EC50 value of 2 ?M against promastigotes and 3.9 ?M against intracellular amastigote forms. Its toxicity in NCTC cells was 19.6 ?M, resulting in a selectivity index similar to miltefosine. Our studies confirmed the mitochondria of Leishmania as the primary target, and the uncoupling of the respiratory chain associated with energy collapse, oxidative stress, and the depolarization of ??m as the possible origin of this mitochondrial dysfunction. Metabolomics evidenced an extended metabolic disarray caused by SRT encompassing a decrease in the scavenging capacity of the thiol-redox metabolism and a severe depletion of the intracellular pool of amino acids and polyamines. The complete deterioration of energetic metabolism was evident through a multi-target mechanism, affecting the main metabolic pathways of the parasite. Finally, this study describes an anti-Leishmania activity of two approved oral drugs with lethal and irreversible mechanisms of action in the parasite, encouraging future preclinical studies in American visceral leishmaniasis.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-08-25T20:20:51Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Morgana Elias Arantes - 2016.pdf: 2372439 bytes, checksum: e242dc3a0095f55eea6f6e8fc5fe0748 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-26T11:39:26Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Morgana Elias Arantes - 2016.pdf: 2372439 bytes, checksum: e242dc3a0095f55eea6f6e8fc5fe0748 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-26T11:39:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Morgana Elias Arantes - 2016.pdf: 2372439 bytes, checksum: e242dc3a0095f55eea6f6e8fc5fe0748 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-03-14 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Schistosomiasis is a neglected tropical disease caused by parasites of the genus Schistosoma. In Brazil only Schistosoma mansoni transmits this disease. The World Health Organization estimated in 2012 approximately 249 million people at risk of acquiring this disease around the world. The main strategy to control this disease is the treatment of individuals living in endemic areas with Praziquantel. The drug praziquantel is used on a large scale in the treatment of schistosomiasis and currently there are reported cases of resistance, indicating the need to discover new drugs. In silico drug repositioning is a strategy that reduces the time and cost in the search of anti-schistosomal agents. This work used bioinformatics tools and methodology based on previous studies, as a means to identify potential new S. mansoni targets and drug homologs, consequently identifying potential new schistosomal drugs. A list was compiled with S. mansoni potential targets that are part of essential processes in the database TDR and the targets that are part of the tegument were obtained in the scientific literature. The file with S. mansoni targets contained 1376 targets, and of these only 61 targets associated with 399 drugs had homology with drug targets. After removal of duplicate drugs, drugs found in previous studies and after the analysis of the conservation of the active site only 28 S. mansoni targets associated with 102 drugs had 60% or more of the active site conserved. Some of the drugs had activity and are interesting to validate this study such as: artemether, lumefantrine, meloxicam. Among the drugs found 18 drugs were selected to be tested using the following criteria: low toxicity in vivo, expired patent and a value of log P interesting for oral administration. / A esquistossomose é uma doença tropical negligenciada causada por parasitos do gênero Schistosoma. No Brasil apenas o Schistosoma mansoni transmite esta doença. A Organização Mundial de Saúde estimou em 2012 cerca de 249 milhões de pessoas em risco de adquirirem esta doença por meio de diferentes espécies e países. A principal estratégia no controle desta doença é o tratamento dos indivíduos que vivem em áreas endêmicas com o fármaco praziquantel. O praziquantel é o fármaco utilizado em ampla escala no tratamento desta doença e atualmente há casos de resistência relatados, sendo necessário a descoberta de novos fármacos. O reposicionamento in silico é uma estratégia que reduz o tempo e o custo na busca de fármacos