Enterobactérias são importantes agentes de infecção podendo contaminar ambientes aquáticos poluídos por atividades antropogênicas, os quais podem ser importantes locais para a seleção e disseminação de bactérias resistentes aos antibacterianos (ATB) de uso na medicina humana e veterinária. O objetivo desse estudo foi monitorar a disseminação de enterobactérias resistentes aos ATB em ambientes aquáticos do estado de São Paulo. De 2009-2010, 135 enterobactérias resistentes à pelo menos um ATB, foram isoladas de rios, represas e estações de tratamento de esgoto. O fenótipo multirresistente (MR) foi predominante em 64% dos isolados, sendo que houve um predomino de E. coli (80%) e K. pneumoniae (48%). Oito porcento dos isolados apresentaram fenótipo ESBL (cefotaxima, CIM50 <font face=\"Symbol\">&#8805; 64 <font face=\"Symbol\">mg/ml) devido à presença de genes blaCTX-M-like, enquanto que a presença de genes qnr-like foi confirmada em 7% dos isolados resistentes à ciprofloxacina (CIM50 <font face=\"Symbol\">&#8805; 32<font face=\"Symbol\">mg/ml). A tipagem molecular revelou ausência de relação clonal entre os isolados de K. pneumoniae e E. coli. / Enterobacteria are important agents of infection may contaminate aquatic environments polluted by anthropogenic activities, which may be important sites for the selection and spread of bacteria resistant to antibiotics (ATB) for use in human and veterinary medicine. The aim of this study was to monitor the spread of enterobacteria resistant to ATB in aquatic environments of the state of Sao Paulo. From 2009-2010, 135 Enterobacteriaceae resistant to at least one ATB, were isolated from rivers, dams and sewage treatment plants. The phenotype resistant (MDR) was predominant in 64% of the isolates, and there was the predominance of E. coli (80%) and K pneumoniae (48%). Eight percent of the isolates showed ESBL phenotype (cefotaxime, MIC50 <font face=\"Symbol\">&#8805; 64 <font face=\"Symbol\">mg/ml) due to the presence of blaCTX-M-like, while the presence qnr-like gene was confirmed in 7% of isolates resistant to (ciprofloxacin MIC50 <font face=\"Symbol\">&#8805; 32<font face=\"Symbol\">mg/ml). Molecular typing revealed no clonal relationship among isolates of K. pneumoniae and E. coli.

Como entre 25-50% dos isolados de Mycobacterium tuberculosis resistentes à INH não apresentam mutações nos genes katG, inhA, ahpC e kasA que possam justificar sua resistência, foi proposta a influência de mutações específicas no gene nat nos mecanismos de resistência e atividade da NAT. Todos os isolados obtidos (n=125) foram identificados e caracterizados através da amplificação pela PCR da IS6110 e por MIRU-VNTR, respectivamente. A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi realizada pelo método REMA. Após triagem de mutações nos genes caracteristicamente envolvidos com resistência pela PCR-SSCP, seguida de seqüenciamento de DNA, foram selecionados 45 isolados para o estudo de mutações específicas (pela PCR e sequenciamento) e expressão gênica do mRNA do gene nat através da RT-PCR em tempo real. Confirmou-se que mutação no gene katG é a mais correlacionada com a resistência à INH, pois 68,4% das cepas resistentes apresentaram mutação neste gene. Mutações na região promotora do gene inhA, na região intergênica oxyR-ahpC e no gene kasA foram encontradas em 8,8%, 5,6% e 21,6% dos isolados, respectivamente. Mutações no gene nat, das quais 4 não haviam sido descritas previamente, foram encontradas em 40,0% dos isolados. Apesar dessas mutações causarem alterações na proteína, não foi observada uma relação direta com aumento na CIM. Também não foi observada relação entre a variação da expressão do mRNA do gene nat com os valores de CIM e com o número de mutações, tanto específicas do gene nat como em outros genes caracteristicamente relacionados com resistência à INH. / Since around 25-50% of the Mycobacterium tuberculosis strains resistant to INH do not present any mutation in katG, inhA, ahpC and kasA genes that could explain their resistance, we proposed to evaluate the influence of specific mutations in the nat gene in the mechanisms of resistance and in the activity of NAT. All strains were identified and characterized molecularly by the amplification by PCR of the IS6110 region and by MIRU-VNTR, respectively. The minimal inhibitory concentration (MIC) was performed using the REMA method. After screening of mutations in the resistant-related genes by PCR-SSCP followed by DNA sequencing, 45 strains were selected to be evaluated for specific mutations (by PCR and sequencing) and mRNA expression of nat by real time RT-PCR. It was showed that mutations in the katG gene were the most frequent and related to INH resistance since 68.4% of all resistant strains presented mutation in this gene. Mutations in the promoter region of inhA gene, oxyR-ahpC intergenic region and kasA gene were found in 8.8%, 5.6% and 21.6% of the strains, respectively. Mutations in the nat gene, four of them not previously described, were found in 40.0% of the strains. Although those mutations influence in the protein produced it was not observed a direct relation in an increase in CIM. It was also noted no relation between the expression of mRNA of nat gene neither with the MIC values nor with the number of mutations, both specific of nat gene as well in the other genes characteristically related to INH resistance.

