<p>Chondrosarcoma is a unique type of bone cancer in that it does not respond to chemotherapy or radiation therapy, and therefore many affected patients die from metastatic disease. Metastasis has been correlated to upregulation of the matrix metalloproteinase (MMP) family of proteases, which can degrade a wide range of extracellular components. MMP2 is an enzyme secreted from the cell and degrades extracellular gelatin, as denatured collagen. ETV5 is a transcription factor which has shown to be overexpressed in multiple types of invasive tumours. The regulatory relationship between ETV5 and MMP2 has not been studied in chondrosarcoma. We hypothesized that ETV5 regulates MMP2 in human chondrosarcoma with the protease acting as a downstream effector. We have determined that both ETV5 and MMP2 are upregulated in the KC human chondrosarcoma cell line. Gene knockdown of ETV5 in KC cells resulted in a reduction in MMP2 mRNA expression as well as decreased protein production, and significantly decreased MMP2 gelatinase activity. When ETV5 is overexpressed, MMP2 expression is upregulated at the RNA and protein levels. Data from our bone resorption studies revealed that when a matrix metalloproteinase 2 inhibitor is added to the KC cell growth media, collagen released from bone chips decreased significantly. Upon histological examination, bone chips incubated with KC cells and the MMP2 inhibitor showed less bone resorption. Analyses of patient cell lines show similar expression profiles of ETV5 and MMP2 as the KC cell line. ETV5 knockdown (KD) in the patient cell lines also showed a decrease in MMP2 expression, similar to the KC cells, suggesting that the ETV5-MMP2 pathway has clinical importance. This data advocates that ETV5 has a significant role in regulating MMP2 expression and activity, and bone resorption in human chondrosarcoma, and thus may be a targetable effector of the metastatic cascade in this cancer.</p> / Master of Science (MSc)

O tratamento preconizado para dentes permanentes avulsionados devido a traumatismos dentários em crianças é o reimplante dental. Entretanto, sabe-se que o sucesso após o reimplante depende, especialmente, do tempo em que o dente permanece fora do alvéolo e do meio de conservação no qual o dente é armazenado. Nesse sentido, para que se tenha sucesso após o reimplante faz-se necessário que o dente seja imediatamente reimplantado e/ou seja mantido em um meio capaz de manter a vitalidade das células da superfície radicular. Se isso não for possível, o tratamento da superfície radicular deverá ser instituído com o objetivo de prevenir a reabsorção radicular. Dessa maneira, esta pesquisa teve como primeiro objetivo avaliar a influência de diferentes meios de conservação para dentes avulsionados, por meio de uma revisão sistemática, com a finalidade de estabelecer se há um consenso sobre o meio mais adequado para conservação capaz de prevenir sequelas como anquilose e reabsorção dentária. A seguir, o segundo objetivo desse estudo foi testar o Denosumab, um anticorpo monoclonal anti-RANKL, como substância para o tratamento tópico da superfície radicular, a fim de evitar a anquilose e a reabsorção dentária por substituição. Para tanto, foram utilizados 36 incisivos superiores direitos de ratos submetidos à extração cirúrgica, manutenção em meio extra-alveolar seco por 60 minutos e posterior reimplante. No grupo I, controle positivo, foi realizado o reimplante tardio sem tratamento de superfície; nos grupos II e III, grupos experimentais, previamente ao reimplante tardio foi realizado o tratamento da superfície radicular com solução de Denosumab a 60 mg/mL e a 30 mg/mL, respectivamente, por 10 minutos. Os canais radiculares dos animais dos três grupos foram preenchidos com pasta à base de hidróxido de cálcio, via retrógrada, e em seguida os dentes foram reimplantados. Decorridos 15 e 60 dias do reimplante, os animais foram submetidos à eutanásia e as peças, contendo dente e osso, foram removidas para o processamento histotécnico. A seguir cortes histológicos foram realizados, corados por hematoxilina e eosina (HE), para descrição das características da superfície dentária e do ligamento periodontal e para mensuração do comprimento (perímetro) da anquilose e/ou reabsorção por substituição e das áreas de reabsorção dentária, em microscopia de luz e, para mensuração da área do ligamento periodontal, em microscopia de fluorescência. Espécimes sequenciais foram analisados por meio de coloração de Brown & Brenn modificada para identificação de micro-organismos e imunohistoquímica para identificação dos marcadores RANKL, OPG e Periostina (PRT). As análises foram realizadas de forma descritiva e quantitativa. Dados quantitativos foram submetidos à analise estatística por meio do teste paramétrico ANOVA de uma via e pós-teste de Tukey e dos testes não-paramétricos de qui-quadrado e exato de Fisher, com nível de significância de 5%. Ao final da revisão sistemática da literatura pudemos concluir que não há evidência para estabelecer qual o melhor meio de conservação para dentes avulsionados. Dentre os meios que foram encontrados estão a água de coco, água da torneira, leite de soja, leite integral, solução salina, saliva, própolis, soro fisiológico, solução Euro-Collins, solução salina balanceada de Hanks (HBSS) e Viaspan®. Ainda que esta revisão tenha sido conduzida em modelo animal experimental, a baixa qualidade dos estudos bem como a sua heterogeneidade indicam que a extrapolação para humanos deva ser cautelosa. No estudo experimental em modelo animal, o tratamento de superfície com Denosumab a 60 mg/mL preveniu a anquilose, a reabsorção por substituição e a reabsorção dentária, após 60 dias, comparado com o grupo sem tratamento. A coloração de Brown & Brenn evidenciou uma menor contaminação nos tecidos mineralizados quando do tratamento de superfície com Denosumab, independente da concentração utilizada. Com relação à imunohistoquímica, o tratamento com Denosumab inibiu a síntese de RANKL sem modular OPG. A Periostina foi observada no ligamento periodontal dos dentes reimplantados. Porém, essa marcação estava ausente nas áreas de anquilose, em ambos os períodos experimentais, indicando que durante o processo de anquilose a síntese de periostina é inibida, o que resulta na fusão do osso à superfície radicular. / The treatment of choise for permanent dental avulsion is replantation. However, it is known that the success of the repair after replantation depend especially the extracellular and the storage medium in which is stored the tooth. Accordingly, in order to have success after replantation is necessary that the tooth is replanted immediately