Made available in DSpace on 2017-05-12T14:36:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Iara _Fernanda Rocha (1).pdf: 1203704 bytes, checksum: 3b3c626c8325feae1cf11ce8968fd774 (MD5) Previous issue date: 2015-12-03 / Diatraea saccharalis is an important insect pest of sugarcane and other crops, so it has been the focus of research. In general, the insects present innate immune system, which come with a range of immune responses against microorganisms. Many antimicrobial peptides have been isolated and characterized from model insects such as Drosophila melanogaster and Bombyx mori. In the 5th instar larvae of Diatraea saccharalis has already been reported a protein of Gloverin family with antimicrobial activity. Considering these facts, the objectives of this study were to determine the protein profile of hemolymph larvae from Diatraea sacharalis at 5th instar challenged with Escherichia coli (ATCC 11224) and Bacillus subtilis (ATCC 6623), identify differentially expressed proteins and polypeptides by analyzing the proteomic data, and verifying the antimicrobial activity of crude extract on plates by inhibition of microbial growth. Proteins from the hemolymph of larvae of D. sacharalis challenged and unchallenged were extracted. The samples were quantified and subjected to two-dimensional electrophoresis (2-DE) to obtain a proteomic profile of native hemolymph, challenged by E. coli and B. subtilis. Each gel showed an average of 300 protein spots and 92 spots were correspondents in these gels on three conditions. Were taken 41 different protein spots from gels, these spots were digested with trypsin and analyzed by mass spectrometry of the type MALDI-TOF/TOF. In this analysis, it was possible to identify 10 proteins from MS and MS/MS spectra. Among these proteins were expressed by induction with both bacteria such as chitinase and antimicrobial peptides: protein homologous to the turandot (turandot the like-protein), protein homologous to attacin (Attacin like-protein), and protein homologous peptidoglycan recognition. Another antimicrobial peptide was found, the homologous to β-defensin (β-defensin-like protein), induced only in the hemolymph of the larvae challenged by B. subtilis. A homologous protein Cyclophilin (Cyclophilin-like protein) was found in the hemolymph of larvae challenged and non-challenged. In addition, were also found proteins with hatching activity, hydrolytic not characterized and hypothetical protein of unknown function. Additionally, it also tested the antimicrobial activity of crude extracts from the hemolymph, by testing inhibition of microbial growth plate area, and this analysis was observed inhibition of growth of B. subtilis with the hemolymph extract from larvae challenged with B. subtilis. This is the first analysis of proteomic profile of hemolymph of a major agricultural pest, which verified the expression of some proteins with several functions and four related proteins immune response. These results contribute to the understanding of the immune system D. saccharalis under condition of infection. / Diatraea saccharalis é um importante inseto praga da cana-de-açúcar e de outras culturas agrícolas, por isso, tem sido foco de pesquisas. De uma forma geral, os insetos apresentam sistema imunológico inato, que os provêm com uma gama de respostas imunológicas contra microrganismos. Inúmeros peptídeos antimicrobianos têm sido isolados e caracterizados a partir de insetos modelo, como Bombyx mori e Drosophila melanogaster. Em larvas de 5º ínstar de Diatraea saccharalis já foi reportada uma proteína da família Gloverina com atividade antimicrobiana. Considerando estes fatos, os objetivos deste trabalho foram determinar o perfil de proteínas da hemolinfa de larvas de Diatraea sacharalis em 5º ínstar desafiadas com Escherichia coli (ATCC 11224) e Bacillus subtilis (ATCC 6623), identificar proteínas e polipeptídios diferencialmente expressos através da análise dos dados proteômicos, e verificar a atividade antimicrobiana do extrato bruto em placas por meio da inibição do crescimento microbiano. Foram extraídas proteínas da hemolinfa de larvas de D. sacharalis desafiadas e de não desafiadas. As amostras foram quantificadas e submetidas à eletroforese bidimensional (2-DE) para obtenção de um perfil proteômico da hemolinfa nativa, de larvas desafiadas por E. coli e B. subtilis. Cada gel apresentou em média 300 spots protéicos e 92 destes spots eram correspondentes nos géis nas três condições. Foram retirados 41 spots protéicos diferentes dos géis, estes spots foram digeridos com tripsina e analisados por espectrometria de massas do tipo Maldi-ToF/ToF. Nesta análise, foi possível identificar 10 proteínas a partir dos espectros MS e MS/MS. Entre elas, proteínas que foram expressas pela indução com ambas as bactérias, como a quitinase, e os peptídeos antimicrobianos: proteina homóloga à turandot A (turandot A like-protein), proteina homóloga à Atacina (Attacin like-protein), proteína homóloga de reconhecimento de peptideoglicano. Outro peptídeo antimicrobiano encontrado, o homólogo à β-defensina (β-defensin like-protein), foi induzido somente na hemolinfa das larvas desafiadas por B. subtilis. Uma proteína homológa á Ciclofilina (Cyclophilin like-protein) foi encontrada na hemolinfa da larvas desafiadas e não-desafiadas. Além disso, também foram encontradas proteínas com atividade de eclosão, hidrolítica, não caracterizada e proteína hipotética com função desconhecida. Adicionalmente, foi também testada a atividade antimicrobiana dos extratos brutos da hemolinfa, pelo ensaio de zona de inibição do crescimento microbiano em placa, e nesta análise, foi verificada a inibição do crescimento de B. subtilis com o extrato da hemolinfa de larvas desafiadas com B. subtilis. Esta é a primeira análise do perfil proteômico da hemolinfa de uma importante praga agrícola, na qual verificou-se a expressão de algumas proteínas com funções diversas e quatro proteínas relacionadas a resposta imunulógica. Estes resultados contribuem para a compreensão do sistema imunológico da D. saccharalis sob condição de infecção.

