A interacao planta-patogeno desencadeia uma serie de sinais que ainda nao estao completamente elucidados. Uma das respostas e a reacao de hipersensibilidade (RH), onde ocorre a morte celular programada no sitio da infeccao, impedindo a proliferacao do patogeno. Acredita que a morte celular e provocada pelo aumento do ERO, principalmente peroxido de hidrogenio (H2O2) e com o acumulo de acido salicilico (AS) que inibe a catalase, enzima responsavel pela transformacao de H2O2 em H2O e O2. Alem disso, ocorre o aumento da sintese e liberacao dos compostos fenolicos e alteracao da parede celular dos vegetais, com o aumento das atividades de diversas enzimas, capazes de degradar a parede celular da planta e do microrganismo invasor, liberando fragmentos que podem atuar como moleculas sinalizadoras, tornando as plantas mais resistentes. Nesse trabalho as celulas de Rubus fruticosus (amora-preta) foram tratadas, separadamente, com tres diferentes moleculas elicitoras, ou seja, moleculas capazes de ativar o mecanismo de defesa das plantas, o acido salicilico (AS), o metil jasmonato (MeJA) e ramnoglucuronogalactana (F-I), na concentracao de 1 Êmol/L durante 1h, para o estudo dos componentes extracelulares liberados e das modificacoes dos monossacarideos da parede celular durante resposta de hipersensibilidade. A concentracao de proteinas totais extracelulares foi aumentada com os indutores F-I e MeJA. A atividade enzimatica de -D-xilosidase nao se alterou na presenca de F-I, AS e MeJA. Entretanto, o MeJA tem a capacidade de aumentar as atividades das enzimas -D-galactosidase, -Dglucosidase, quitinase e laminarinase e inibir as atividades das enzimas galacturonase e -Lfucosidase na concentracao e tempo usado. O AS e F-I provocaram um aumento nas atividades de galacturonase e quitinase e inibiram a laminarinase. A aplicacao exogena de F-I e AS induziram a liberacao de compostos fenolicos para meio extracelular, que provavelmente, foi decorrente da tentativa das celulas de se protegerem de microrganismos invasores, com um decrescimo desses compostos no meio intracelular. O MeJA nao foi capaz de alterar a sintese de compostos fenolicos totais intracelulares e extracelulares e de acucares extracelulares, em tais condicoes. Tambem F-I e AS nao alteraram o teor de acucar redutor extracelular. O MeJA foi mais efetivo na producao de ERO durante 30 minutos de incubacao na concentracao de1 Êmol/L . F-I foi tambem ativador na liberacao de ERO, no entanto, o AS provocou inibicao. Os principais monossacarideos neutros que constitui a parede celular de suspensao de celulas de Rubus fruticosus sao as glucose (55-61%), arabinose (22-29%) e manose (13,8-15%). Ocorrendo em menor concentracoes os monossacarideos de fucose (0,65-1,2%), galactose (0,5-0,8%), xilose (0,5-0,8%) e ramnose (aproximadamente 0,5%).Os monossacarideos ramnose, fucose, xilose e galactose de parede celular tiveram um decrescimo na presenca do AS e um aumento na presenca de MeJA. Entretanto, o AS e o MeJA nao alteraram o percentual de arabinose, manose e glucose. O F-I foi capaz de aumentar o percentual dos monossacarideos ramnose e fucose e diminuir de glucose. Os resultados obtidos demonstram que a via de ativacao dos mecanismos de defesa da celula vegetal, induzida pelo MeJA, difere das vias ativadas pelo AS e F-I, pois o F-I e o AS induziram a liberacao de compostos fenolicos e o MeJA provocou aumento nas atividades enzimaticas, principalmente que atuam na parede celular da propria planta. O AS e o F-I foram mais efetivos no aumento das atividades enzimaticsa relacionadas a defesa da planta, as quais agem nas paredes de diversos fitopatogenos, sendo que as enzimas que podem atuar na parede celular da propria planta foram inibidas ou nao sofreram alteracao. / The plant-pathogen interactions trigger a series of signals that are not yet completely understood. One of the mechanisms is the hypersensitive response (HR), which is characterized by cell death in the infection site in order to prevent pathogen proliferation. Our previous studies with different elicitors demonstrated the correlation between the formation of reactive oxygen species (ROS) and cell wall degradation. Here, the cells were elicited with 1 mol/L salicylic acid (SA), methyl jasmonate (MeJA) or acid polysaccharide (rhamnoglucuronogalactan, F-I) (1mol/L) from characterization the extracellular components released and the modifications of the monosaccharide composition in cell wall during a hypersensitive response in Rubus fruticosus (blackberry-black).The extracellular proteins released to the extracellular were increased with the inducers molecules F-I and MeJA. The -D-xylosidase enzymatic activities didnt change in the presence of F-I, SA and MeJA. The time-course curves for -D-galactosidase, -D-glucosidase activities in fraction E were most effective for MeJA, while F-I and AS inhibited -Dgalactosidase. Also, the MeJA has ability to activate laminarinase and chitinase enzymatic activities and inhibit galacturonase and -L-fucosidase enzymatic activities. After 1h, the SA and F-I caused an increase galacturonase and chitinase activities and inhibited laminarinase enzymatic activity. Also, the time-course curves chitinase in the fraction increased with SA.The F-I and SA increased extracellular phenolic compounds, although they decreased them in the fraction I. MeJA was unable to change the synthesis of either intracellular or extracellular phenolic compounds. The data suggest that F-I and AS modulate the defense responses of plants through a via different that of MeJA. The extracellular reducing sugar didnt change with F-I, SA and MeJA.The MeJA was more effective in the release ROS incubation of 30 minutes at concentration of 1 mol/L. However, the presence of SA caused inhibition and F-I activated of ROS by cells.The main constituents of neutral sugars in the cell wall of Rubus fruticosus were glucose (55-61%), arabinose (22-29%) and mannose (13.8-15%). Minor constituents were fucose (0.65-1.2%), galactose (0.5- 0.8%), xylose (0.5-0.8%) and rhamnose (~0.5%). SA decreased the rhamnose and fucose concentrations; F-I both decreased the percentage of mannose and glucose and increased rhamnose and fucose. MeJA, in turn, increased the percentage of rhamnose, xylose and galactose. The data suggest that F-I and SA modulate the defense responses of plants through a mechanism unrelated to the MeJA via. Since the F-I and the SA induced the release phenolic compounds and the MeJA increased in enzymatic activities, mainly age in the own plant cell wall. The SA and F-I were more effective in the increasing defense enzyme-related activity of the plant that acts on the walls of several phytopathogens, and the enzymes that can act in the cell wall of the plant were inhibited or did not change.