and/or to be kept in a medium capable of maintaining the cell´s vitality of the root surface. If that is not possible, treatment of the radicular surface should be done in order to prevent radicular resorption. Thus, the firstly aim was to perfom a systematic review to evaluate the in vivo effectiveness of different storage media for avulsed teeth. So, the second aim of this study is to test the substance as Denosumab, a monoclonal antibody, for the topical treatment of the root surface in order to prevent dental ankylosis and replacement resorption. For this, we used 36 rat incisors rights, extracted and replanted, and divided into: group I, positive control, delayed replantation without root surface treatment; groups II and III , experimental groups, delayed replantation without root surface treatmen with Denosumab 60 mg/mL and 30 mg/mL, respectively, for 10 minutes. The canals were filling with calcium hydroxide and the teeth were replanted. After periods of 15 and 60 days of the replantation, the animals will be euthanized. Then, samples are removed and processed for microscopic analysis. Histological sections were performed, stained with hematoxylin and eosin, to describe the characteristics of the dental surface and the periodontal ligament and to measure the length of ankylosis, replacement resorption and dental resorption by conventional microscopy, and for the measure the area of periodontal ligament, by fluorescence microscopy. Sequential specimens were analyzed by Brown & Brenn, for localization of bacteria; and markek by immunohistochemistryfor RANKL, OPG and Periostin (PRT). The analysis were displayed qualitatively or quantitatively. Data were subjected to statistical analysis by oneway ANOVA and the Tukey post-test and by chi-square and Fisher\'s exact tests. The significance level was set at 5%. The systematic review does not provide enough evidence to determine the best storage medium to achieve successful tooth replantation. This systematic review has identified many storage media that have been used to preserve avulsed teeth, including coconut water, tap water, soy milk, whole milk, saline solution, saliva, propolis, physiologic saline, Euro-Collins solution, HBSS, and Viaspan®. Although this review was conducted in an experimental animal model, a poor quality of the studies as well as their heterogeneity indicates that a human extrapolation should be cautious. In the experimental study in animal model, root surface treatment with Denosumab 60 mg/mL prevented ankylosis, replacement resorption, and tooth resorption, 60 days after replantation, compared with the untreated group. Brown & Brenn staining showed a lower contamination in the mineralized tissues in the Denosumab surface treatment group, regardless of the concentration used. As for immunohistochemistry, Denosumab inhibited the synthesis of RANKL without modulating OPG. Periostin was observed in periodontal ligament of tooth replanted. However, this labeling was absent in the ankylosis areas, in both experimental periods, indicating that during the ankylosis process, the periostin synthesis is inhibited, resulting in the fusion between bone and root surface.

O tratamento preconizado para dentes permanentes avulsionados devido a traumatismos dentários em crianças é o reimplante dental. Entretanto, sabe-se que o sucesso após o reimplante depende, especialmente, do tempo em que o dente permanece fora do alvéolo e do meio de conservação no qual o dente é armazenado. Nesse sentido, para que se tenha sucesso após o reimplante faz-se necessário que o dente seja imediatamente reimplantado e/ou seja mantido em um meio capaz de manter a vitalidade das células da superfície radicular. Se isso não for possível, o tratamento da superfície radicular deverá ser instituído com o objetivo de prevenir a reabsorção radicular. Dessa maneira, esta pesquisa teve como primeiro objetivo avaliar a influência de diferentes meios de conservação para dentes avulsionados, por meio de uma revisão sistemática, com a finalidade de estabelecer se há um consenso sobre o meio mais adequado para conservação capaz de prevenir sequelas como anquilose e reabsorção dentária. A seguir, o segundo objetivo desse estudo foi testar o Denosumab, um anticorpo monoclonal anti-RANKL, como substância para o tratamento tópico da superfície radicular, a fim de evitar a anquilose e a reabsorção dentária por substituição. Para tanto, foram utilizados 36 incisivos superiores direitos de ratos submetidos à extração cirúrgica, manutenção em meio extra-alveolar seco por 60 minutos e posterior reimplante. No grupo I, controle positivo, foi realizado o reimplante tardio sem tratamento de superfície; nos grupos II e III, grupos experimentais, previamente ao reimplante tardio foi realizado o tratamento da superfície radicular com solução de Denosumab a 60 mg/mL e a 30 mg/mL, respectivamente, por 10 minutos. Os canais radiculares dos animais dos três grupos foram preenchidos com pasta à base de hidróxido de cálcio, via retrógrada, e em seguida os dentes foram reimplantados. Decorridos 15 e 60 dias do reimplante, os animais foram submetidos à eutanásia e as peças, contendo dente e osso, foram removidas para o processamento histotécnico. A seguir cortes histológicos foram realizados, corados por hematoxilina e eosina (HE), para descrição das características da superfície dentária e do ligamento periodontal e para mensuração do comprimento (perímetro) da anquilose e/ou reabsorção por substituição e das áreas de reabsorção dentária, em microscopia de luz e, para mensuração da área do ligamento periodontal, em microscopia de fluorescência. Espécimes sequenciais foram analisados por meio de coloração de Brown & Brenn modificada para identificação de micro-organismos e imunohistoquímica para identificação dos marcadores RANKL, OPG e Periostina (PRT). As análises foram realizadas de forma descritiva e quantitativa. Dados quantitativos foram submetidos à analise estatística por meio do teste paramétrico ANOVA de uma via e pós-teste de Tukey e dos testes não-paramétricos de qui-quadrado e exato de Fisher, com nível de significância de 5%. Ao final da revisão sistemática da literatura pudemos concluir que não há evidência para estabelecer qual o melhor meio de conservação para dentes avulsionados. Dentre os meios que foram encontrados estão a água de coco, água da torneira, leite de soja, leite integral, solução salina, saliva, própolis, soro fisiológico, solução Euro-Collins, solução salina balanceada de Hanks (HBSS) e Viaspan®. Ainda que esta revisão tenha sido conduzida em modelo animal experimental, a baixa qualidade dos estudos bem como a sua