esquistossomicidas. Neste trabalho, por meio da ferramenta de bioinformática e com base em estudos anteriores, identificou-se potenciais novos alvos homólogos a alvos de fármacos em uso em humanos, identificando com isso, potenciais novos fármacos esquistossomicidas. Compilou-se uma lista com os potenciais alvos do S. mansoni que fazem parte das vias essências da base de dados do TDR e encontrou-se os alvos que fazem parte do tegumento na literatura científica. O arquivo com os alvos do S. mansoni continha 1376 alvos, sendo que destes apenas 61 alvos do S. mansoni possuía homologia com alvos de fármacos associados a 399 fármacos. Após a remoção dos fármacos duplicados, fármacos encontrados em estudos anteriores e após a análise da conservação do sítio ativo restou 28 alvos do S. mansoni associados a 102 fármacos que tinha 60% ou mais do sítio ativo. Encontrou-se alguns fármacos com atividade comprovada e validam o estudo como: artemeter, lumefantrina, meloxicam. Dentre os fármacos encontrados cerca 18 fármacos foram selecionados para serem testados e a sua atividade então comprovada, utilizando os seguintes critérios: baixa toxicidade in vivo, patente expirada e um valor de log P interessante para um fármaco de administração oral.

A quimioterapia disponível para o tratamento das leishmanioses conta com um número reduzido de fármacos, com efeitos adversos severos e progressivo aumento de resistência. O reposicionamento de fármacos oferece uma grande oportunidade para introdução de novas terapias. Antidepressivos orais têm demonstrado eficácia tanto in vitro quanto in vivo contra espécies de Leishmania spp. Neste estudo, o antidepressivo sertralina (SRT), e o fármaco ciclobenzaprina (CBP), um relaxante muscular de estrutura tricíclica análoga a antidepressivos, foram avaliados quanto a atividade contra Leishmania (L.) infantum. Estudos metabolômicos não dirigidos utilizando multiplataforma analítica, foram combinados a análises de parâmetros celulares, essenciais para obtenção de uma ampla descrição dos mecanismos de ação. A CBP mostrou uma atividade leishmanicida in vitro, com valor de CE50 de 4,3 ?M contra formas promastigotas e 8,6 ?M contra formas amastigotas intracelulares. O fármaco apresentou uma citotoxicidade (CC50) de 70,6 ?M em células NCTC, e um índice de seletividade similar a miltefosina. Os estudos de mecanismo de ação, sugeriram que a CBP se difunde pela membrana plasmática, causando diminuição do ??p e no interior citoplasmático, parece induzir um estresse do RE com liberação de Ca+2; concomitantemente, induz um desacoplamento brando da cadeia respiratória mitocondrial e depleção dos níveis de ATP. Com o efeito prolongado, a liberação de Ca+2 parece ativar a autofagia, e seu influxo para a mitocôndria potencializar os efeitos deletérios, diminuindo o ??m e aumentando a produção de ROS. A longo prazo, o CBP induz uma extensa alteração metabólica, caracterizada aumento dos níveis da maioria dos metabólitos identificados e atividade desregulada de transportadores de membrana, gerando alto gasto energético associado a condições insuficientes de produção de energia mitocondrial, resultando em morte celular. A sertralina também apresentou atividade leishmanicida in vitro, com valor de CE50 de 2 ?M contra formas promastigotas e 3,9 ?M contra formas amastigotas intracelulares. Sua toxicidade em células NCTC foi de 19,6 ?M, resultando em um índice de seletividade similar a miltefosina. Nossos estudos confirmaram a mitocôndria de Leishmania como alvo primário e, o efeito de desacoplamento da cadeia respiratória associado ao colapso energético, estresse oxidativo seguido da despolarização do ??m como a possível origem desta disfunção mitocondrial. Estudos metabolômicos evidenciaram que a extensão do desarranjo metabólico, abrange diminuição da capacidade de detoxificação do metabolismo tiol-redox, uma severa depleção do pool intracelular de aminoácidos e poliaminas, evidenciando uma completa deterioração do metabolismo energético, por meio de um mecanismo multialvo direcionado a vias metabólicas essências do parasita. Finalmente, este estudo descreve a atividade anti-Leishmania de dois fármacos orais aprovados, com mecanismos de ação letais e irreversíveis no parasita, encorajando o prosseguimento para futuros estudos pré-clínicos