Orientador: Angelo Pires do Prado / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T01:14:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cabrini_Isaias_D.pdf: 2849716 bytes, checksum: ed08a0c88dd0e1b75d716f1c4b64e9ff (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Métodos para controlar e monitorar a susceptibilidade de insetos vetores tem sido estudado. Órgãos governamentais como World Health Organization (WHO) e Center of Disease Control (CDC) tem preconizado metodologias de bioensaios para avaliação em laboratório de resistência de mosquitos. O objetivo para se realizar testes de susceptibilidade é detectar a presença de indivíduos resistentes em uma população de inseto para que se possa, tão logo quanto possível, iniciar planos de controle alternativo, evitando-se assim os custos adicionais e problemas na redução da população do vetor. No entanto, alguns aspectos de tais metodologias são questionáveis e podem comprometer a metodologia como eficaz para revelar se uma população está resistente a um determinado inseticida. Por exemplo: 1) o Método do Papel Impregnado (WHO) possui algumas desvantagens como alto custo do material, falhas no contado do mosquito com a superfície tratada e possibilidade de perda de indivíduos durante o manuseio dos equipamentos; 2) O Método de Atividade Intrínseca do Inseticida (WHO) propõe a utilização de CO2 e baixa temperatura para anestesiar os mosquitos e acetona como diluente e aplicação do inseticida com um micro-capilar que proporciona gotas de 0,1 ?L. No entanto, os meios de anestesia levam ao estresse fisiológico, a baixa temperatura retarda a evaporação da acetona e o micro-capilar não libera o volume correto de solução e; 3) o Método da Garrafa Impregnada (CDC) permite que os mosquitos recebam o inseticida apenas pelo contato tarsal e dessa forma a quantidade de inseticida recebida pelo inseto pode não ser letal. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma metodologia que eliminasse tais desvantagens. Foi possível demonstrar que a exposição de machos e fêmeas de Aedes aegypti ao CO2, baixa temperatura ou ambos, leva a uma mortalidade significativa. Um método de imobilização por meio de sucção foi desenvolvido, utilizando-se um aspirador de pó portátil. Esse método permitiu a imobilização de mosquitos e moscas (Chloropidae), havendo uma baixa mortalidade de mosquitos apenas após 60 min. de permanente imobilização, concluindo-se que o método de imobilização por sucção pode substituir os métodos de anestesia. Um método de aplicação líquida foi proposto, utilizando-se dispersores utilizados para aplicação de perfume, sendo que um dos parâmetros avaliados foi o tamanho de gotas. Os resultados demonstraram que é possível a utilização desses dispersores para aplicação de inseticida, pois há homogeneidade no tamanho das gotas. Utilizando esse método de aplicação, avaliou-se a possibilidade de utilização de acetona ou álcool etílico como diluente de inseticidas, sendo que a acetona causou alta mortalidade em fêmeas e machos de Ae. aegypti e dessa forma foi proposto à utilização de álcool etílico. A metodologia aqui proposta foi utilizada para análise de susceptibilidade do mosquito Aedes aegypti (Culicidae) e mosca Liohippelates nigrifons (Chloropidae) aos inseticidas malation e deltametrina. Foi possível estabelecer a linha base de susceptibilidade, a CL50 e a concentração diagnóstico. Além disso, foi possível detectar a resistência de uma população de Ae. aegypti advinda do campo. Conclui-se que a metodologia de imobilização associada ao método de aplicação líquida pode ser utilizada para detecção de resistência de mosquitos / Abstract: Methods to control and monitor the susceptibility of vectors has been studied. Government agencies like World Health Organization (WHO) and Centers for Disease Control (CDC) has recommended methodologies bioassays for evaluating resistance in mosquitoes in the laboratory. The goal is to perform susceptibility testing is to detect the presence of resistant individuals in a population of insects so that we can, as soon as possible, initiate alternative control plans, thus avoiding additional costs and problems in reducing the vector population. However, some aspects of these methodologies are questionable and may denigrate as effective methodology to find out if a population is resistant to a particular insecticide. For example: 1) Method of Impregnated Paper (WHO) has some disadvantages such as high cost of material failures counted mosquito with the treated surface and the possibility of loss of individuals during handling equipment, 2) The Method of Intrinsic Activity of Insecticide (WHO) proposes the use of CO2 and low temperature to anesthetize mosquitoes and acetone as diluents and insecticide application with a micro-capillary that provides drops of 0.1 ?l. However, the means of anesthesia leading to physiological stress, low temperature retards the evaporation of acetone and the micro-capillary will not release the correct volume of solution, and 3) the method of Impregnated bottle (CDC) enables receiving mosquito insecticide only by tarsal contact and thus the