heterogeneidade indicam que a extrapolação para humanos deva ser cautelosa. No estudo experimental em modelo animal, o tratamento de superfície com Denosumab a 60 mg/mL preveniu a anquilose, a reabsorção por substituição e a reabsorção dentária, após 60 dias, comparado com o grupo sem tratamento. A coloração de Brown & Brenn evidenciou uma menor contaminação nos tecidos mineralizados quando do tratamento de superfície com Denosumab, independente da concentração utilizada. Com relação à imunohistoquímica, o tratamento com Denosumab inibiu a síntese de RANKL sem modular OPG. A Periostina foi observada no ligamento periodontal dos dentes reimplantados. Porém, essa marcação estava ausente nas áreas de anquilose, em ambos os períodos experimentais, indicando que durante o processo de anquilose a síntese de periostina é inibida, o que resulta na fusão do osso à superfície radicular. / The treatment of choise for permanent dental avulsion is replantation. However, it is known that the success of the repair after replantation depend especially the extracellular and the storage medium in which is stored the tooth. Accordingly, in order to have success after replantation is necessary that the tooth is replanted immediately and/or to be kept in a medium capable of maintaining the cell´s vitality of the root surface. If that is not possible, treatment of the radicular surface should be done in order to prevent radicular resorption. Thus, the firstly aim was to perfom a systematic review to evaluate the in vivo effectiveness of different storage media for avulsed teeth. So, the second aim of this study is to test the substance as Denosumab, a monoclonal antibody, for the topical treatment of the root surface in order to prevent dental ankylosis and replacement resorption. For this, we used 36 rat incisors rights, extracted and replanted, and divided into: group I, positive control, delayed replantation without root surface treatment; groups II and III , experimental groups, delayed replantation without root surface treatmen with Denosumab 60 mg/mL and 30 mg/mL, respectively, for 10 minutes. The canals were filling with calcium hydroxide and the teeth were replanted. After periods of 15 and 60 days of the replantation, the animals will be euthanized. Then, samples are removed and processed for microscopic analysis. Histological sections were performed, stained with hematoxylin and eosin, to describe the characteristics of the dental surface and the periodontal ligament and to measure the length of ankylosis, replacement resorption and dental resorption by conventional microscopy, and for the measure the area of periodontal ligament, by fluorescence microscopy. Sequential specimens were analyzed by Brown & Brenn, for localization of bacteria; and markek by immunohistochemistryfor RANKL, OPG and Periostin (PRT). The analysis were displayed qualitatively or quantitatively. Data were subjected to statistical analysis by oneway ANOVA and the Tukey post-test and by chi-square and Fisher\'s exact tests. The significance level was set at 5%. The systematic review does not provide enough evidence to determine the best storage medium to achieve successful tooth replantation. This systematic review has identified many storage media that have been used to preserve avulsed teeth, including coconut water, tap water, soy milk, whole milk, saline solution, saliva, propolis, physiologic saline, Euro-Collins solution, HBSS, and Viaspan®. Although this review was conducted in an experimental animal model, a poor quality of the studies as well as their heterogeneity indicates that a human extrapolation should be cautious. In the experimental study in animal model, root surface treatment with Denosumab 60 mg/mL prevented ankylosis, replacement resorption, and tooth resorption, 60 days after replantation, compared with the untreated group. Brown & Brenn staining showed a lower contamination in the mineralized tissues in the Denosumab surface treatment group, regardless of the concentration used. As for immunohistochemistry, Denosumab inhibited the synthesis of RANKL without modulating OPG. Periostin was observed in periodontal ligament of tooth replanted. However, this labeling was absent in the ankylosis areas, in both experimental periods, indicating that during the ankylosis process, the periostin synthesis is inhibited, resulting in the fusion between bone and root surface.

Vitales Knochengewebe ist ständigen Umbauprozessen unterworfen. Entsteht ein Defekt, wird der Knochen durch neugeformte Strukturen repariert. In diesen Prozess sind verschiedene Zelltypen involviert, darunter Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten (Teitelbaum, 2000a; Ross und Christiano, 2006; Zhang et al., 2012). In der Wiederherstellungs-Chirurgie ist Knochenersatz von großer Bedeutung, wenn schwere skelettale Schäden auftreten (Onoda et al., 2011). Auto- als auch Allotransplantationen von Knochengeweben sind aufgrund der guten osteoinduktiven und biochemischen Eigenschaften noch immer der Goldstandard (Parikh, 2002; Sen und Miclau, 2007; Zhang et al., 2012). Aufgrund der Knappheit der zur Verfügung stehenden muskuloskelettalen Spendermaterialien und der zugleich steigenden Anzahl von notwendigen Knochenmaterialtransplantationen wird vermehrt nach Materialersatz gesucht. Der ideale Knochentransplantatersatz ist biokompatibel, bioresorbierbar, dirigiert die Richtung der Knochenneubildung (osteokonduktiv), regt die Knochenneubildung an (osteoinduktiv), ist strukturell knochenähnlich, einfach anzuwenden und kosteneffektiv (Greenwald et al., 2001; Parikh, 2002; Chim und Schantz, 2005; Zhang et al., 2012). Tissue Engineering ist ein interdisziplinäres Gebiet der Wissenschaft, welches die Prinzipien des Ingenieurwesens und der Biowissenschaften auf die Entwicklung biologischer Ersatzmaterialien anwendet, die für die Wiederherstellung, Erhaltung oder Verbesserung von Gewebe- oder Organfunktionen eingesetzt werden (Langer, 1993; Nerem und Sambanis, 1995). Langfristig sollen für die Implantation geeignete Systeme entwickelt oder in vivo Geweberemodelling ermöglicht werden. Hauptkomponente des Tissue Engineering ist der Einsatz lebender Zellen und/oder extrazellulärer Matrixbestandteile in der Entwicklung solcher Systeme und Konstrukte, die implantiert zur Wiederherstellung oder zum Ersatz der biologischen Funktionen führen. Um das biologische Verhalten der Konstrukte kontrollieren zu können, erfordert die Entwicklung das Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehung von Zellen, Geweben und Organen. Die extrazelluläre Matrix der biologischen Systeme ist ebenfalls von großer Bedeutung, da sie ihre mechanischen