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Do gênero de bactérias Xanthomonas, três espécies são patogênicas a citros: Xanthomonas citri subsp. citri, agente causal do cancro cítrico, uma das doenças de maior preocupação da citricultura; X. fuscans subsp. aurantifolii tipos B e C, que causam a cancrose; e X. alfalfae subsp. citrumelonis, responsável por causar a mancha bacteriana dos citros. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi a análise e descrição, em nível anatômico e ultraestrutural, dos processos de infecção de bactérias do gênero Xanthomonas, causadoras de doenças em citros, a correlação do fenótipo da interação XfaC-citros com o transcriptoma e a análise dos fatores de virulência das estirpes estudadas. O processo de infecção das estirpes Xac306, Xac636, Xac828, Xacm1510, XfaC1632 e XfaC1630 em lima ácida ‘Galego’ e/ou laranja doce ‘Hamlin’, foi avaliado em diferentes períodos de infecção, pelas técnicas de microscopia de luz e eletrônicas de varredura e transmissão. As seguintes características relacionadas a virulência das estirpes foram avaliadas: formação in vitro de biofilme, produção de goma, motilidade “swimming” e auto agregação celular. Os resultados mostraram que Xac306 é a estirpe mais agressiva dentre as demais, visto pelos sintomas e pela intensidade das alterações anatômicas no tecido de ‘Hamlin’ e ‘Galego’. O processo de infecção em lima ácida ‘Galego’ foi semelhante em todas as estirpes de Xanthomonas estudadas, pois induziram hiperplasia e hipertrofia, porém, em diferentes intensidades, sendo que as alterações provocadas pelas estirpes Xac828 e Xacm1510 não resultaram no rompimento da epiderme; todas as estirpes produziram goma, envolvendo as bactérias e favorecendo a colonização no ambiente intercelular. A microscopia de luz permitiu identificar alterações na anatomia de lima ácida ‘Galego’ infectada e a diferença de susceptibilidade entre as variedades de citros inoculadas com Xac306 e estirpes de XfaC. As microscopias eletrônicas de varredura e transmissão permitiram a identificação de aspectos em comum às estirpes, independente da variedade cítrica. A HR induzida por estirpes de XfaC foi caracterizada pela microscopia eletrônica de transmissão. Com a análise de microscopia, não foi possível estabelecer uma relação direta entre os testes de formação in vitro de biofilme, produção de goma e motilidade “swimming” das estirpes. A análise dos dados de transcriptoma revelou que a resposta de defesa de laranja ‘Hamlin’ contra XfaC foi uma resposta rápida e eficiente que levou a indução de HR, que em última instância, conteve a infecção pela morte celular programada no local da infecção. Esse trabalho ampliou o conhecimento da área sobre o comportamento de diferentes estirpes de Xanthomonas causadoras de doenças em citros, fornecendo informações sobre sua interação com o hospedeiro suscetível e a resposta de defesa de XfaC em interação incompatível. / Citrus are a diverse group of plant species, with high yield potential, but affected by several diseases. The bacteria genus Xanthomonas has three species pathogenic to citrus: Xanthomonas citri subsp. citri, causal agent of citrus canker, one of the most important diseases of citrus crop; X. fuscans subsp. aurantifolii types B and C, causing citrus cancrosis; and X. alfalfae subsp. citrumelonis, which causes citrus bacterial spot. Therefore, the goal of this work was to analyze and describe, at the anatomical and ultrastructural level the infectious processes of Xanthomonas causing diseases in citrus, the correlation of the XfaC-citrus interaction phenotype with the transcriptome and the comparative analysis of virulence related factors, in order to elucidate morphophysiological traits of host-pathogen interaction. The infection process of Xac306, Xac636, Xac828, Xacm1510, XfaC1632 and XfaC1630 strains in 'Galego' Mexican lime and 'Hamlin' sweet orange were evaluated at different points of infection by light microscopy and scanning and transmission electron microscopy. The following virulence related characteristics of the strains were evaluated: in vitro biofilm formation, gum production, swimming motility and cellular auto aggregation. The results showed that Xac306 is the most aggressive strain among the others, due to the intensity of the symptoms and anatomical alterations in 'Hamlin' and 'Galego' tissue. The infection process in the susceptible host ('Galego' Mexican lime) was similar for all Xanthomonas strains studied, since they induced hyperplasia and hypertrophy, however in different intensities, and the alterations caused by Xac828 and Xacm1510 strains did not result in epidermis rupture; all strains produce gum, involving bacteria and assisting colonization in the intercellular environment. Light microscopy was able to identify anatomical alterations in 'Galego' Mexican lime infected tissue and the susceptibility differences between citrus varieties inoculated with Xac306 and XfaC strains. The scanning and transmission electron microscopies was able to identify common traits to the strains, regardless of the citrus variety. The HR induced by XfaC strains was characterized by transmission electron microscopy. We could not stablish a direct relation between the in vitro biofilm formation, gum production and "swimming" motility of the strains with the microscopy analysis. The transcriptome analysis revealed that 'Hamlin' defense response against XfaC is a quick and effective response that led to an HR induction, which ultimately contained the infection, by programmed cell death at the site of infection. This work expanded our knowledge about the behavior of different Xanthomonas strains causing citrus diseases, providing information on its interaction with the susceptible host and the defense response of XfaC in an incompatible interaction.