Introdução: Após o surgimento e disseminação das &#946;-lactamases (BL) de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenem, ertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha pela estabilidade apresentada contra estas enzimas. Infelizmente, em 2005, o primeiro caso de infecção fatal por um isolado de Klebsiella pneumoniae resistente aos carbapenêmicos foi relatado em nosso país. A partir deste, novos casos de infecção, inclusive por outros gêneros da família Enterobacteriaceae como Enterobacter, Providencia e Escherichia, começaram a surgir. Como mecanismo de resistência aos carbapenêmicos, a expressão de enzimas carbapenemases tem sido mundialmente relatada, enquanto que, a impermeabilidade associada à produção de enzimas do tipo AmpC ou ESBL tem sido esporádica. Com relação à mobilização dos determinantes genéticos de resistência, elementos móveis como integrons e plasmídios têm sido associados. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, sua mobilização genética e disseminação clonal em amostras clínicas de enterobactérias isoladas em diversos hospitais brasileiros. Material e métodos: Foram estudadas 28 cepas recuperadas de oito centros hospitalares descritas como resistentes ao imipenem. A caracterização fenotípica foi realizada por: i) determinação da CIM na presença e ausência de inibidores de BL, ii) bioensaio para produção de BL e iii) SDS-PAGE para investigar a ausência de porinas. A confirmação genotípica da resistência mediada por &#946;-lactamases foi realizada por PCR e seqüenciamento e a sua localização plasmidial foi estudada por transformação. Por último, a tipagem molecular foi realizada pela técnica de ERIC-PCR, sendo confirmada pela técnica de PFGE. Resultados: 25 cepas apresentaram resistência para carbapenêmicos (imipenem MIC 8-128 &#181;g/mL), todas com perfil de multiresistência incluindo cefoxitina (CIM90 &#8805;32 &#181;g/mL). Foram identificados três determinantes de resistência, entre eles, a produção de carbapenemases de tipo MBL (IMP-1) e a enzima KPC-2, recentemente descrita, sendo emergente no país. O mecanismo mais prevalente nas amostras estudadas foi a impermeabilidade de membrana associada à expressão de enzimas do tipo AmpC (CMY-2 plasmidial para E. coli e AmpC cromossômica no caso de Enterobacter aerogenes), as quais mostraram uma contribuição significativa para a resistência aos carbapenêmicos. Dos 28 isolados, 18 apresentaram a perda da porina de 36 kDa, responsável pela entrada de antimicrobianos na bactéria, como os carbapenêmicos. Tanto os genes blaKPC-2 e blaCMY-2 foram transferidos com êxito para E. coli DH10B, confirmando sua localização plasmidial. A co-produção de carbapenemase ou enzimas do tipo AmpC com ESBL do tipo CTX-M foi confirmada em 68% dos isolados. A tipagem molecular mostrou uma disseminação clonal para os isolados carregando determinantes IMP-1 e as enzimas do tipo AmpC cromossômica e plasmidial. Ao contrário, isolados expressando KPC não foram clonalmente relacionadas. Conclusão: A caracterização de resistência apresentada neste trabalho demonstrou uma mudança no perfil de resistência da família Enterobactériaceae devido à sua versatilidade para a aquisição de novos mecanismos de resistência, como sua adaptação aos ambientes hostis. A perda da porina foi o mecanismo mais freqüente nesta família e a co-produção de BL foi um evento associado. Finalmente, os dados obtidos na tipagem molecular denotaram uma disseminação majoritariamente clonal na cidade de São Paulo, com exceção das cepas produtoras de KPC-2, cuja