Eigenschaften bestimmt. Chemische und strukturelle Stabilität sind weitere notwendige Eigenschaften, um das Überleben der Zellen nach der Implantation in der in vivo Umgebung zu gewährleisten (Nerem und Sambanis, 1995). Denkansätze im Tissue Engineering beinhalten die Nutzung von Scaffolds, Zellen und deren Kombination. Häufigster Ansatz ist der Einsatz resorbierbarer oder biologisch abbaubarer Scaffolds, die an die Umgebung des lebenden Gewebes angepasst sind und mit lebenden Zellen besiedelt werden können. Die Zellen proliferieren und organisieren sich in der dreidimensionalen Struktur des Scaffolds und beginnen mit der Produktion adäquater extrazellulärer Matrix. Während der Formierung, Ablagerung und Organisation der neu generierten Matrix wird die Startmatrix des Scaffolds abgebaut, resorbiert und metabolisiert (Nerem und Sambanis, 1995; Stock und Vacanti, 2001). Die Zellen differenzieren sich auf dem Scaffold zu den gewünschten Organ- beziehungsweise Gewebezellen bevor die in vitro besiedelten Matrizen implantiert werden. Am Ende des Prozesses ist ein lebendes Gewebe oder Organ entstanden, welches die Funktion des Gewebes / Organs im Körper erhält, wieder herstellt oder verbessert. Das Risiko immunologischer Abwehrreaktionen, ebenso wie das Risiko viraler Infektionen wird beim Tissue Engineering durch den Einsatz autologer Spenderzellen umgangen. Die eingesetzten Scaffolds müssen zudem biokompatibel sein und den nutritiven als auch biologischen Ansprüchen der spezifischen Zellpopulation gerecht werden, die in der Gewebeformation involviert ist (Stock und Vacanti, 2001). Ein weiterer Ansatz ist es, Zellen von biologischer Matrix enzymatisch oder durch Detergenzien zu entfernen und diese dezellularisierte Matrix anschließend zu verwenden. Es handelt sich dabei um allogenes oder xenogenes Gewebe. Diese Matrix ist dann theoretisch biologisch abbaubar beziehungsweise resorbierbar und müsste sich gut für die Besiedlung mit Zellen eignen. Alternativ werden artifizielle Matrizen im Tissue Engineering eingesetzt (Stock und Vacanti, 2001; Heinemann et al., 2011). In Abbildung 1.1 ist das Prinzip des Tissue Engineering dargestellt (Drosse et al., 2008). Bei der Therapie von Knochendefekten in lasttragenden Regionen werden häufig nichtresorbierbare Materialien wie Metalle und Keramiken eingesetzt (Navarro et al., 2008). Der Einsatz von resorbierbaren Materialien ist erstrebenswert, da sich diese nach der Transplantation in den Prozess des Knochenremodellings integrieren und somit mit der Zeit durch körpereigenes Material ersetzt werden (Hutmacher, 2000; Boccaccini und Maquet, 2003; Navarro et al., 2008). Damit erlangt der Knochen langsam seine natürlichen biomechanischen Eigenschaften zurück (Baron, 1995; Teitelbaum, 2000b). Wichtig ist jedoch, dass die Resorption und der Ersatz durch körpereigenes Knochenmaterial ausgewogen stattfinden, sodass die mechanische Stabilität des Gewebes gewährleistet ist. Daher sind Untersuchungen zur Resorption von Biomaterialien von großer Bedeutung, bevor diese in der Klinik in vivo zum Einsatz kommen (Zhang et al., 2012). Osteoklasten sind für die Resorption von Knochen verantwortliche Zellen, weshalb sie in Zellexperimenten zur Untersuchung von Resorption eingesetzt werden. Typische Untersuchungsmethoden zum Nachweis von osteoklastärer Aktivität sind die Feststellung von Vielkernigkeit, die genanalytische Bestimmung von tartratresistenter saurer Phosphatase 5b (TRAP 5b) (Minkin, 1982; Ek-Rylander et al., 1991; Ljusberg et al., 2005; Detsch et al., 2010b), Carboanhydrase II (CAII) (Lehenkari et al., 1998; Detsch et al., 2010b; Schilling et al., 2004), Kathepsin K (Bossard et al., 1996; Littlewood-Evans et al., 1997; Votta et al., 1997; Söderström et al., 1999; Dodds et al., 2001; Ljusberg et al., 2005), des Kalzitoninrezeptors und des Vitronektinrezeptors (Detsch und Boccaccini, 2014; Blair, 1998; Schilling et al., 2004). Die enzymatische Messung von TRAP 5b (Halleen et al., 2000; Janckila et al., 2001) und CAII (Detsch et al., 2010a) und die Bestimmung der Kalziumkonzentration im Überstand der Zellkulturen (Neutzsky-Wulff et al., 2010; Reichert et al., 2013) sind weitere Marker, die zur Beschreibung osteoklastärer Zelldifferenzierung genannt wurden. Zudem können Kollagenspaltprodukte im Zellkulturüberstand nachgewiesen werden (Karsdal et al., 2003; Neutzsky-Wulff et al., 2010). Eine weitere große Rolle bei Resorptionsuntersuchungen an Biomaterialien spielt die Analyse von Resorptionspits. Allerdings gibt es hierbei einige Nachteile. Die mikroskopische Beurteilung der Resorptionslakunen ist sehr zeitaufwändig und kostenintensiv. Zudem ist eine sehr geringe Rauigkeit des eingesetzten Materials nötig, um die Resorption mikroskopisch anhand von Resorptionslakunen zu quantifizieren, da die Messmethoden die resorbierte Fläche und das resorbierte Volumen relativ zur originalen Oberflächenbeschaffenheit ermitteln. Ideal ist hierbei eine Rauigkeit von unter 1 m (Zhang et al., 2012) damit zwischen bereits vorher existierenden strukturellen Unebenheiten und neu entstandenen Pits unterschieden werden kann. Zudem können bisher bekannte Resorptionsassays nur die Resorption auf glatten Knochenstrukturen imitieren. Im Körper machen hingegen der trabekuläre oder spongiöse Knochen den größten Anteil aus, allerdings sind solche Strukturen in vitro schwer zu imitieren und Resorptionsstudien dazu sind noch nicht sehr zuverlässig (Zhang et al., 2012). Auf unregelmäßigen oder porösen Materialien können bisher noch keine quantifizierenden Aussagen über die Resorption gemacht werden. Die Motivation dieser Arbeit war es, biochemische Verfahren für die Quantifizierung von osteoklastärer Resorption zu entwickeln. Während die biochemischen Messungen der Aktivitäten von TRAP 5b und CAII bereits als osteoklastäre Marker eingesetzt werden, sollte hier erstmals die enzymatische Aktivität von Kathepsin K biochemisch bestimmt werden. Dazu wurden Osteoklasten auf verschiedenen Materialien kultiviert und untersucht. Durch biochemische Analyse sollten dann Rückschlüsse auf die Resorptionsaktivität der Zellen gezogen werden. Das Fernziel dieser Arbeit ist, das Resorptionsverhalten von Osteoklasten auf Biomaterialien zu quantifizieren, sodass die zeit- und kostenintensive mikroskopische Beurteilung ersetzt werden kann. Ein Schritt auf dem Weg zu diesem Ziel ist es, die Osteoklastogenese auf den Modellsubstraten genauer zu untersuchen und herauszufinden, wie die in vitro Resorption auf den verschiedenen Substraten beeinflusst werden kann. Die gemessenen Enzymaktivitäten sollten schließlich mit der Resorptionsaktivität der Osteoklasten in Korrelation gebracht werden.