Made available in DSpace on 2017-07-10T13:59:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Iara _Fernanda Rocha (1).pdf: 1203704 bytes, checksum: 3b3c626c8325feae1cf11ce8968fd774 (MD5) Previous issue date: 2015-12-03 / SIM (não especificado) / Diatraea saccharalis is an important insect pest of sugarcane and other crops, so it has been the focus of research. In general, the insects present innate immune system, which come with a range of immune responses against microorganisms. Many antimicrobial peptides have been isolated and characterized from model insects such as Drosophila melanogaster and Bombyx mori. In the 5th instar larvae of Diatraea saccharalis has already been reported a protein of Gloverin family with antimicrobial activity. Considering these facts, the objectives of this study were to determine the protein profile of hemolymph larvae from Diatraea sacharalis at 5th instar challenged with Escherichia coli (ATCC 11224) and Bacillus subtilis (ATCC 6623), identify differentially expressed proteins and polypeptides by analyzing the proteomic data, and verifying the antimicrobial activity of crude extract on plates by inhibition of microbial growth. Proteins from the hemolymph of larvae of D. sacharalis challenged and unchallenged were extracted. The samples were quantified and subjected to two-dimensional electrophoresis (2-DE) to obtain a proteomic profile of native hemolymph, challenged by E. coli and B. subtilis. Each gel showed an average of 300 protein spots and 92 spots were correspondents in these gels on three conditions. Were taken 41 different protein spots from gels, these spots were digested with trypsin and analyzed by mass spectrometry of the type MALDI-TOF/TOF. In this analysis, it was possible to identify 10 proteins from MS and MS/MS spectra. Among these proteins were expressed by induction with both bacteria such as chitinase and antimicrobial peptides: protein homologous to the turandot (turandot the like-protein), protein homologous to attacin (Attacin like-protein), and protein homologous peptidoglycan recognition. Another antimicrobial peptide was found, the homologous to β-defensin (β-defensin-like protein), induced only in the hemolymph of the larvae challenged by B. subtilis. A homologous protein Cyclophilin (Cyclophilin-like protein) was found in the hemolymph of larvae challenged and non-challenged. In addition, were also found proteins with hatching activity, hydrolytic not characterized and hypothetical protein of unknown function. Additionally, it also tested the antimicrobial activity of crude extracts from the hemolymph, by testing inhibition of microbial growth plate area, and this analysis was observed inhibition of growth of B. subtilis with the hemolymph extract from larvae challenged with B. subtilis. This is the first analysis of proteomic profile of hemolymph of a major agricultural pest, which verified the expression of some proteins with several functions and four related proteins immune response. These results contribute to the understanding of the immune system D. saccharalis under condition of infection. / Diatraea saccharalis é um importante inseto praga da cana-de-açúcar e de outras culturas agrícolas, por isso, tem sido foco de pesquisas. De uma forma geral, os insetos apresentam sistema imunológico inato, que os provêm com uma gama de respostas imunológicas contra microrganismos. Inúmeros peptídeos antimicrobianos têm sido isolados e caracterizados a partir de insetos modelo, como Bombyx mori e Drosophila melanogaster. Em larvas de 5º ínstar de Diatraea saccharalis já foi reportada uma proteína da família Gloverina com atividade antimicrobiana. Considerando estes fatos, os objetivos deste trabalho foram determinar o perfil de proteínas da hemolinfa de larvas de Diatraea sacharalis em 5º ínstar desafiadas com Escherichia coli (ATCC 11224) e Bacillus subtilis (ATCC 6623), identificar proteínas e polipeptídios diferencialmente expressos através da análise dos dados proteômicos, e verificar a atividade antimicrobiana do extrato bruto em placas por meio da inibição do crescimento microbiano. Foram extraídas proteínas da hemolinfa de larvas de D. sacharalis desafiadas e de não desafiadas. As amostras foram quantificadas e submetidas à eletroforese bidimensional (2-DE) para obtenção de um perfil proteômico da hemolinfa nativa, de larvas desafiadas por E. coli e B. subtilis. Cada gel apresentou em média 300 spots protéicos e 92 destes spots eram correspondentes nos géis nas três condições. Foram retirados 41 spots protéicos diferentes dos géis, estes spots foram digeridos com tripsina e analisados por espectrometria de massas do tipo Maldi-ToF/ToF. Nesta análise, foi possível identificar 10 proteínas a partir dos espectros MS e MS/MS. Entre elas, proteínas que foram expressas pela indução com ambas as bactérias, como a quitinase, e os peptídeos antimicrobianos: proteina