presença tem sido relatada em outras cidades do país, sugerindo a participação de uma transferência horizontal. / Introduction: After emergence, and dissemination of extended spectrum &#946;-lactamases (ESBL) in members of the Enterobacteriaceae family, carbapenem antibiotics (imipenem, meropenem, ertapenem) have been the therapy of choice, since they are stable to ESBL hydrolysis. Unfortunately, in 2005, the first fatal case of infection by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae was related in our country. From this episode, new infection cases, including by other genders of Enterobacteriaceae such as Enterobacter, Providencia and Escherichia, began to appear. Regarding carbapenem resistance mechanisms, expression of carbapenem hydrolyzing enzymes has been worldwide reported, whereas interplay between impermeability and AmpC or ESBL production has been sporadic. Furthermore, integrons and plasmids have been associated with mobilization of genetic determinants. The aim of this study was to characterize the mechanisms of resistance to carbapenems, their genetic mobilization and clonal dissemination in enterobacterial isolates recovered from clinical samples in Brazilian hospitals. Material and methods: 28 imipenem-resistant isolates recovered from 8 hospital centres were studied. Phenotypic profiles were characterized by: i) MIC of carbapenems in the presence/absence of &#946;-lactamase inhibitors; ii) bioassay for &#946;-lactamase production; iii) SDS-PAGE to investigate absence of outer membrane porins (OMPs). Molecular characterization of &#946;-lactamase-mediated resistance was made by PCR and DNA sequencing and their plasmid localization was evaluated by transformation. Finally, epidemiological typing was performed by ERIC-PCR, being confirmed by PFGE. Results: 25 isolates were confirmed as being resistant to imipenem (MIC 8-128 &#181;g/mL), exhibiting a multidrug-resistant profile, including to cefoxitin (MIC90 &#8805;32 &#181;g/mL). Two main mechanism of resistance were identified: i) hydrolysis of carbapenem by class B (IMP-1-like MBL) and class A (KPC-2) enzymes, (the latter being recently reported in our country), and ii) outer membrane impermeability associated to AmpC enzyme production (plasmid-mediated CMY-2 for E. coli and chromosomal AmpC for E. aerogenes), which was the most prevalent mechanism found. Eighteen of 28 isolates lacked 36kDa OMP, which is responsible for uptake of carbapenem antibiotics. The blaKPC-2 and blaCMY-2 genes were successful transferred to E. coli DH10B, confirming the plasmid location of both genes. Co-production of carbapenemases or AmpC and CTXM enzymes was confirmed in 68% of isolates, and molecular typing showed clonal dissemination of IMP-1-, plasmid AmpC- and chromosomal AmpC-producing isolates. Otherwise, KPC-2-producing isolates were not clonally related. Conclusion: The characterization of resistance mechanisms to carbapenems, in this study, reveals a change in the resistance patterns among Enterobacteriaceae family members in Brazilian hospitals, due to versatility of isolates to acquire new resistance determinants, which it has favoured the adaptation to hostile environments. Lack of 36 kDa OMP was the most frequent resistance mechanism, being associated to co-production of &#946;-lactamases. Finally, molecular typing denote a clonal dissemination of imipenem-resistant isolates in Sao Paulo city, with exception of KPC-2-producing isolates, which have been described in other Brazilian cities, suggesting a horizontal gene transfer.