A interacao planta-patogeno desencadeia uma serie de sinais que ainda nao estao completamente elucidados. Uma das respostas e a reacao de hipersensibilidade (RH), onde ocorre a morte celular programada no sitio da infeccao, impedindo a proliferacao do patogeno. Acredita que a morte celular e provocada pelo aumento do ERO, principalmente peroxido de hidrogenio (H2O2) e com o acumulo de acido salicilico (AS) que inibe a catalase, enzima responsavel pela transformacao de H2O2 em H2O e O2. Alem disso, ocorre o aumento da sintese e liberacao dos compostos fenolicos e alteracao da parede celular dos vegetais, com o aumento das atividades de diversas enzimas, capazes de degradar a parede celular da planta e do microrganismo invasor, liberando fragmentos que podem atuar como moleculas sinalizadoras, tornando as plantas mais resistentes. Nesse trabalho as celulas de Rubus fruticosus (amora-preta) foram tratadas, separadamente, com tres diferentes moleculas elicitoras, ou seja, moleculas capazes de ativar o mecanismo de defesa das plantas, o acido salicilico (AS), o metil jasmonato (MeJA) e ramnoglucuronogalactana (F-I), na concentracao de 1 Êmol/L durante 1h, para o estudo dos componentes extracelulares liberados e das modificacoes dos monossacarideos da parede celular durante resposta de hipersensibilidade. A concentracao de proteinas totais extracelulares foi aumentada com os indutores F-I e MeJA. A atividade enzimatica de -D-xilosidase nao se alterou na presenca de F-I, AS e MeJA. Entretanto, o MeJA tem a capacidade de aumentar as atividades das enzimas -D-galactosidase, -Dglucosidase, quitinase e laminarinase e inibir as atividades das enzimas galacturonase e -Lfucosidase na concentracao e tempo usado. O AS e F-I provocaram um aumento nas atividades de galacturonase e quitinase e inibiram a laminarinase. A aplicacao exogena de F-I e AS induziram a liberacao de compostos fenolicos para meio extracelular, que provavelmente, foi decorrente da tentativa das celulas de se protegerem de microrganismos invasores, com um decrescimo desses compostos no meio intracelular. O MeJA nao foi capaz de alterar a sintese de compostos fenolicos totais intracelulares e extracelulares e de acucares extracelulares, em tais condicoes. Tambem F-I e AS nao alteraram o teor de acucar redutor extracelular. O MeJA foi mais efetivo na producao de ERO durante 30 minutos de incubacao na concentracao de1 Êmol/L . F-I foi tambem ativador na liberacao de ERO, no entanto, o AS provocou inibicao. Os principais monossacarideos neutros que constitui a parede celular de suspensao de celulas de Rubus fruticosus sao as glucose (55-61%), arabinose (22-29%) e manose (13,8-15%). Ocorrendo em menor concentracoes os monossacarideos de fucose (0,65-1,2%), galactose (0,5-0,8%), xilose (0,5-0,8%) e ramnose (aproximadamente 0,5%).Os monossacarideos ramnose, fucose, xilose e galactose de parede celular tiveram um decrescimo na presenca do AS e um aumento na presenca de MeJA. Entretanto, o AS e o MeJA nao alteraram o percentual de arabinose, manose e glucose. O F-I foi capaz de aumentar o percentual dos monossacarideos ramnose e fucose e diminuir de glucose. Os resultados obtidos demonstram que a via de ativacao dos mecanismos de defesa da celula vegetal, induzida pelo MeJA, difere das vias ativadas pelo AS e F-I, pois o F-I e o AS induziram a liberacao de compostos fenolicos e o MeJA provocou aumento nas atividades enzimaticas, principalmente que atuam na parede celular da propria planta. O AS e o F-I foram mais efetivos no aumento das atividades enzimaticsa relacionadas a defesa da planta, as quais agem nas paredes de diversos fitopatogenos, sendo que as enzimas que podem atuar na parede celular da propria planta foram inibidas ou nao sofreram alteracao. / The plant-pathogen interactions trigger a series of signals that are not yet completely understood. One of the mechanisms is the hypersensitive response (HR), which is characterized by cell death in the infection site in order to prevent pathogen proliferation. Our previous studies with different elicitors demonstrated the correlation between the formation of reactive oxygen species (ROS) and cell wall degradation. Here, the cells were elicited with 1 mol/L salicylic acid (SA), methyl jasmonate (MeJA) or acid polysaccharide (rhamnoglucuronogalactan, F-I) (1mol/L) from characterization the extracellular components released and the modifications of the monosaccharide composition in cell wall during a hypersensitive response in Rubus fruticosus (blackberry-black).The extracellular proteins released to the extracellular were increased with the inducers molecules F-I and MeJA. The -D-xylosidase enzymatic activities didnt change in the presence of F-I, SA and MeJA. The time-course curves for -D-galactosidase, -D-glucosidase activities in fraction E were most effective for MeJA, while F-I and AS inhibited -Dgalactosidase. Also, the MeJA has ability to activate laminarinase and chitinase enzymatic activities and inhibit galacturonase and -L-fucosidase enzymatic activities. After 1h, the SA and F-I caused an increase galacturonase and chitinase activities and inhibited laminarinase enzymatic activity. Also, the time-course curves chitinase in the fraction increased with SA.The F-I and SA increased extracellular phenolic compounds, although they decreased them in the fraction I. MeJA was unable to change the synthesis of either intracellular or extracellular phenolic compounds. The data suggest that F-I and AS modulate the defense responses of plants through a via different that of MeJA. The extracellular reducing sugar didnt change with F-I, SA and MeJA.The MeJA was more effective in the release ROS incubation of 30 minutes at concentration of 1 mol/L. However, the presence of SA caused inhibition and F-I activated of ROS by cells.The main constituents of neutral sugars in the cell wall of Rubus fruticosus were glucose (55-61%), arabinose (22-29%) and mannose (13.8-15%). Minor constituents were fucose (0.65-1.2%), galactose (0.5- 0.8%), xylose (0.5-0.8%) and rhamnose (~0.5%). SA decreased the rhamnose and fucose concentrations; F-I both decreased the percentage of mannose and glucose and increased rhamnose and fucose. MeJA, in turn, increased the percentage of rhamnose, xylose and galactose. The data suggest that F-I and SA modulate the defense responses of plants through a mechanism unrelated to the MeJA via. Since the F-I and the SA induced the release phenolic compounds and the MeJA increased in enzymatic activities, mainly age in the own plant cell wall. The SA and F-I were more effective in the increasing defense enzyme-related activity of the plant that acts on the walls of several phytopathogens, and the enzymes that can act in the cell wall of the plant were inhibited or did not change.