amount of insecticide received by the insect cannot be sufficiently lethal. This study aimed to develop a methodology that would eliminate such disadvantages. It was possible to demonstrate that exposure of male and female Aedes aegypti CO2, low temperature, or both leads to a significant mortality. A method of immobilization by suction was developed using a portable vacuum cleaner. This method allowed for the immobilization of mosquitoes and flies (Chloropidae), having a low mosquito mortality after only 60 min. permanent immobilization, concluding that the immobilization method by suction can override the methods of anesthesia. A liquid application method was proposed, using disperser's perfume, and one of the parameters evaluated droplet size. The results demonstrated that it is possible to use the dispersers for insecticide application, as there uniformity in droplet size. Using this application method, we evaluated the possibility to use acetone or ethanol as diluents insecticides, and acetone caused high mortality in female and male Ae. aegypti and thus it was proposed to use alcohol. The methodology proposed here was used to analyze the susceptibility of the mosquito Aedes aegypti (Culicidae) and fly Liohippelates nigrifons (Chloropidae) to insecticides Malathion and Deltamethrin. It was possible to establish baseline susceptibility, and the LC50 concentration diagnosis. Moreover, it was possible to detect the resistance of an Ae. aegypti originating from the field. It is concluded that the method of immobilization associated liquid application method can be used to detect resistance of mosquitoes / Doutorado / Parasitologia / Doutor em Parasitologia

Orientador: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T11:05:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_NormaMachadoda_D.pdf: 6129934 bytes, checksum: 5d8a07895afd2e470c9fd5caf8ac9fb8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Cochliomyia hominivorax é considerada uma importante praga por causar perdas econômicas para a pecuária na região Neotropical. Este ectoparasita tem sido controlado principalmente por inseticidas, entretanto, este método normalmente resulta na seleção de indivíduos resistentes. Nesta tese foram investigados mecanismos associados com resistência a inseticidas organofosforados e piretróides. Os resultados apresentados nesta tese estão divididos em dois artigos. No artigo 1 foram investigados dois mecanismos de resistência a piretróides, um conhecido como kdr (knockdown resistance), associado à mutações no canal de sódio, e a mutação W251S no gene da carboxilesterase E3, a qual têm sido associada à hidrólise de piretróides. Foram investigadas populações da atual distribuição geográfica de C. hominivorax através de PCR-RFLP. Para a mutação kdr (L1014F) nenhum indivíduo mutante foi encontrado. Entretanto, a mutação W251S foi encontrada em todas as populações, com as mais altas freqüências nas amostras da Venezuela (100%) e Colômbia (93.75%). Em algumas populações amostradas, apesar da freqüência do alelo mutante ter sido relativamente baixa, o número de indivíduos portadores de pelo menos um alelo mutante foi alto. No bioensaio com cipermetrina (piretróide tipo II), utilizando amostras de Estiva (MG), os resultados analisados através do teste exato de Fisher indicaram que para a mais baixa concentração (p=0.0003) e para uma concentração intermediária (p= 0.024), a presença da mutação W251S está correlacionada com as chances de sobrevivência. Entretanto, na mais alta concentração (p= 0.221) a presença desta mutação não foi correlacionada com a sobrevivência, o que possivelmente indica dificuldade em hidrolisar este tipo de piretróide em concentrações maiores. No Artigo 2, as mutações G137D no gene da carboxilesterase E3, e as mutações I298V, G401A e F466Y no gene da acetilcolinesterase, associadas com resistência a organofosforados, foram investigadas nas mesmas populações do artigo 1, através de PCR-RFLP e sequenciamento direto de PCR. A região codificante completa da acetilcolinesterase também foi caracterizada e proposto um modelo para a estrutura tridimensional desta proteína com base na estrutura da acetilcolinesterase de Drosophila melanogaster. Possíveis alterações na proteína causadas pelas mutações associadas com resistência a organofosforados foram discutidas. No gene da acetilcolinesterase somente 2 de 135 indivíduos analisados apresentaram uma das mutações investigadas, a F466Y, o que pode estar associado ao alto custo no valor adaptativo do indivíduo, causado por algumas mutações neste gene ou inexistência dos demais alelos mutantes nestas populações. Entretanto, para a mutação G137D no gene da E3 foi encontrado um alto número de indivíduos portadores de pelo menos um alelo mutante na maioria das populações brasileiras e no Uruguai. Em Cuba, Venezuela e Colômbia nenhum indivíduo mutante para G137D foi encontrado, o que pode estar relacionado com os inseticidas usados no controle de C. hominivorax nestas regiões ou com a inexistência do alelo mutante nestas localidades. Os resultados de ambos os trabalhos indicam que mutações no gene da carboxilesterase E3 