Infecção do Trato Urinário (ITU) é o segundo tipo de infecção bacteriana mais comum em crianças. Nesse estudo amostras de urina de 6012 pacientes pediátricos foram analisadas, a prevalência de ITU foi determinada, os uropatógenos foram identificados e o perfil antimicrobiano dos mesmos foi determinado. Os resultados mostraram que a prevalência de ITU varia de acordo com o sexo e a idade do paciente. Bactérias Gram-negativas foram responsáveis por 89 % de todos os casos de ITU e Escherichia coli foi a espécie mais prevalente. Os uropatógenos foram resistentes a ampicilina 63 %, a nitrofurantoina 37 % e ao trimethoprim-sulfamethoxazole 28 %. Todavia, 99 % deles foram sensíveis a cefalexina e 96 % ao cloranfenicol. Resultados obtidos com a caracterização de 90 isolados de E. coli, mostraram que todas as amostras foram positivas para os marcadores fimA e fimH, 53 % para pap, 32 % para sfa, 10 % para o marcador genético da toxina pic e 29 % foram capazes de produzir hemolisina-a. Esses isolados se distribuíram entre os grupos filogenéticos da seguinte maneira: B2 42 %, D 25 %, A 21 % e B1 11 %. Dessas amostras 19 % não foram tipáveis (ONT), 15,56 % pertenceram ao sorogrupo O2 e 12,22 % aos sorogrupos O6 e OR. A maioria dos isolados de E. coli aderiu às células epiteliais, poliestireno e PVC. / Urinary Tract Infection (UTI) is the second most common type of bacterial infection in children. In this study, 6012 urine samples from pediatric patients were analyzed, the prevalence of UTI was determined, the uropathogens were identified and their antimicrobial profile was determined. The results have shown that the prevalence of UTI varies according to the sex and age of the patient. Gram negative bacteria were responsible for 89 % of all cases of UTI and E. coli was the most prevalent species. The uropathogens were resistant to: ampicillin 63 %, nitrofurantoin 37 % and trimethoprim-sulfamethoxazole 28 %. However, 99 % of them were sensitive to cephalexin and 96 % to chloramphenicol. Results obtained with the characterization of 90 isolates of E. coli showed that all of them were positive for fimA and fimH, 53 % were positive for pap, 32 % were positive for sfa, 10 % were positive for the genetic marker of pic and 29 % were able to produce hemolysin-a. These isolates were distributed between the phylogenetic groups as follows: B2 42 %, D 25 %, A 21 % and B1 11 %. Nineteen percent of these samples were untypeable (ONT), 15.56 % belonged to O2 serogroup and 12,22 % belonged to the O6 and OR serogroups. Most E. coli isolates were able to adhere to epithelial cells, polystyrene and PVC.

Introdução: Após o surgimento e disseminação das &#946;-lactamases (BL) de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenem, ertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha pela estabilidade apresentada contra estas enzimas. Infelizmente, em 2005, o primeiro caso de infecção fatal por um isolado de Klebsiella pneumoniae resistente aos carbapenêmicos foi relatado em nosso país. A partir deste, novos casos de infecção, inclusive por outros gêneros da família Enterobacteriaceae como Enterobacter, Providencia e Escherichia, começaram a surgir. Como mecanismo de resistência aos carbapenêmicos, a expressão de enzimas carbapenemases tem sido mundialmente relatada, enquanto que, a impermeabilidade associada à produção de enzimas do tipo AmpC ou ESBL tem sido esporádica. Com relação à mobilização dos determinantes genéticos de resistência, elementos móveis como integrons e plasmídios têm sido associados. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, sua mobilização genética e disseminação clonal em amostras clínicas de enterobactérias isoladas em diversos hospitais brasileiros. Material e métodos: Foram estudadas 28 cepas recuperadas de oito centros hospitalares descritas como resistentes ao imipenem. A caracterização fenotípica foi realizada por: i) determinação da CIM na presença e ausência de inibidores de BL, ii) bioensaio para produção de BL e iii) SDS-PAGE para investigar a ausência de porinas. A confirmação genotípica da resistência mediada por &#946;-lactamases foi realizada por PCR e seqüenciamento e a sua localização plasmidial foi estudada por transformação. Por último, a tipagem molecular foi realizada pela técnica de ERIC-PCR, sendo confirmada pela técnica de PFGE. Resultados: 25 cepas apresentaram resistência para carbapenêmicos (imipenem MIC 8-128 &#181;g/mL), todas com perfil de multiresistência incluindo cefoxitina (CIM90 &#8805;32 &#181;g/mL). Foram identificados três determinantes de resistência, entre eles, a produção de carbapenemases de tipo MBL (IMP-1) e a enzima KPC-2, recentemente descrita, sendo emergente no país. O mecanismo mais prevalente nas amostras estudadas foi a impermeabilidade de membrana associada à expressão de enzimas do tipo AmpC (CMY-2 plasmidial para E. coli e AmpC cromossômica no caso de Enterobacter aerogenes), as quais mostraram uma contribuição significativa para a resistência aos carbapenêmicos. Dos 28 isolados, 18 apresentaram a perda da porina de 36 kDa, responsável pela entrada de antimicrobianos na bactéria, como os carbapenêmicos. Tanto os genes blaKPC-2 e blaCMY-2 foram transferidos com êxito para E. coli DH10B, confirmando sua localização plasmidial. A co-produção de carbapenemase ou enzimas do tipo AmpC com ESBL do tipo CTX-M foi confirmada em 68% dos isolados. A tipagem molecular mostrou uma disseminação clonal para os isolados carregando determinantes IMP-1 e as enzimas do tipo AmpC cromossômica e plasmidial. Ao contrário, isolados expressando KPC não foram clonalmente relacionadas. Conclusão: A caracterização de resistência apresentada neste trabalho demonstrou uma mudança no perfil de resistência da família Enterobactériaceae devido à sua versatilidade para a aquisição de novos mecanismos de resistência, como sua adaptação aos ambientes hostis. A perda da porina foi o mecanismo mais freqüente nesta família e a co-produção de BL foi um evento associado. Finalmente, os dados obtidos na tipagem molecular denotaram uma disseminação majoritariamente clonal na cidade de São Paulo, com exceção das cepas produtoras de KPC-2, cuja presença tem sido relatada em outras cidades do país, sugerindo a participação de uma transferência horizontal. / Introduction: After emergence, and dissemination of extended spectrum &#946;-lactamases (ESBL) in members of the Enterobacteriaceae family, carbapenem antibiotics (imipenem, meropenem, ertapenem) have been the therapy of choice, since they are stable to ESBL hydrolysis. Unfortunately, in 2005, the first fatal case of infection by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae was related in our country. From this episode, new infection cases, including by other genders of Enterobacteriaceae such as Enterobacter, Providencia and Escherichia, began to appear. Regarding carbapenem resistance mechanisms, expression of carbapenem hydrolyzing enzymes has been worldwide reported, whereas interplay between impermeability and AmpC or ESBL production has been sporadic. Furthermore, integrons and plasmids have been associated with mobilization of genetic determinants. The aim of this study was to characterize the mechanisms of resistance to carbapenems, their genetic mobilization and clonal dissemination in enterobacterial isolates recovered from clinical samples in Brazilian hospitals. Material and methods: 28 imipenem-resistant isolates recovered from 8 hospital centres were studied. Phenotypic profiles were characterized by: i) MIC of carbapenems in the presence/absence of &#946;-lactamase inhibitors; ii) bioassay for &#946;-lactamase production; iii) SDS-PAGE to investigate absence of outer membrane porins (OMPs). Molecular characterization of &#946;-lactamase-mediated resistance was made by PCR and DNA sequencing and their plasmid localization was evaluated by transformation. Finally, epidemiological typing was performed by ERIC-PCR, being confirmed by PFGE. Results: 25 isolates were confirmed as being resistant to imipenem (MIC 8-128 &#181;g/mL), exhibiting a multidrug-resistant profile, including to cefoxitin (MIC90 &#8805;32 &#181;g/mL). Two main mechanism of resistance were identified: i) hydrolysis of