Momordica charantia é uma espécie de planta pertencente à família Cucurbitaceae. No Brasil, é conhecida pelo nome popular de Melão de São Caetano. É encontrada em grande parte do globo terrestre, sendo que no Brasil é observada nas regiões litorâneas e principalmente nas regiões do interior do país. Escolhemos o estudo com Momordica charantia devido suas propriedades terapêuticas conhecidas serem de grande interesse. Ela vem ganhando cada vez mais reconhecimento através de pesquisas científicas realizadas, visto que, já é utilizada a milhares de anos através da cultura popular. Tais pesquisas têm confirmado e entendido cada vez mais as propriedades medicamentosas desta planta e os mecanismos responsáveis por tais funções nesta espécie, sendo as propriedades antidiabéticas, antivirais e anticancerígenas as de maior destaque. Os experimentos realizados em torno da Momordica charantia, na busca destes compostos foram todos realizados utilizando extratos retirados dos próprios tecidos já diferenciados na planta adulta (sementes, folhas, raízes e frutos). Neste trabalho, foi realizado a pesquisa de metabólitos secundários produzidos pela cultura de células em suspensão de Momordica charantia durante a fase de crescimento desta e após a realização de ensaios de elicitação com Ácido Salicílico (AS). Nosso laboratório vem se dedicando aos estudos da composição da parede celular vegetal e suas alterações, bem como dos mecanismos de defesa empregados pelas células em suspensão em condições de estresse biótico e abiótico. O ácido salicílico é um dos hormônios vegetais envolvido em vários mecanismos de respostas que envolve o estresse vegetal e de desenvolvimento da planta tais como o de garantir resistência a patógenos por exemplo. Quando ocorre algum processo de infecção ou lesivo para a planta, ocorre um aumento na concentração de AS no interior da planta. Esse aumento leva a ativação de certas vias metabólicas que culminam na produção de metabólitos secundários e na degradação, fragmentação ou espessamento da parede celular. Como reposta dos ensaios de elicitação realizados podemos comprovar os efeitos do AS mediados na produção de metabólitos secundários que foram aumentados conforme a concentração de AS. Foi utilizado para os ensaios de elicitação AS nas concentrações de 0,5 , 1,0 e 5 mmol/L. Para o monitoramento da cultura e averiguação da efetividade dos ensaios de elicitação foi utilizado a monitoria através da dosagem de proteínas totais, compostos fenólicos totais e açúcares redutores totais tanto liberados para o meio extracelular quanto produzidos no meio intracelular. Foi determinado as variações dos componentes da parede celular durante a fase de crescimento e após os ensaios de elicitação onde foi comprovado que quanto maior a concentração de AS, maiores são os fragmentos de açúcares fragmentados da parede celular. Foi evidenciado também a presença de triterpenos na cultura celular (em comparação com os padrões isolados da planta), tanto na fase de crescimento e também após a indução com os ensaios de elicitação com AS. / Momordica charantia is a plant from the Cucurbitaceae family. In Brazil, it is known by the popular name of Melão de São Caetano. It is found across the whole world, and in Brazil it can be found in coastal and interior regions of the country. The aim to study Momordica charantia is due to its known therapeutic properties that are already used for thousands of years through popular culture. The studies have confirmed and understood various drug-like properties of this plant and the mechanisms responsible for such functions in this species, such as antidiabetic, antiviral and anticancer properties. The researches with Momordica charantia were all performed using extracts obtained from seeds, leaves, roots and fruit. In this work, the isolation and characterization of metabolites as standards from leaves and stems of Momordica charantia was performed. The research of secondary metabolites produced in cell culture suspension of Momordica charantia without elicitor or after elicitation with salicylic acid (SA) was conducted. Salicylic acid is a plant hormone involved in various mechanisms of responses. When the plant suffers an infection or injury, it is followed by an increase in AS concentration. This increase leads to activation of certain metabolic pathways that culminate in the production of secondary metabolites and degradation, fragmentation or cell wall thickening. AS was utilized for the elicitation experiments at 0.5, 1.0 and 5 mmol/L. For the monitoring of plant cell culture, it was determinate the total protein, phenolic compounds and reducing sugars content, into the extra and intra cellular medium. Where it was verified that AS modulates the production of these molecules in culture. After this, we determined the variation in the oligosaccharides in the extracellular medium obtained in the presence or absence of AS. It was observed the degree of polymerization of oligosaccharides higher when increase AS concentration in the medium. In conclusion, this study can demonstrate the effects of SA on the production of secondary metabolites in plant cell culture, which were increased as the concentration of AS increased. The presence of triterpenes in cell culture was confirmed to compare the molecules obtained from culture with that isolated from plant standards.