MicroRNAs (miRNAs) are short, non-coding RNAs involved in the regulation of several processes associated with inflammatory diseases and infection. Bacterial infection modulates miRNA expression to subvert innate immune response. In this study, we analyzed bacterial modulation of miRNAs in bone-marrow-derived macrophages (BMMs), in which activity was induced by infection with Porphyromonas gingivalis (Pg) through a microarray analysis. Several miRNA expressions levels were modulated 3 hours post infection (at a multiplicity of infection (MOI) of 25). A bioinformatics analysis was performed to further identify pathways related to the innate immune host-response pathways that are under the influence of the selected miRNAs. To assess the effects of the identified miRNAs on cytokines secretion (pro inflammatory TNF-α and anti-inflammatory IL-10), BMMs were transfected with selected miRNAs mimics or inhibitors. Transfection with mmu-miR-155 and mmu-miR- 2137 did not modify TNF-α secretion while their inhibitors increased it. Inhibitors of mmumiR-2137 and mmu-miR-7674 increased the secretion of the anti-inflammatory IL-10. In Pginfected BMMs, mmu-miR-155-5p significantly decreased TNF-α secretion while inhibitor of mmu-miR-2137 increased IL-10 secretion. In vivo, in a Pg-induced calvarial bone resorption mouse model, injection of mmu-miR-155-5p or anti-mmu-miR-2137 reduced the size of the lesion significantly. Furthermore, anti-mmu-miR-2137 significantly reduced inflammatorycell infiltration, osteoclast activity and bone loss. Bioinformatics analysis demonstrated that pathways related to cytokines and chemokines related pathways but also osteoclast differentiation may be involved in the observed effects. The study highlights the potential therapeutic merits of targeting mmu-miR-155-5p and mmu-miR-2137 to control inflammation induced by Pg infection. To assess the regenerative process in the same animal model, we aimed to compare the effect of Bone Morphogenic Protien 2 (BMP2), Platelets Rich Plasma (PRP), Leukocyte-Platelets Rich Fibrin (L-PRF), and Polygucosamine (PGIcNAc) on bone formation in critical size bone defects in mice. One-hundred-thirty-eight mice were divided into 23 groups (n=6), negative control, different combinations of the PGIcNAc with or without of BMP2, Collagen Sponge (SurgiFoam), PRP, and L-PRF. The 5mm defect, then, was allowed to heal. After six weeks, samples were analyzed for bone formation utilizing radiographs, H&E staining, alkaline phosphatase staining. Our results show that BMP2 were able to produce 90-95% healing of critical size defects after six weeks histologically and radiographically. However, SurgiFoam, PRP and L-PRF with or without PGIcNAc were able to close 60% of the original defect. This study supports that BMP2 is more effective for bone regeneration than SurgiFoam, PRP, L-PRF and PGIcNAc.

Esta pesquisa teve por objetivo avaliar a reabsorção radicular externa em dentes tratados endodonticamente após tratamento ortodôntico, por meio de análise das imagens das radiografias panorâmica final digitalizada, convencional periapical digitalizada e digital direta, como também comparar os métodos radiográficos empregados. Foram selecionados, após uma avaliação de 2.130 documentações ortodônticas 20 dentes de pacientes com documentação ortodôntica completa, boas condições de saúde, faixa etária entre 25 a 50 anos de ambos os sexos e com dentes anteriores (incisivo central ou lateral) tratados endodonticamente antes da realização do tratamento ortodôntico. De cada documentação ortodôntica completa foi selecionada a radiografia panorâmica inicial e final e, posteriormente, foram obtidas duas radiografias periapicais atuais de cada dente, uma pela técnica convencional e outra digital direta. Após a obtenção e identificação das radiografias, as imagens da panorâmica final digitalizada, radiografia periapical convencional digitalizada e digital direta foram analisadas na tela do computador por três especialistas (endodontista, ortodontista e radiologista). Estes avaliaram se a reabsorção radicular externa estava presente ou ausente no dente tratado endodonticamente após tratamento ortodôntico, bem como compararam os métodos empregados verificando sua confiabilidade. Os seguintes parâmetros foram observados: a) lesão periapical, b) espaço pericementário e c) limite do tratamento endodôntico. As observações foram submetidas à análise estatística chegando-se às seguintes conclusões: 1) A maioria dos ortodontistas não utiliza radiografias periapicais para avaliar os dentes tratados endodonticamente antes do tratamento ortodôntico, o que pode comprometer o andamento e o resultado final do tratamento, visto que a reabsorção radicular não apresenta um caráter sintomatológico no seu diagnóstico; 2) Quanto à reabsorção radicular externa, os examinadores apontaram que houve um incremento desta, na maioria do tipo suave e localizada na região apical, e que a radiografia digital direta foi o método radiográfico mais eficiente na determinação deste diagnóstico. / In this research, the assessment of the external root resorption was carried out in endodontically treated teeth after orthodontic treatment, through the analysis of the image of the digital panoramic radiography, the digital periapical conventional and direct digital; as well as the employed methods were comparatively appraised. It was selected, after an evaluation of 2,130 orthodontic records from two centres of orthodontic studies, 20 teeth of patients with complete orthodontic records, good health conditions, age group between 25 and 50 years-old of both sexes and with front teeth (central or lateral incisor) endodontically treated before the accomplishment of the orthodontic treatment. An initial and final panoramic radiography were selected from each orthodontic record, and, later two current radiographies were obtained from each patient, one by conventional technique and the other by direct digital. After the obtaining and identification of the radiographies, the images of the digital panoramic of the digital conventional and of the direct digital were analyzed on the computer screen by three experts (an endodontist, an orthodontist and a radiologist) who evaluated whether the external root resorption was present or absent in the endodontically treated tooth after the orthodontic treatment and comparatively assessed the employed methods, verifying their reliability; they also observed the following parameters: a) periapical lesion, b) pericemental space, and c) limits of the endodontical treatment. The observations were submitted to a statistical analysis, reaching the following conclusions: 1) most of the orthodontists don\'t use periapical radiographies to evaluate endodontically treated teeth. Before the orthodontic treatment, what can compromise its course and its final results, once the root resorption doesn\'t present a symptomatology in its diagnosis; 2) as for the external root resorption, examiners claimed that there was an increment in it, most in the soft type and located in the apical area, and that the evaluation of the effectiveness of the resorption diagnosis, as well as of the other appraised parameters, indicated that the direct digital radiography obtained better outcomes regarding its identification and its classification.