na leishmaniose visceral americana / The available chemotherapy for the treatment of leishmaniasis has a reduced number of drugs, with severe adverse effects and progressive increase of resistance. The drug repurposing offers a great opportunity for the introduction of new therapies. Oral antidepressants have been demonstrated efficacy both in vitro and in vivo against Leishmania spp. In this study, the antidepressant sertraline (SRT), and the drug cyclobenzaprine (CBP), a muscle relaxant with tricyclic structure analogous to antidepressants, were evaluated against Leishmania (L.) infantum. Untargeted metabolomic studies using multiplataform analysis were combined to cellular parameters to a broad description of the mechanisms of action. Cyclobenzaprine showed an in vitro leishmanicidal activity with an EC50 value of 4.3 ?M against promastigotes and 8.6 ?M against intracellular amastigote forms. The drug showed a cytotoxicity (CC50) of 70.6 ?M in NCTC cells, and a selectivity index similar to miltefosine. Mechanism of action studies suggested that CBP diffuses through the plasma membrane, causing a decrease of the ??p and inside the cytoplasm, the drug seems to induce an ER stress, with release of Ca+2; concomitantly, it induces a mild decoupling of the mitochondrial respiratory chain and depletion of ATP levels. With the prolonged effect, a release of Ca+ 2 appears to activate an autophagy, and its mitochondrial influx results in a potentiation of deleterious effects as decreasing of ??m and increasing ROS production. In long term, CBP induces an extensive metabolic alteration, characterized increased levels of most of the identified metabolites and unregulated activity of membrane transporters. These generates a high energy expenditure associated to limited conditions of mitochondrial energy production, resulting in the cellular death. Sertraline also showed in vitro leishmanicidal activity, with an EC50 value of 2 ?M against promastigotes and 3.9 ?M against intracellular amastigote forms. Its toxicity in NCTC cells was 19.6 ?M, resulting in a selectivity index similar to miltefosine. Our studies confirmed the mitochondria of Leishmania as the primary target, and the uncoupling of the respiratory chain associated with energy collapse, oxidative stress, and the depolarization of ??m as the possible origin of this mitochondrial dysfunction. Metabolomics evidenced an extended metabolic disarray caused by SRT encompassing a decrease in the scavenging capacity of the thiol-redox metabolism and a severe depletion of the intracellular pool of amino acids and polyamines. The complete deterioration of energetic metabolism was evident through a multi-target mechanism, affecting the main metabolic pathways of the parasite. Finally, this study describes an anti-Leishmania activity of two approved oral drugs with lethal and irreversible mechanisms of action in the parasite, encouraging future preclinical studies in American visceral leishmaniasis.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-18T10:58:40Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Lourival de Almeida Silva - 2015.pdf: 2573495 bytes, checksum: 0eee1e3d91463a3f757ecdc4fe7126ce (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-18T11:02:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Lourival de Almeida Silva - 2015.pdf: 2573495 bytes, checksum: 0eee1e3d91463a3f757ecdc4fe7126ce (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-18T11:02:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Lourival de Almeida Silva - 2015.pdf: 2573495 bytes, checksum: 0eee1e3d91463a3f757ecdc4fe7126ce (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Leishmaniasis is a neglected tropical disease responsible for physical, economic and social damages. Even though malaria is not classified as a neglected tropical disease, is responsible for high morbidity and mortality, especially in African countries. Current treatments for both diseases face several drawbacks, including the evolution of drugresistant parasites, the high cost of major drugs and the high toxicity of others. For these reasons, there is an urgent need to develop new drugs that minimize these downsides and, consequently, help eradicate these diseases. To overcome these difficulties, both academics and pharmaceutical