As plantas, assim como outros organismos, possuem a capacidade de se defenderem contra ataque de patógenos. Uma das respostas desencadeadas pelo reconhecimento do patógeno pelas células vegetais é a reação de hipersensibilidade (RH), que envolve a morte imediata das células do sítio primário de infecção, oferecendo resistência ao crescimento do patógeno. Muitas evidências sugerem a participação da mitocôndria neste processo de morte celular programa. O nim (Azadirachta indica) é conhecido devido as suas propriedades medicinais e inseticidas, sendo que os estudos sobre a ação inseticida dessa planta restringem-se a análise de seus mecanismos de ação sobre insetos e também de seus efeitos sobre trabalhadores rurais que fazem uso de produtos a base de nim. Entretanto não há na literatura pesquisada, trabalhos de seus impactos sobre o sistema vegetal. A partir dos resultados previamente obtidos em nosso laboratório e com as análises dos dados da literatura, consideramos de grande importância dar continuidade a esse estudo do efeito do nim como elicitor, avaliando quais mecanismos que levam ao fenômeno de resistência vegetal. O extrato de nim (EB) foi preparado a partir das sementes, sendo caracterizado bioquimicamente pela quantificação de compostos fenólicos, açúcares e proteínas. A atividade antioxidante foi avaliada sendo possível observar que o extrato das sementes de nim possui forte atividade antioxidante de maneira dose-dependente com IC50 de 14,85 mg/mL. Para os ensaios biológicos foi utilizado EB nas concentrações de 0,1 a 5 mg/mL isolado ou em associação com AS a 1 µmol/L ou 1 mmol/L. Para determinação da morte celular foi observado o efeito do EB nas concentrações de 5 e 0,1 mg/mL isolado ou em associação com AS 1 µmol/L nos tempos de 0 a 8 horas. Diante dos resultados foi observado que o EB na concentração de 0,1 mg/mL isolado ou em associação com AS 1 µmol/L foi capaz de causar morte celular em células de Rubus fruticosus de forma mais significativa do que o EB isolado ou em associação com AS na concentração de 5 mg/mL. No tempo de 8 horas, foi observado uma porcentagem de morte celular de 64 % para células elicitadas com EB 0,1 mg/mL isolado e 71 % para células elicitadas com EB 0,1 mg/mL em associação com AS. A diminuição da produção de EROs e da produção de AS endógeno bem como o aumento da produção de compostos fenólicos foi observado em células intactas elicitadas com EB isolado. No entanto quando a células foram elicitadas com EB em associação com AS observamos uma diminuição da produção de compostos fenólicos com o aumento da produção de AS endógeno. Em mitocôndrias isoladas foi avaliado o consumo de oxigênio, o potencial de membrana e a produção de EROs com o EB isolado e sua associação com AS 1 mmol/L. Foi observado que o EB isolado ou em associação com AS foi capaz de diminuir a velocidade de consumo de oxigênio pela cadeia respiratória sendo este efeito mais acentuado quando o nim foi administrado juntamente com AS, onde a porcentagem de inibição da velocidade de consumo de oxigênio pela cadeia respiratória na presença de EB em associação com AS foi de 79 % no estado 3 da respiração e 62 % no estado 4. Sobre o potencial de membrana observamos que o EB isolado ou em associação com AS foi capaz de diminuir o potencial de membrana, porém de forma pouco significativa. Para a produção de EROs observamos que o EB isolado foi capaz de diminuir a produção de EROs em mitocôndrias isoladas em cerca de 55 a 20 % na presença de antimicina A e 39 a 10 % na presença de rotenona, porém quando o EB foi administrado juntamente com AS observamos uma diminuição da produção de EROs somente para o EB nas concentrações de 0,5; 1 e 5 mg/mL. Com os resultados apresentados neste trabalho e os resultados obtidos anteriormente em nosso laboratório é possível sugerir que o extrato das sementes de nim possui um efeito protetor sobre células de Rubus fruticosus. / Plants, like other organisms, have the capacity to defend themselves against attack by pathogens. One of the responses triggered by pathogen recognition by plant cells is the hypersensitive response (HR), which involves the immediate death of cells in the primary site of infection, providing resistance to the pathogen growth. In this regard, it has been well established that mitochondria are involved in cell death. The neem tree (Azadirachta indica) is known due to its medicinal and insecticidal properties; studies on the insecticidal action of this plant had been restricted to the analysis of their action mechanisms on insects and their effects on rural workers who use neem-based products. However, its impact on plant systems has not been addressed. Considering previous results from our laboratory and literature data we assessed the effects of neem as elicitor, particularly the mechanisms leading to the phenomenon of plant resistance. The neem extract (EB) was prepared from the seeds, characterized biochemically by quantification of phenolic compounds, sugars and proteins. The extract showed strong dose-dependent antioxidant activity (IC50 of 14.85 mg/mL). EB concentrations of 0.1-5 mg/mL, alone or in association with 1 mol/L or 1 mmol/L SA (salicylic acid), were used for the biological assays. For cell death assays, EB was employed in concentrations of 0.1 and 5.0 mg/mL, alone or in association with 1 mol/L SA, during 0-8 hours. EB (0.1 mg/mL), alone or in association with 1 mol/L SA, induced Rubus fruticosus cell death more efficiently than EB alone or in association with 5 mg/mL SA. After 8 hours, a 64% of death of cells elicited with 0.1 mg/mL EB and 71% of death of cells elicited with 0.1 mg/mL EB in association with SA, was observed. Decrease in ROS generation and production of endogenous SA, as well as increased production of phenolic compounds, was observed in intact cells elicited with EB alone. However, when cells were elicited with EB in association with SA, a decreased production of phenolic compounds and an increased production of endogenous SA, was observed. In isolated mitochondria, it was measured oxygen consumption, membrane potential and ROS production for EB alone or in association with 1 mmol/L SA. In either conditions, EB decreased oxygen consumption by the respiratory chain, an effect more pronounced in association with SA: ~79 % inhibition for state 3 and ~ 62 % for state 4 respiration. Also, either neem alone or in association with SA decreased mitochondrial membrane potential, as well as ROS generation to an extent of 55-20% in the presence of antimycin A and 39-10% in the presence of rotenone; in association with SA, EB decreased ROS at 5, 1 and 0.5 mg/mL. Together with our previous study, these results suggest that neem seeds extract has a protective effect on Rubus fruticosus cells by scavenging, via phenolic compounds, reactive oxygen species generated by SA, thereby decreasing its action as cell death inducer.