homóloga à turandot A (turandot A like-protein), proteina homóloga à Atacina (Attacin like-protein), proteína homóloga de reconhecimento de peptideoglicano. Outro peptídeo antimicrobiano encontrado, o homólogo à β-defensina (β-defensin like-protein), foi induzido somente na hemolinfa das larvas desafiadas por B. subtilis. Uma proteína homológa á Ciclofilina (Cyclophilin like-protein) foi encontrada na hemolinfa da larvas desafiadas e não-desafiadas. Além disso, também foram encontradas proteínas com atividade de eclosão, hidrolítica, não caracterizada e proteína hipotética com função desconhecida. Adicionalmente, foi também testada a atividade antimicrobiana dos extratos brutos da hemolinfa, pelo ensaio de zona de inibição do crescimento microbiano em placa, e nesta análise, foi verificada a inibição do crescimento de B. subtilis com o extrato da hemolinfa de larvas desafiadas com B. subtilis. Esta é a primeira análise do perfil proteômico da hemolinfa de uma importante praga agrícola, na qual verificou-se a expressão de algumas proteínas com funções diversas e quatro proteínas relacionadas a resposta imunulógica. Estes resultados contribuem para a compreensão do sistema imunológico da D. saccharalis sob condição de infecção.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-05-02T11:52:03Z No. of bitstreams: 1 julianeaparecidamarinhoduque.pdf: 731257 bytes, checksum: 33e3fa7ee51026581b189b467b6e0740 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-05-12T15:52:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 julianeaparecidamarinhoduque.pdf: 731257 bytes, checksum: 33e3fa7ee51026581b189b467b6e0740 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T15:52:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 julianeaparecidamarinhoduque.pdf: 731257 bytes, checksum: 33e3fa7ee51026581b189b467b6e0740 (MD5) Previous issue date: 2012-05-07 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A malária é uma importante doença tropical com distribuição mundial. A doença é causada por protozoários do gênero Plasmodium que infectam humanos e outras espécies animais. Modelos experimentais de infecção por Plasmodium berghei NK65A (PbNK65A) em camundongos Balb/c auxiliam na compreensão da doença humana. A resposta imune à malária é extremamente complexa. Os macrófagos apresentam-se como importantes células no combate ao estágio eritrocítico do parasito. O trabalho buscou avaliar diferentes aspectos da função destas células durante a infecção por PbNK65. Os resultados demonstraram que a parasitose não altera a frequência relativa da população de macrófagos peritoneais nos camundongos. Porém, os animais infectados, apresentaram maior expressão de moléculas co-estimuladoras, principalmente CD80, e expressiva redução da capacidade de fagocitar hemácias parasitadas ao longo da infecção. A produção da IL-12, citocina importante para ativação da resposta celular também foi intensamente prejudicada pelo parasito no decorrer da infecção. Diante dos resultados, podemos sugerir que a infecção por Plasmodium berghei NK65 interfere na resposta imune inata, e esta pode ser atribuída ao caráter negativo da infecção sobre o macrófago, que possui suas principais funções alteradas, como a fagocitose e a produção de IL-12. Ainda que a co-estimulação seja preservada e até elevada neste modelo, é insuficiente para o hospedeiro gerar uma resposta celular eficiente que limitaria a proliferação de Plasmodium e, sobretudo, a morte do hospedeiro. / Malaria is a major tropical disease with worldwide distribution. The disease is caused by protozoa of the genus Plasmodium which infects humans and other animal species. Experimental models of infection by Plasmodium berghei NK65A (PbBNK65A) in Balb/c mice is important in the understanding of human disease. Immune response to malaria configures itself extremely, involving different elements. Macrophages are important cells against the erythrocytic parasite stage. Thus, the study aimed to evaluate different aspects of macrophage functions during infection by PbNK65A. The results showed that the parasite does not alter the frequency on peritoneal macrophages. However, the infected animals showed higher expression of coestimulatory molecules, mainly CD80 and significant reduction in the ability to phagocytosis infected erythrocytes during the infection. The production of IL-12 cytokine, important for activation of the cellular response, was also affected during infection. Thus, we suggest that infection by Plasmodium affects the innate immune response, and this can be attributed to the negative character of the infection on the macrophages, which has changed its principal functions, such as phagocytosis and IL-12 production. Although co-stimulation is preserved and even higher in this model, is insufficient to generate a host cell response that limits the proliferation of Plasmodium, and especially the host death.