são um dos principais mecanismos de resistência selecionados nesta espécie, dentre os investigados até o momento. Este estudo representa um importante avanço no entendimento da base molecular da resistência a inseticidas em um importante ectoparasita. / Abstract: Cochliomyia hominivorax is an important ectoparasite, causing considerable economic losses to livestock sector in Neotropical region. This ectoparasite has been controlled mainly by applying insecticides, however, this method usually results in the selection of resistant individuals. In this thesis, mechanisms associated with organophosphate and pyrethroid insecticide resistance were investigated. The results presented in this thesis are divided in two articles. In the Article 1 two mechanisms associated with pyrethroid resistance were investigated, the kdr (knockdown resistance), a generic term for mutations in the sodium channel, and a mutation in the residue 251 of the carboxylesterase E3 gene, which have been associated with pyrethroid hydrolysis. Populations of actual geographical distribution of C. hominivorax were investigated through PCR-RFLP. For the kdr mutation, no mutant individuals were found. However, the W251S mutation was found in all populations investigated, with the highest frequencies in the samples from Colombia (100%) and Venezuela (93.75%). In some populations, despite relatively low mutant allele frequency, the number of individuals having at least one mutant allele was high. A bioassay with cypermethrin (pirethroid type II) was also performed, using samples from Estiva (MG). The results of the Fisher's exact test for the lowest concentration (p=0.0003, a= 0.05) and for an intermediate concentration (p= 0.024, a= 0.05) indicated that the presence of W251S mutation are correlated with the survival. However, at the highest concentration, Fisher's exact test (p= 0.221, a= 0.05) indicated that the presence of this mutation was not correlated with survival. These results indicate that the W251S mutation in C. hominivorax probably presents difficulties in hydrolyzing of this kind of pyrethroid, in high concentrations. In the Article 2, the G137D mutation, in the carboxylesterase E3 gene, and the I298V, G401A and F466Y mutations in the acetylcholinesterase gene, associated with organophosphate resistance, were investigated. The same populations of article 1 were analyzed using PCR-RFLP and PCR direct sequencing. The complete coding region of acetylcholineserase also was characterized and a putative model for the three-dimensional structure of this protein was proposed, based on solved structure of Drosophila melanogaster. Possible alterations in the protein, caused by mutations associated with organophosphate resistance, were discussed. For the acetylcholinesterase gene, only 2 of 135 individuals analyzed presented one of the mutations investigated, the F466Y. This fact may be related with the fitness cost of some mutations in this gene, or the inexistence of mutant alleles in these populations. For the G137D mutation, a high number of individuals having at least one mutant allele were found in most of the Brazilian populations and in Uruguay. In Cuba, Venezuela and Colombia no G137D mutant was found, a finding that may be related to the insecticides used for C. hominivorax control in these regions. The results of these two works indicate that mutations in the carboxylesterase E3 gene are one of the main insecticide resistance mechanisms selected in this species, so far investigated. This study represents a significant advance in the understanding of the molecular basis of insecticide resistance in an important livestock ectoparasite. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Claudia Marcia Aparecida Carareto / Banca: Ricardo De Marco / Banca: André Luís Laforga Vanzela / Resumo: A resistência aos inseticidas é um modelo de processo evolutivo onde o inseticida atua como agente seletivo e, como resposta à seleção, ocorre a evolução da resistência nas populações de insetos. As enzimas citocromo P450 monooxigenases (CYP) formam uma família responsável pela resistência aos inseticidas. Tem sido proposto que a inserção de elementos transponíveis (TEs) em regiões reguladoras ou codificadoras dos genes da família Cyp pode alterar a expressão gênica e induzir a resistência aos inseticidas. No presente estudo foram realizadas análises in silico que permitiram identificar a ocorrência de inserções de fragmentos de TEs em 35 genes Cyps com diferentes funções, e em seus genes flanqueadores, em Drosophila melanogaster e D. simulans, além de 13 genes Cyps de seis espécies do grupo melanogaster de Drosophila. As inserções de TEs ocorreram principalmente nas regiões flanqueadoras 5' dos Cyps associados à resistência aos inseticidas e à função monooxigenase geral. Os resultados não indicaram qualquer relação entre a distância em relação ao gene e o número de inserções. As análises mostraram que a maioria das inserções pertence à classe de transposons de DNA, sendo o transposon DNAREP1_DM o que apresentou o maior número de cópias. O fato de essas seqüências apresentarem putativos sítios de ligação