Objetivou-se realizar um estudo retrospectivo sobre a frequência de cães acometidos pela reabsorção dentária (RD) atendidos no Laboratório de Odontologia Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, no período de 2006 a 2017, correlacionando com características como raça, idade, sexo, doenças orais concomitantes, hábito alimentar, comportamento mastigatório, histórico dental e sinais clínicos relacionados a dor, bem como, relatar estatisticamente os grupos dentários frequentemente acometidos, porções dentárias mais afetadas, aspectos radiográficos e extensão da reabsorção de acordo com a classificação determinada pelo American Veterinary Dental College (AVDC). Os dados avaliados procederam de 2.364 prontuários contendo fichas de consulta e de tratamento, além da análise de 1.122 registros radiográficos. Constatou-se que a prevalência geral da RD em cães foi de 8,7% e o ano mais frequente foi 2016 com 21,2%. Os pré-molares mandibulares e os maxilares foram significativamente mais afetados (37,3% e 38,1% respectivamente) e a porção radicular apresentou-se mais acometida (60,5%). As lesões do tipo 1 foram significativamente mais frequentes (53,2%) que as lesões do tipo 2 (27,9%) e tipo 3 (8,1%). Não houve lesões classificadas no estágio 1. Os estágios da reabsorção dentária mais frequentes foram o RD3 com 34,3% e o RD2 com 29,5%. Os estágios 4a, 4b e 4c representaram respectivamente 3,3%, 1,8% e 12,8%. No estágio 5, detectou-se apenas fragmentos de raiz em estágio avançado da reabsorção (2,3%). A reabsorção dentária foi associada estatisticamente com os cães de idades avançadas (10 e 13 anos com 14,6% cada). Não houve diferença significativa entre a frequência de machos e fêmeas, mas, a frequência de cães castrados (42,3%) foi significativamente menor do que a de não castrados (57,7%). A doença periodontal mostrou-se significativamente associada à reabsorção dentária (84,0%), seguida das fraturas dentárias (20,9%). Os cães acometidos pela RD alimentavam-se somente de ração (90,5%), premium ou super premium (86,6%). A maioria dos cães apresentaram-se assintomáticos no pré-operatório (82,0%) e sem alteração do comportamento no pós-operatório (39,3%). O tratamento de escolha para 66,5% dos casos foi a extração dentária. Concluiu-se que: a reabsorção inflamatória externa ou reabsorção do tipo 1, mostrou-se mais frequente quando comparada com a reabsorção de substituição externa (tipo 2). Sugere-se que boa parte da reabsorção dentária dos cães avaliados nesse estudo, esteja diretamente relacionada com processos inflamatórios desencadeados pela doença periodontal, uma vez que, evidenciou-se correlação estatística significativa entre a reabsorção dentária e a doença periodontal. / The objective of this study was to conduct a retrospective study on the frequency of dogs affected by tooth resorption attended at the Laboratory of Comparative Dentistry of the Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science of the University of São Paulo from 2016 to 2017, correlating with characteristics such as race, age, sex, concomitant oral diseases, eating habits, masticatory behavior, dental history and clinical signs related to pain, as well as, statistically reporting the frequently affected dental groups, most affected dental portions, radiographic aspects and extent of resorption according to the classification determined by the American Veterinary Dental College (AVDC). The data evaluated came from 2,364 medical records containing records of consultation and treatment, in addition to the analysis of 1,122 radiographic records. It was found that the overall prevalence of tooth resorption in dogs was 8.7% and the most frequent year was 2016 with 21.2%. The mandibular and maxillary premolars were significantly more affected (37.3% and 38.1%, respectively) as well as the root portion (60.5%). Type 1 lesions were significantly more frequent (53.2%) than type 2 (27.9%) and type 3 (8.1%) lesions. There were no lesions classified in stage 1. The most frequent stages of tooth resorption were E3 with 34.3% and E2 with 29.5%. Stages 4a, 4b and 4c represented 3.3%, 1.8% and 12.8%, respectively. In stage 5, only root fragments were detected at an advanced stage of reabsorption (2.3%). Dental resorption was statistically associated with dogs at advanced ages (10 and 13 years old with 14.6% each). There was no significant difference between the frequency of males and females, but the frequency of castrated dogs (42.3%) was significantly lower than that of non-castrated dogs (57.7%). Periodontal disease was significantly associated with tooth resorption (84.0%), followed by dental fractures (20.9%). The dogs affected by tooth resorption were only fed commercial food (90.5%), premium or super premium (86.6%). Most of the dogs were asymptomatic in the preoperative period (82.0%) and no change in postoperative behavior (39.3%). The treatment of choice for 66.5% of the cases was dental extraction. It was concluded that: The external inflammatory resorption or type 1, was more frequent when compared to external replacement resorption (type 2). It is suggested that a good part of the dental resorption of the dogs evaluated in this study is directly related to inflammatory processes triggered by periodontal disease, since a significant statistical correlation between dental resorption and periodontal disease was evidenced.