Como os outros organismos, as plantas têm a habilidade de se defenderem através do reconhecimento de patógenos (resposta de hipersensibilidade - RH), causando a morte imediata das células no sítio primário da infecção, desta maneira oferecendo resistência ao seu crescimento. A RH é caracterizada pela necrose dos tecidos neste local, através de muitos sinais ainda não completamente elucidados, como a formação de radicais livres, incluindo o peróxido de hidrogênio (H2O2), e o reforço da parede celular. O objetivo deste estudo foi estabelecer a relação entre esses sinais em cultura de células de amora-preta (Rubus fruticosus). As condições experimentais para a análise da parede celular, das espécies reativas de oxigênio (EROs) e do H2O2 foram padronizadas. O polissacarídeo ácido (ramnoglucuronogalactana, F-I), o ácido salicílico (AS), e o metil jasmonato (MeJA), bem estabelecidos efetores da resposta da defesa, foram usados como elicitores. A produção das EROs e do H2O2 foram ativadas por F-I e pelo AS, seguidos da liberação de fragmentos de dissacarídeos da parede celular, aparentemente devido a sua degradação. Por outro lado, uma produção pequena de EROs e de H2O2 foram observadas na presença de MeJA, assim como um aumento de fragmentos de massa molecular mais elevada, que podem funcionar como sinais para o reforço da parede celular, indução de enzimas e para a produção de outra moléculas de defesa. Quando da elicitação, concomitante, com dois elicitores, AS + MeJA, houve a inibição da produção de EROs causada pelo MeJA e foi mantida a liberação de compostos extracelulares de massa molecular mais elevada. / Like the other organisms, plants have the ability to self-defend through recognition of pathogens (hypersensitive response - HR), causing immediate cell death at the primary infection site, thus offering resistance to their grown. The HR is characterized by necrosis of tissues in this site via many signals still not completely elucidated, like formation of free radicals including H2O2 and reinforcement of cell wall. The aim of this study was to establish the relationship between these signals in blackberry-black cell culture (Rubus fruticosus). The experimental conditions for analysis of cell wall, reactive oxygen species (ROS) and H2O2, were established. Acid polysaccharide (rhamnoglucuronogalactan, F-I), salicylic acid (SA), and methyl jasmonate (MeJA), well established effectors of the defense response, were used as elicitors. ROS and H2O2 production was activated by F-I and SA, followed by release of fragments like disaccharides from the cell wall, apparently due to its degradation. By contrast, a small production of ROS and H2O2 was observed in presence of MeJA, as well as an increase of high molecular weight fragments, that may function as signals for reinforcement of cell wall, enzyme induction and production of others defense molecules. Together, the two elicitors SA and MeJA inhibited the ROS production, caused by MeJA, while sustaining release of the extra cellular compounds of high molecular weight.

Momordica charantia é uma espécie de planta pertencente à família Cucurbitaceae. No Brasil, é conhecida pelo nome popular de Melão de São Caetano. É encontrada em grande parte do globo terrestre, sendo que no Brasil é observada nas regiões litorâneas e principalmente nas regiões do interior do país. Escolhemos o estudo com Momordica charantia devido suas propriedades terapêuticas conhecidas serem de grande interesse. Ela vem ganhando cada vez mais reconhecimento através de pesquisas científicas realizadas, visto que, já é utilizada a milhares de anos através da cultura popular. Tais pesquisas têm confirmado e entendido cada vez mais as propriedades medicamentosas desta planta e os mecanismos responsáveis por tais funções nesta espécie, sendo as propriedades antidiabéticas, antivirais e anticancerígenas as de maior destaque. Os experimentos realizados em torno da Momordica charantia, na busca destes compostos foram todos realizados utilizando extratos retirados dos próprios tecidos já diferenciados na planta adulta (sementes, folhas, raízes e frutos). Neste trabalho, foi realizado a pesquisa de metabólitos secundários produzidos pela cultura de células em suspensão de Momordica charantia durante a fase de crescimento desta e após a realização de ensaios de elicitação com Ácido Salicílico (AS). Nosso laboratório vem se dedicando aos estudos da composição da parede celular vegetal e suas alterações, bem como dos mecanismos de defesa empregados pelas células em suspensão em condições de estresse biótico e abiótico. O ácido salicílico é um dos hormônios vegetais envolvido em vários mecanismos de respostas que envolve o estresse vegetal e de desenvolvimento da planta tais como o de garantir resistência a patógenos por exemplo. Quando ocorre algum processo de infecção ou lesivo para a planta, ocorre um aumento na concentração de AS no interior da planta. Esse aumento leva a ativação de certas vias metabólicas que culminam na produção de metabólitos secundários e na degradação, fragmentação ou espessamento da parede celular. Como reposta dos ensaios de elicitação realizados podemos comprovar os efeitos do AS mediados na produção de metabólitos secundários que foram aumentados conforme a concentração de AS. Foi utilizado para os ensaios de elicitação AS nas concentrações de 0,5 , 1,0 e 5 mmol/L. Para o monitoramento da cultura e averiguação da efetividade dos ensaios de elicitação foi utilizado a monitoria através da dosagem de proteínas totais, compostos fenólicos totais e açúcares redutores totais tanto liberados para o meio extracelular quanto produzidos no meio intracelular. Foi determinado as variações dos componentes da parede celular durante a fase de crescimento e após os ensaios de elicitação onde foi comprovado que quanto maior a concentração de AS, maiores são os fragmentos de açúcares fragmentados da parede celular. Foi evidenciado também a presença de triterpenos na cultura celular (em comparação com os padrões isolados da planta), tanto na fase de crescimento e também após a indução com os ensaios de elicitação com