de fatores de transcrição sugere que possam desempenhar algum papel na regulação dos genes Cyps. Também foi analisada a ocorrência de polimorfismos de inserção de TEs em regiões flanqueadoras de genes da família Cyp, em diferentes linhagens geográficas resistentes e suscetíveis, de D. melanogaster e D. simulans. Análises evidenciaram a presença de polimorfismo interpopulacional de tamanho das regiões flanqueadoras dos genes Cyp6w1, Cyp6a2 e Cyp12d1, porém, não indicaram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Insecticide resistance is a model of evolutionary process where the insecticide acts as the selective agent and resistance in the insect populations evolves as an answer to selection. Cytochrome monooxygenases (CYP) is family of enzymes responsible for the insecticide resistance. It has been proposed that insertion of transposable elements (TEs) in regulatory or coding regions of the Cyp genes can alter gene expression and induce insecticide resistance. In the present study in silico analyses allowed identifying the insertion of TE fragments in 35 Cyp genes with different functions, in Drosophila melanogaster and D. simulans, as well as in 13 Cyps of six species of the melanogaster group of Drosophila. The TE insertions occurred mainly in the 5' flanking regions of Cyp genes associated to resistance and to those with a general monooxygenase function. The results did not indicate any relationship between the number of insertions and the distance in relation to the gene. The analyses showed that most of the insertions belong to the DNA transposon class, being DNAREP1_DM the most numerous. Since this element carry putative biding sites of transcription factors it can be suggested they play same role in gene regulation. The polymorphism of TE insertions in the flanking regions of Cyp6w1, Cyp6a2 and Cyp12d1, genes associated to resistance, found in resistant and as well as in susceptible geographical strains of D. melanogaster and D. simulans, does not indicate any relationship between the presence of TEs in those regions and the insecticide resistance. The results also showed that the insertions of TEs in the proximities of the Cyps associated to resistance is differential among six species of the melanogaster group, not following the genomic proportion of TEs in each species. These results also suggest that TEs inserted in the Cyp flanking regions can carry out an adaptive... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Gilson Pereira de Oliveira / Coorientador: Alvimar José da Costa / Banca: Marcos Rogério André / Banca: Cláudio Alessandro Massamitsu Sakamoto / Resumo: Ao longo das últimas décadas o controle de Rhipicephalus (Boophilus) microplus tem sido dificultado pelo desenvolvimento da resistência à maioria dos grupos químicos utilizados. Algumas moléculas tem se apresentado como alternativas promissoras, mas mesmo assim, apresentam redução de eficácia com o passar do tempo. As lactonas macrocíclicas, moléculas com atividade endectocida, surgiram como uma dessas opções, mas relatos sobre a resistência, especialmente à ivermectina, se tornam cada vez mais frequentes. O presente estudo objetivou determinar a redução de eficácia da ivermectina contra o R. (B.) microplus, e o consequente surgimento da resistência à esse princípio ativo, por meio de resultados encontrados em várias propriedades rurais, frente às diferentes cepas presentes. Foram realizados testes com bovinos naturalmente infestados da região Sudeste do Brasil, utilizando diferentes concentrações de ivermectina (200 μg/kg, 500 μg/kg e 630 μg/kg). Estes experimentos basearam-se na contagem de partenóginas, entre 4,5 e 8 mm de diâmetro, presentes no lado esquerdo dos bovinos. Das doze propriedades avaliadas, três com a utilização de ivermectina 500 μg/kg (0,5% pour-on), três onde foi testada a ivermectina 200 μg/kg (1% injetável) e seis onde avaliou-se a ivermectina 630 μg/kg (3,15% injetável), apenas uma apresentou valores de eficácia média, entre os dias 7 e 14 pós-tratamento, superior à 90%, sendo classificada como sensível. Nenhum dos demais experimentos atingiu este valor, permitindo a classificação de onze dentre as doze cepas (91,67%) avaliadas, como resistentes. Além disso, o presente estudo confirma a eficiência da avaliação in vivo para o diagnóstico da resistência, assim como reforça a necessidade de maior atenção a esse fenòmeno, amplamente disseminado nessa região do Brasil / Abstract: Throughout the last decades, the control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus has become more difficult due to the development of resistance to most of the products used for its control. Some molecules have been presented as promising alternatives, but nonetheless, their efficacy has shown reduction as time passes. The macrocyclic lactones, molecules with endectocidal activity, appeared as one of these options, but resistance to them, especially to ivermectin, are commonly reported in literature. The present study aimed to determine the decrease in acaricidal efficacy of ivermectin against Rhipicephalus (Boophilus) microplus, and the consequent development of resistance