Este trabalho avaliou o comportamento eletroquímico de três ligas de níquel-cromo e duas de cobalto-cromo in vitro e in vivo. Nos estudos in vitro foram fabricados eletrodos de trabalho a partir destas ligas. Estes eletrodos ficaram imersos em meio de NaCl 0,15 mol.L-1 a 36,5°C e foram submetidos às técnicas do potencial de circuito aberto, polarização potenciostática anódica e cronoamperometria. Para os estudos in vivo foram selecionados quinze pacientes com implantes já osseointegrados e aguardando a instalação das próteses. Esses pacientes foram distribuídos aleatoriamente em cinco grupos, correspondentes às cinco ligas diferentes. Deste modo, as estruturas protéticas dos implantes foram fundidas utilizando as cinco ligas. Foi utilizada a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a espectroscopia por dispersão de energia (EDS) como métodos de análise das superfícies linguais metálicas das próteses, antes da instalação em ambiente oral e após seis meses de permanência. Vistas por MEV, as ligas duas de cobalto-cromo Starloy C e Remanium 2001 e duas de níquel-cromo Wiron 99 e Remanium CSe apresentaram superfícies heterogêneas caracterizadas por uma fase semelhante à matriz da liga e a outra fase, composta por elementos de maior densidade atômica, correspondente à fase interdendrítica. Após seis meses, não houve sinais de corrosão e alterações significativas na composição destas ligas. As ligas de Co-Cr avaliadas, sob o ponto de vista eletroquímico, indicam comportamento catódico quando unidas ao implante sendo um fator indicativo de proteção à corrosão. Dentro dos limites dos estudos in vitro, as ligas de Ni-Cr apresentaram um filme passivo com ampla faixa de potencial em que se mantêm passiva e ausência de corrosão localizada. A liga de níquel-cromo Dan Ceramalloy apresentou a superfície heterogênea com quatro áreas distintas (área 1 rica em titânio; área 2 rica em níquel; área 3 correspondente à matriz; área 4 rica em molibdênio). Após seis meses, as três próteses metalo-cerâmicas apresentaram as regiões correspondentes à fase 2, rica em níquel, com depressões em baixo relevo, sugerindo a oxidação com a liberação de íons níquel. Nos estudos in vitro a liga Dan Ceramalloy apresenta potencial de corrosão mais negativo, uma faixa passiva de potencial mais estreita e um filme menos protetor, quando comparada com as demais ligas estudadas. Apesar de não ter sido observado clinicamente o processo de corrosão das ligas, os estudos in vitro e in vivo deste material, permitiram verificar o seu comportamento eletroquímico e sugerir a descontinuidade do seu emprego em estruturas protéticas de implantes orais. Os estudos in vitro e in vivo apresentaram concordância para todos os materiais estudados. / In this study, the electro-chemical behavior of three nickel-chrome and two cobalt chrome alloys was studied in vitro and in vivo. In the in vitro studies, working electrodes made of these alloys were fabricated. These electrodes were immersed in a medium of NaCl 0.15 mol.L-1 at 36.5°C and were submitted to the open circuit potential, anodic potentiostatic polarization and chronoamperometry techniques. For the in vivo studies, 15 patients whose implants had osseointegrated, and who were waiting for dental implant placement, were selected. These patients were randomly distributed into five groups, corresponding to the five different alloys. Thus the prosthetic implant superstructures were cast, using the five alloys. Scanning electron microscopy (SEM) and energy dispersive spectroscopy (EDS) were used as methods to analyze the metal lingual surfaces of the prostheses, before they were placed in the oral environment, and after six months in place. Visualized by SEM, the two cobalt-chrome alloys Starloy C and Remanium 2001, and two types of nickel-chrome - Wiron 99 and Remanium Cse - presented heterogeneous surfaces characterized by a phase similar to that of the alloy matrix, and the other phase composed of elements of greater atomic density, corresponding to the interdendritic phase. After six months, there were no signs of corrosion and significant alterations in the composition of these alloys. The Co-Cr alloys evaluated, from an electrochemical point of view, indicated a cathodic behavior when united to the implant, this being a factor indicative of protection against corrosion. Within the limits of the in vitro studies, the Ni-Cr alloys presented a passive film with an ample range of potential in which they remained passive, with absence of corrosion due to pitting. The nickel-chrome alloy Dan Ceramalloy presented a heterogeneous surface with four distinct areas (Area 1 rich in titanium; Area 2 rich in nickel; Area 3 corresponding to the matrix; Area 4 rich in molybdenum). After six months, the three metal-ceramic dental prostheses presented the regions corresponding to Phase 2, rich in nickel, with depressions in low relief, suggesting oxidation with nickel ion release. In the in vitro studies, the alloy Dan Ceramalloy presented a more negative corrosion potential, a narrower range of passive potential and a less protective film, when compared with the other alloys studied. In despite of the process of corrosion of the alloys not having been clinically observed, the in vitro and in vivo studies of this material allowed verification of its electrochemical behavior, and suggest that its use in prosthetic superstructures for oral implants should be discontinued. The in vitro and in vivo studies were shown to be in agreement for all the materials studied.