carbapenem by class B (IMP-1-like MBL) and class A (KPC-2) enzymes, (the latter being recently reported in our country), and ii) outer membrane impermeability associated to AmpC enzyme production (plasmid-mediated CMY-2 for E. coli and chromosomal AmpC for E. aerogenes), which was the most prevalent mechanism found. Eighteen of 28 isolates lacked 36kDa OMP, which is responsible for uptake of carbapenem antibiotics. The blaKPC-2 and blaCMY-2 genes were successful transferred to E. coli DH10B, confirming the plasmid location of both genes. Co-production of carbapenemases or AmpC and CTXM enzymes was confirmed in 68% of isolates, and molecular typing showed clonal dissemination of IMP-1-, plasmid AmpC- and chromosomal AmpC-producing isolates. Otherwise, KPC-2-producing isolates were not clonally related. Conclusion: The characterization of resistance mechanisms to carbapenems, in this study, reveals a change in the resistance patterns among Enterobacteriaceae family members in Brazilian hospitals, due to versatility of isolates to acquire new resistance determinants, which it has favoured the adaptation to hostile environments. Lack of 36 kDa OMP was the most frequent resistance mechanism, being associated to co-production of &#946;-lactamases. Finally, molecular typing denote a clonal dissemination of imipenem-resistant isolates in Sao Paulo city, with exception of KPC-2-producing isolates, which have been described in other Brazilian cities, suggesting a horizontal gene transfer.

Infecção do Trato Urinário (ITU) é o segundo tipo de infecção bacteriana mais comum em crianças. Nesse estudo amostras de urina de 6012 pacientes pediátricos foram analisadas, a prevalência de ITU foi determinada, os uropatógenos foram identificados e o perfil antimicrobiano dos mesmos foi determinado. Os resultados mostraram que a prevalência de ITU varia de acordo com o sexo e a idade do paciente. Bactérias Gram-negativas foram responsáveis por 89 % de todos os casos de ITU e Escherichia coli foi a espécie mais prevalente. Os uropatógenos foram resistentes a ampicilina 63 %, a nitrofurantoina 37 % e ao trimethoprim-sulfamethoxazole 28 %. Todavia, 99 % deles foram sensíveis a cefalexina e 96 % ao cloranfenicol. Resultados obtidos com a caracterização de 90 isolados de E. coli, mostraram que todas as amostras foram positivas para os marcadores fimA e fimH, 53 % para pap, 32 % para sfa, 10 % para o marcador genético da toxina pic e 29 % foram capazes de produzir hemolisina-a. Esses isolados se distribuíram entre os grupos filogenéticos da seguinte maneira: B2 42 %, D 25 %, A 21 % e B1 11 %. Dessas amostras 19 % não foram tipáveis (ONT), 15,56 % pertenceram ao sorogrupo O2 e 12,22 % aos sorogrupos O6 e OR. A maioria dos isolados de E. coli aderiu às células epiteliais, poliestireno e PVC. / Urinary Tract Infection (UTI) is the second most common type of bacterial infection in children. In this study, 6012 urine samples from pediatric patients were analyzed, the prevalence of UTI was determined, the uropathogens were identified and their antimicrobial profile was determined. The results have shown that the prevalence of UTI varies according to the sex and age of the patient. Gram negative bacteria were responsible for 89 % of all cases of UTI and E. coli was the most prevalent species. The uropathogens were resistant to: ampicillin 63 %, nitrofurantoin 37 % and trimethoprim-sulfamethoxazole 28 %. However, 99 % of them were sensitive to cephalexin and 96 % to chloramphenicol. Results obtained with the characterization of 90 isolates of E. coli showed that all of them were positive for fimA and fimH, 53 % were positive for pap, 32 % were positive for sfa, 10 % were positive for the genetic marker of pic and 29 % were able to produce hemolysin-a. These isolates were distributed between the phylogenetic groups as follows: B2 42 %, D 25 %, A 21 % and B1 11 %. Nineteen percent of these samples were untypeable (ONT), 15.56 % belonged to O2 serogroup and 12,22 % belonged to the O6 and OR serogroups. Most E. coli isolates were able to adhere to epithelial cells, polystyrene and PVC.