AS. / Momordica charantia is a plant from the Cucurbitaceae family. In Brazil, it is known by the popular name of Melão de São Caetano. It is found across the whole world, and in Brazil it can be found in coastal and interior regions of the country. The aim to study Momordica charantia is due to its known therapeutic properties that are already used for thousands of years through popular culture. The studies have confirmed and understood various drug-like properties of this plant and the mechanisms responsible for such functions in this species, such as antidiabetic, antiviral and anticancer properties. The researches with Momordica charantia were all performed using extracts obtained from seeds, leaves, roots and fruit. In this work, the isolation and characterization of metabolites as standards from leaves and stems of Momordica charantia was performed. The research of secondary metabolites produced in cell culture suspension of Momordica charantia without elicitor or after elicitation with salicylic acid (SA) was conducted. Salicylic acid is a plant hormone involved in various mechanisms of responses. When the plant suffers an infection or injury, it is followed by an increase in AS concentration. This increase leads to activation of certain metabolic pathways that culminate in the production of secondary metabolites and degradation, fragmentation or cell wall thickening. AS was utilized for the elicitation experiments at 0.5, 1.0 and 5 mmol/L. For the monitoring of plant cell culture, it was determinate the total protein, phenolic compounds and reducing sugars content, into the extra and intra cellular medium. Where it was verified that AS modulates the production of these molecules in culture. After this, we determined the variation in the oligosaccharides in the extracellular medium obtained in the presence or absence of AS. It was observed the degree of polymerization of oligosaccharides higher when increase AS concentration in the medium. In conclusion, this study can demonstrate the effects of SA on the production of secondary metabolites in plant cell culture, which were increased as the concentration of AS increased. The presence of triterpenes in cell culture was confirmed to compare the molecules obtained from culture with that isolated from plant standards.

As plantas, assim como outros organismos, possuem a capacidade de se defenderem contra ataque de patógenos. Uma das respostas desencadeadas pelo reconhecimento do patógeno pelas células vegetais é a reação de hipersensibilidade (RH), que envolve a morte imediata das células do sítio primário de infecção, oferecendo resistência ao crescimento do patógeno. Muitas evidências sugerem a participação da mitocôndria neste processo de morte celular programa. O nim (Azadirachta indica) é conhecido devido as suas propriedades medicinais e inseticidas, sendo que os estudos sobre a ação inseticida dessa planta restringem-se a análise de seus mecanismos de ação sobre insetos e também de seus efeitos sobre trabalhadores rurais que fazem uso de produtos a base de nim. Entretanto não há na literatura pesquisada, trabalhos de seus impactos sobre o sistema vegetal. A partir dos resultados previamente obtidos em nosso laboratório e com as análises dos dados da literatura, consideramos de grande importância dar continuidade a esse estudo do efeito do nim como elicitor, avaliando quais mecanismos que levam ao fenômeno de resistência vegetal. O extrato de nim (EB) foi preparado a partir das sementes, sendo caracterizado bioquimicamente pela quantificação de compostos fenólicos, açúcares e proteínas. A atividade antioxidante foi avaliada sendo possível observar que o extrato das sementes de nim possui forte atividade antioxidante de maneira dose-dependente com IC50 de 14,85 mg/mL. Para os ensaios biológicos foi utilizado EB nas concentrações de 0,1 a 5 mg/mL isolado ou em associação com AS a 1 µmol/L ou 1 mmol/L. Para determinação da morte celular foi observado o efeito do EB nas concentrações de 5 e 0,1 mg/mL isolado ou em associação com AS 1 µmol/L nos tempos de 0 a 8 horas. Diante dos resultados foi observado que o EB na concentração de 0,1 mg/mL isolado ou em associação com AS 1 µmol/L foi capaz de causar morte celular em células de Rubus fruticosus de forma mais significativa do que o EB isolado ou em associação com AS na concentração de 5 mg/mL. No tempo de 8 horas, foi observado uma porcentagem de morte celular de 64 % para células elicitadas com EB 0,1 mg/mL isolado e 71 % para células elicitadas com EB 0,1 mg/mL em associação com AS. A diminuição da produção de EROs e da produção de AS endógeno bem como o aumento da produção de compostos fenólicos foi observado em células intactas elicitadas com EB isolado. No entanto quando a células foram elicitadas com EB em associação com AS observamos uma diminuição da produção de compostos fenólicos com o aumento da produção de AS endógeno. Em mitocôndrias isoladas foi avaliado o consumo de oxigênio, o potencial de membrana e a produção de EROs com o EB isolado e sua associação com AS 1 mmol/L. Foi observado que o EB isolado ou em associação com AS foi capaz de diminuir a velocidade de consumo de oxigênio pela cadeia respiratória sendo este efeito mais acentuado quando o nim foi administrado juntamente com AS, onde a porcentagem de inibição da velocidade de consumo de oxigênio pela cadeia respiratória na presença de EB em associação com AS foi de 79 % no estado 3 da respiração e 62 % no estado 4. Sobre o potencial de membrana observamos que o EB isolado ou em associação com AS foi capaz de diminuir o potencial de membrana, porém de forma pouco significativa. Para a produção de EROs observamos que o EB isolado foi capaz de diminuir a produção de EROs em mitocôndrias isoladas em cerca de 55 a 20 % na presença de antimicina A e 39 a 10 % na presença de rotenona, porém quando o EB foi administrado juntamente com AS observamos uma diminuição da produção de EROs somente para o EB nas concentrações de 0,5; 1 e 5 mg/mL. Com os resultados apresentados neste trabalho e os resultados obtidos anteriormente em nosso laboratório é possível sugerir que o extrato