to this active component, by means of several results found in several rural properties, with different tick strains present. Tests were conducted in naturally infested animals originated from farms on the Southeast region of Brazil, using different concentrations of ivermectin (200 μg/kg, 500 μg/kg and 630 μg/kg) applied in different administration methods (pour on and injectable). From all twelve properties evaluated, being three with the administration of 500 μg/kg ivermectin (0.5% pouron), three were 200 μg/kg ivermectin (1% injectable) was tested and six were 630 μg/kg ivermectin (3.15% injectable) was evaluated, only one presented mean efficacy values, between days 7 and 14 post-treatment, superior to 90%, being classified as sensible. None of the other experiments reached or surpassed this index, allowing the classification of eleven amongst twelve (91.67%) evaluated R. (B.) microplus strains, as resistant. Besides, the present study confirms the efficiency of in vivo evaluation for the diagnosis of resistance, as well as reinforces the need for a greater attention to this problem, widely spread in this region of Brazil / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-27Bitstream added on 2014-06-13T19:12:52Z : No. of bitstreams: 1 ricci_j_me_sjrp.pdf: 1040646 bytes, checksum: cec6211f3f5843239b67ee910f199d37 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A resistência aos inseticidas é um modelo de processo evolutivo onde o inseticida atua como agente seletivo e, como resposta à seleção, ocorre a evolução da resistência nas populações de insetos. As enzimas citocromo P450 monooxigenases (CYP) formam uma família responsável pela resistência aos inseticidas. Tem sido proposto que a inserção de elementos transponíveis (TEs) em regiões reguladoras ou codificadoras dos genes da família Cyp pode alterar a expressão gênica e induzir a resistência aos inseticidas. No presente estudo foram realizadas análises in silico que permitiram identificar a ocorrência de inserções de fragmentos de TEs em 35 genes Cyps com diferentes funções, e em seus genes flanqueadores, em Drosophila melanogaster e D. simulans, além de 13 genes Cyps de seis espécies do grupo melanogaster de Drosophila. As inserções de TEs ocorreram principalmente nas regiões flanqueadoras 5´ dos Cyps associados à resistência aos inseticidas e à função monooxigenase geral. Os resultados não indicaram qualquer relação entre a distância em relação ao gene e o número de inserções. As análises mostraram que a maioria das inserções pertence à classe de transposons de DNA, sendo o transposon DNAREP1_DM o que apresentou o maior número de cópias. O fato de essas seqüências apresentarem putativos sítios de ligação de fatores de transcrição sugere que possam desempenhar algum papel na regulação dos genes Cyps. Também foi analisada a ocorrência de polimorfismos de inserção de TEs em regiões flanqueadoras de genes da família Cyp, em diferentes linhagens geográficas resistentes e suscetíveis, de D. melanogaster e D. simulans. Análises evidenciaram a presença de polimorfismo interpopulacional de tamanho das regiões flanqueadoras dos genes Cyp6w1, Cyp6a2 e Cyp12d1, porém, não indicaram... / Insecticide resistance is a model of evolutionary process where the insecticide acts as the selective agent and resistance in the insect populations evolves as an answer to selection. Cytochrome monooxygenases (CYP) is family of enzymes responsible for the insecticide resistance. It has been proposed that insertion of transposable elements (TEs) in regulatory or coding regions of the Cyp genes can alter gene expression and induce insecticide resistance. In the present study in silico analyses allowed identifying the insertion of TE fragments in 35 Cyp genes with different functions, in Drosophila melanogaster and D. simulans, as well as in 13 Cyps of six species of the melanogaster group of Drosophila. The TE insertions occurred mainly in the 5´ flanking regions of Cyp genes associated to resistance and to those with a general monooxygenase function. The results did not indicate any relationship between the number of insertions and the distance in relation to the gene. The analyses showed that most of the insertions belong to the DNA transposon class, being DNAREP1_DM the most numerous. Since this element carry putative biding sites of transcription factors it can be suggested they play same role in gene regulation. The polymorphism of TE insertions in the flanking regions of Cyp6w1, Cyp6a2 and Cyp12d1, genes associated to resistance, found in resistant and as well as in susceptible geographical strains of D. melanogaster and D. simulans, does not indicate any relationship between the presence of TEs in those regions and the insecticide resistance. The results also showed that the insertions of TEs in the proximities of the Cyps associated to resistance is differential among six species of the melanogaster group, not following the genomic proportion of TEs in each species. These results also suggest that TEs inserted in the Cyp flanking regions can carry out an adaptive... (Complete abstract click electronic access below)