A erupção dentária depende de uma coordenada interação entre o germe dentário e o tecido ósseo da cripta que o envolve. Para que seja formada a via eruptiva, a reabsorção da porção oclusal da cripta óssea por osteoclastos é indispensável. Os bisfosfonatos são drogas com reconhecida capacidade de inibir a atividade clástica e foram empregados no presente estudo a fim de interferir no tecido ósseo da cripta alveolar durante a formação e erupção de molares de ratos. Doses diárias dos bisfosfonatos alendronato ou etidronato de 2,5 e 8 mg/kg, respectivamente, foram administradas a ratos recém nascidos. Os controles foram injetados com solução salina. Nos períodos de 4, 8, 14, 21 e 28 dias, as maxilas foram fixadas em 2,5% de formaldeído + 2% de glutaraldeído, 4% de formaldeído + 0,1% de glutaraldeído ou fixador Zamboni, descalcificadas em EDTA a 4,13% e processadas para análise em microscopias de luz, eletrônica de transmissão e confocal, histoquímica TRAP, imunocitoquímica para OPN, BSP, RANK, RANKL e OPG. Alguns espécimes não foram descalcificados para análise em microscopia eletrônica de varredura, ou congelados em nitrogênio líquido para extração e análise e da expressão de proteínas por Western Blotting. O etidronato ocasionou alterações no metabolismo ósseo da cripta que resultaram no atraso da erupção e da formação radicular em relação ao controle. O alendronato aumentou o número de osteoclastos no osso alveolar, porém a maioria apresentou estado latente, o que diminuiu a reabsorção óssea da cripta ao redor do germe dentário e impediu a erupção dos molares e a formação radicular. A expressão de RANKL, molécula ativadora dos osteoclastos, durante o início do processo eruptivo, diminuiu em comparação ao controle. Com a diminuição da remodelação óssea, o tecido apresentou distribuição de OPN e BSP típica de osso primário. Os resultados demonstram que a reabsorção óssea é importante em todos os pontos da cripta e não apenas em sua porção oclusal durante a formação da via eruptiva, para que a formação e erupção dentária ocorram adequadamente. / Tooth eruption depends on coordinated interactions between the tooth germ and the surrounding bony crypt. The formation of the eruptive pathway requires the resorption of the occlusal portion of the bony crypt by osteoclasts. The bisphosphonates are drugs with known capability to inhibit clastic activity, and were employed in the present study with the aim of interfering in the alveolar bony crypt during the formation and eruption of rat molars. Daily alendronate or etidronate 2.5 and 8 mg/kg doses, respectively, were administered to newborn rats. The controls were injected with saline solution. At 4, 8, 14, 21 and 28 days, the maxillae were fixed in 2.5% formaldehyde + 2% glutaraldehyde, 4% formaldehyde + 0,1% glutaraldehyde or Zambonis fixative, decalcified in 4.13% EDTA and processed for light, confocal and transmission electron microscopy analyzes, TRAP histochemistry, and immunocytochemistry for OPN, BSP, RANK, RANKL and OPG. Some specimens were left undecalcified for scanning electron microscopy analyzes, or frozen in liquid nitrogen for protein extraction and Western Blotting protein expression analyzes. Etidronate occasioned alterations in the alveolar bony crypt metabolism that resulted in the delay of tooth eruption. Alendronate increased osteoclast number in the alveolar bone; however, most of them were latent, which decreased the resorption of the bony crypt surrounding the tooth germ and impeded the eruption and root formation of the molars. The expression of RANKL, an osteoclast-activating molecule, was decreased. The inhibition of the bone remodeling resulted in typical primary bone OPN and BSP labeling pattern. These results demonstrate that bone resorption at the entire surface of the crypt, and not only during the eruptive pathway formation, is crucial for adequate tooth eruption and formation.

Objetivo: Avaliar radiograficamente a prevalência, extensão e severidade das reabsorções radiculares nos dentes adjacentes à área da fissura após enxerto ósseo alveolar secundário. Material e Métodos: Foram utilizadas 1458 radiografias (periapicais, oclusais e panorâmicas) de 200 indivíduos com fissura transforame incisivo (uni e bilateral) submetidos à cirurgia de enxerto ósseo, obtidas do acervo do setor de Radiologia do Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais da Universidade de São Paulo. Resultados: Dos 200 indivíduos avaliados, 33 indivíduos apresentaram reabsorções radiculares externas em algum dente. No total foram observadas 33 reabsorções, 15 estavam presentes nas radiografias pré-enxerto ósseo e 18 somente após o enxerto ósseo. Do total das reabsorções observadas, 30 foram localizadas no terço apical da raiz e 3 no terço cervical, sendo o incisivo central esquerdo o dente mais afetado. Não foram encontradas reabsorções radiculares no terço médio da raiz e nenhuma das reabsorções atingiram más de um terço radicular. Não houve diferença estatisticamente significante entre a idade de realização do enxerto ósseo alveolar e a presença de reabsorção radicular externa; e também em relação ao tratamento ortodôntico. Conclusões: A prevalência de reabsorções radiculares nos dentes adjacentes à área da fissura de pacientes submetidos a enxerto ósseo foi baixa (16,5%). Não foi possível estabelecer uma relação entre a observação de reabsorção radicular de indivíduos submetidos a enxerto ósseo e a presença de tratamento ortodôntico em uma mesma imagem. O terço apical da raiz dos dentes observados foi a localização mais frequente de reabsorções radiculares externas, sendo que nenhuma das reabsorções abarcou mais de um terço da raiz. / Objective: To evaluate radiographically the prevalence, extent and severity of root resorption in teeth adjacent to cleft area after secondary alveolar bone graft. Material and methods: We analyzed 1458 radiographs (periapical, occlusal and panoramic) of 200 patients with complete cleft lip and palate (uni and bilateral) underwent bone graft surgery, obteined from of Radiology department files of the Hospital for Rehabilitation of Craniofacial Anomalies, University of São Paulo. Results: Of 200 patients, 33 individuals had external root resorption of a tooth. In total 33 resorptions were observed, 15 were present on preoperative bone graft radiographs, and 18 only after the bone graft. Of the total of resorption observed, 30 were localed in the apical third of the root and 3 into the cervical third; left central incisor was the most affected tooth. There were no root resorption in the middle third of the root and none of the resorption reached nore than one third. There was no statistically significant difference between the age of the alveolar bone graft surgery and the presence of external root resorption, and also in relation to orthodontic treatment. Conclusions: The prevalence of the root resorption in teeth adjacent to the cleft area in patients who underwent bone graft was low (16,5%). Unable to establish a relationship between the observation of root resorption in patients undergoing bone grafting and orthodontic treatment presence in the same image. The apical third of the root of the teeth observed was the most common location of external root resorption, and none of resorption spanned more than one third of the root.