das sementes de nim possui um efeito protetor sobre células de Rubus fruticosus. / Plants, like other organisms, have the capacity to defend themselves against attack by pathogens. One of the responses triggered by pathogen recognition by plant cells is the hypersensitive response (HR), which involves the immediate death of cells in the primary site of infection, providing resistance to the pathogen growth. In this regard, it has been well established that mitochondria are involved in cell death. The neem tree (Azadirachta indica) is known due to its medicinal and insecticidal properties; studies on the insecticidal action of this plant had been restricted to the analysis of their action mechanisms on insects and their effects on rural workers who use neem-based products. However, its impact on plant systems has not been addressed. Considering previous results from our laboratory and literature data we assessed the effects of neem as elicitor, particularly the mechanisms leading to the phenomenon of plant resistance. The neem extract (EB) was prepared from the seeds, characterized biochemically by quantification of phenolic compounds, sugars and proteins. The extract showed strong dose-dependent antioxidant activity (IC50 of 14.85 mg/mL). EB concentrations of 0.1-5 mg/mL, alone or in association with 1 mol/L or 1 mmol/L SA (salicylic acid), were used for the biological assays. For cell death assays, EB was employed in concentrations of 0.1 and 5.0 mg/mL, alone or in association with 1 mol/L SA, during 0-8 hours. EB (0.1 mg/mL), alone or in association with 1 mol/L SA, induced Rubus fruticosus cell death more efficiently than EB alone or in association with 5 mg/mL SA. After 8 hours, a 64% of death of cells elicited with 0.1 mg/mL EB and 71% of death of cells elicited with 0.1 mg/mL EB in association with SA, was observed. Decrease in ROS generation and production of endogenous SA, as well as increased production of phenolic compounds, was observed in intact cells elicited with EB alone. However, when cells were elicited with EB in association with SA, a decreased production of phenolic compounds and an increased production of endogenous SA, was observed. In isolated mitochondria, it was measured oxygen consumption, membrane potential and ROS production for EB alone or in association with 1 mmol/L SA. In either conditions, EB decreased oxygen consumption by the respiratory chain, an effect more pronounced in association with SA: ~79 % inhibition for state 3 and ~ 62 % for state 4 respiration. Also, either neem alone or in association with SA decreased mitochondrial membrane potential, as well as ROS generation to an extent of 55-20% in the presence of antimycin A and 39-10% in the presence of rotenone; in association with SA, EB decreased ROS at 5, 1 and 0.5 mg/mL. Together with our previous study, these results suggest that neem seeds extract has a protective effect on Rubus fruticosus cells by scavenging, via phenolic compounds, reactive oxygen species generated by SA, thereby decreasing its action as cell death inducer.

Como os outros organismos, as plantas têm a habilidade de se defenderem através do reconhecimento de patógenos (resposta de hipersensibilidade - RH), causando a morte imediata das células no sítio primário da infecção, desta maneira oferecendo resistência ao seu crescimento. A RH é caracterizada pela necrose dos tecidos neste local, através de muitos sinais ainda não completamente elucidados, como a formação de radicais livres, incluindo o peróxido de hidrogênio (H2O2), e o reforço da parede celular. O objetivo deste estudo foi estabelecer a relação entre esses sinais em cultura de células de amora-preta (Rubus fruticosus). As condições experimentais para a análise da parede celular, das espécies reativas de oxigênio (EROs) e do H2O2 foram padronizadas. O polissacarídeo ácido (ramnoglucuronogalactana, F-I), o ácido salicílico (AS), e o metil jasmonato (MeJA), bem estabelecidos efetores da resposta da defesa, foram usados como elicitores. A produção das EROs e do H2O2 foram ativadas por F-I e pelo AS, seguidos da liberação de fragmentos de dissacarídeos da parede celular, aparentemente devido a sua degradação. Por outro lado, uma produção pequena de EROs e de H2O2 foram observadas na presença de MeJA, assim como um aumento de fragmentos de massa molecular mais elevada, que podem funcionar como sinais para o reforço da parede celular, indução de enzimas e para a produção de outra moléculas de defesa. Quando da elicitação, concomitante, com dois elicitores, AS + MeJA, houve a inibição da produção de EROs causada pelo MeJA e foi mantida a liberação de compostos extracelulares de massa molecular mais elevada. / Like the other organisms, plants have the ability to self-defend through recognition of pathogens (hypersensitive response - HR), causing immediate cell death at the primary infection site, thus offering resistance to their grown. The HR is characterized by necrosis of tissues in this site via many signals still not completely elucidated, like formation of free radicals including H2O2 and reinforcement of cell wall. The aim of this study was to establish the relationship between these signals in blackberry-black cell culture (Rubus fruticosus). The experimental conditions for analysis of cell wall, reactive oxygen species (ROS) and H2O2, were established. Acid polysaccharide (rhamnoglucuronogalactan, F-I), salicylic acid (SA), and methyl jasmonate (MeJA), well established effectors of the defense response, were used as elicitors. ROS and H2O2 production was activated by F-I and SA, followed by release of fragments like disaccharides from the cell wall, apparently due to its degradation. By contrast, a small production of ROS and H2O2 was observed in presence of MeJA, as well as an increase of high molecular weight fragments, that may function as signals for reinforcement of cell wall, enzyme induction and production of others defense molecules. Together, the two elicitors SA and MeJA inhibited the ROS production, caused by MeJA, while sustaining release of the extra cellular compounds of high molecular weight.