companies are increasingly employing the so-called “drug repositioning strategy”. Drug repositioning aims to find new applications for drugs approved for other indications, and has proven valuable for decreasing research costs as well as to decrease the time required to market the "new" drug. In the present study, we used bioinformatics to identify and analyze molecular targets of the energy metabolism of Leishmania spp and of the P. falciparum apicoplast. The energy metabolism of Leishmania and the apicoplast metabolism have various enzymes that can be targeted by specific drugs, leading to lower toxicity and more promising therapies for humans. Using the TDR Targets database, we were able to identify 94 genes and 93 Leishmania energy metabolism targets. We identified 44 positive targets in these databases, and for 11 of these targets we found drugs already approved for use in humans. We used a similar strategy to identify antimalarial drugs that acted specifically against the apicoplast metabolism. The GeneDB database of the P. falciparum genome was used to compile a list of 600 proteins with apicoplast signal peptides. Each of these proteins was treated as a potential drug target and its predicted sequence was used to interrogate three different open access databases (DB TTD, DrugBank and STITCH ). We identified many drugs with the potential to interact with 47 peptides allegedly involved in apicoplast biology in P. falciparum. Fifteen of these hypothetical targets are predicted to interact with drugs are already approved for clinical use, but were never evaluated against malaria parasites. Our results suggest that the drugs identified here show potential activity against leishmania parasite and malaria, but need experimental validation to confirm their effectiveness. / As leishmanioses são parasitoses negligenciadas responsáveis por prejuízos físicos, econômicos e sociais. A malária, embora não seja classificada como negligenciada, é responsável por altos índices de morbidade e mortalidade, principalmente nos países africanos. Ao longo dos anos, o tratamento dos infectados tem sido a forma mais eficaz de controle dessas endemias. Entretanto, os efeitos tóxicos, o alto custo dos fármacos e a resistência dos parasitos têm sido os maiores desafios enfrentados pela terapêutica das leishmanioses e da malária. Sendo assim, é urgente a necessidade de desenvolver novos fármacos que minimizem esses transtornos e contribuam para erradicação dessas parasitoses. Diante disso, laboratórios acadêmicos, governos e organizações não governamentais têm apoiado projetos voltados para o reposicionamento de fármacos aprovados com vistas a reduzir custos e tempo de produção de novos antiparasitários. No presente trabalho, utilizamos a bioinformática para identificar, buscar e analisar alvos moleculares do metabolismo energético de Leishmania spp e do apicoplasto de P. falciparum, visando o reposicionamento in silico de fármacos. Utilizando a base de dados TDR Targets, identificamos 94 genes e 93 alvos do metabolismo energético de Leishmania. Em seguida, utilizando a sequência peptídica de cada alvo, interrogamos as bases de dados Drug Bank e TTD na busca de fármacos. Nossa busca resultou em 44 alvos positivos, dos quais 11 interagiam com 15 fármacos aprovados para uso em humanos. Utilizamos estratégia semelhante para identificar fármacos antimaláricos que atuassem especificamente contra o metabolismo do apicoplasto. A base de dados GeneDB do genoma de P. falciparum foi usada para compilar uma lista de cerca de 600 proteínas com peptídeos sinais do apicoplasto. Cada uma dessas proteínas foi tratada como potencial alvo de fármaco e sua sequência prevista foi usada para interrogar três diferentes bases de dados de acesso livre (TT DB, DrugBank e STITCH ) Identificamos fármacos com potencial de interagir com 47 peptídeos supostamente envolvidos na biologia do apicoplasto do P. falciparum. Quinze desses alvos hipotéticos são previstos interagir com fármacos já aprovados para uso clínico, mas que nunca foram avaliados contra os parasitos da malária. Os nossos resultados sugerem que os fármacos aqui identificados apresentam potencial para tratamentos das leishmanioses e da malária, mas que necessitam de validação experimental para confirmar sua eficácia.