La present tesi doctoral és un compendi dels treballs publicats en revistes científiques d'àmbit internacional durant el transcurs del període formatiu de tercer cicle a la Universitat Autònoma de Barcelona. Durant aquest període s'han dissenyat noves metodologies (seqüències de pulsos) de Ressonància Magnètica Nuclear basades en l'espectroscòpia bidimensional de detecció inversa. Aquestes es discuteixen tant des d'un punt de vista teòric del desenvolupament metodològic així com des del punt de vista de nova aplicabilitat. S'han fet aven?os en diferents camps d'investigació: la polarització creuada heteronuclear en mostres líquides, els mètodes d'estat de spin selectiu i mètodes amb adquisició simultània de diferents espectres. I s'ha demostrat la seva utilitat en el camp de l'elucidació estructural de molècules orgàniques i biomolècules. / The present thesis is a compendium of the work published in international scientific journals during the formative period of third cycle at the Universitat Autònoma de Barcelona. During this period new Nuclear Magnetic Resonance methodologies (pulse sequences) based on inverse detection spectroscopy have been developed. Those are discussed from the theoretical point of view of the methodological development as well as from the point of view of new application. Advances at different research fields have been performed: heteronuclear cross polarization in liquid state, spin state selective methodologies and methods for the simultaneous acquisition of two spectra within a single experiment. The utility of the new pulse sequences herein presented is demonstrated for the structural analysis of biomolecules and organic compounds.

La present tesi doctoral es situa a l'àmbit de la recerca de nous mètodes per a la síntesi enantioselectiva i la determinació de la puresa enantiomérica.En un primer apartat s'han sintetitzat dos nous receptors quirals tipus pinça i s'ha realitzat el seu estudi estructural i conformacional mitjançant RMN i mecànica molecular. S'ha assajat la seva capacitat enantiodiferenciadora utilitzant-los com a agents de solvatació quiral (CSA) en RMN en front de diversos soluts, amb resultats força satisfactoris. S'ha estudiat alguns dels complexos formats amb la conclusió que l'augment en l'enantiodiferencació respecte a CSA similars sense cavitat quiral no es deu a un augment significatiu de la constant d'equilibri sinó a factors geomètrics. Canvis a l'espectre de protó del CSA permeten deduir que la complexació indueix canvis conformacionals del receptor, per tant sembla que aquest compost tipus pinça molecular tingui capacitat d'adaptació al guest. En un segon apartat s'ha sintetitzat un dienòfil quiral derivat de l'alcohol de Pirkle i s'ha assajat l'enantioselectivitat obtinguda a la reacció de Diels-Alder amb diferents diens. S'ha realitzat l'estudi estructural del dienòfil i els aductes obtinguts, i s'ha deduït que la inducció quiral en presència de EtAlCl2 com a catalitzador es deu la formació d'un complex entre el catalitzador i una conformació preferent del dienòfil que afavoreix l'atac per una cara del doble enllaç. S'ha estudiat l'efecte de diversos factors com la temperatura, el dissolvent, el catalitzar, etc. sobre l'excés enatiomèric obtingut i s'han optimitzat les condicions de reacció perquè el procés global impliqui el mínim nombre de passos possible. Finalment, en el tercer apartat de la tesi, s'ha desenvolupat nou mètode que permet mesurar l'excés enantiomèric de diversos alcohols utilitzant RMN de deuteri en cristalls liquids quirals. L'alcohol es deutera mitjançant simple intercanvi en un solvent pròtic deuterat i s'enregistra l'espectre en fase anisòtropa quiral a baixa temperatura. Aquest intercanvi es pot realitzar al mateix tub de RMN, però cal encara optimitzar les condicions d'aquest procés. / This thesis deals with the development of new methods in asymmetric synthesis and determination of the enantiomerical purity. In the first part of the thesis, two molecular tweezers were synthesized by simple esterification from fumaryl chloride and enantiopure ?,?'-bis(trifluorometil)-9,10-antracendimethanol. The capacity of enantiodiscrimination of these tweezers was determined for different chiral solutes, achieving very satisfactory results. The binding constant with 1-phenyl-1,2-ethandiol was determined by the equimolar method and diffusion experiments, but no important differences between the values of both diastereomeric complexes were found. This shows that the enantiomeric discrimination results from a different geometry, rather than from a different stability of the complexes. The stoichiometry of the complexes, studied by Job's method, is 1:1.In the second part of the thesis, a chiral dienophile was synthesized from commercial compounds, fumaryl chloride and chiral CSA 1-(9-antril)-2,2,2-trifluoroethanol, and characterized by NMR. Cicloadditions with different diens were realized, obtaining high diastereomeric excesses. Hydrolysis of the resulting adduct produces the enantiomerically enriched 1,2-dicarboxilic acids, esters or alcohols, depending on the reaction conditions. The global process was optimized for the dienes ciclopentadiene and isoprene. The chiral auxiliary was recuperated in 90 % yield and the final diacids were obtained after 3 steps from commercial products, in 90 % yield and 80 and >95 e.e. respectively. In reference to the third part of this thesis, different deuterated alcohols were obtained by exchange in D2O. The enantiomercal purity of these alcohols was determined quantitatively by NMR in liquid crystal phase, using a mixture of the polipeptid PBLG and dichloromethane. In a second step, the deuteration process was realized directly in the NMR tub, obtaining also very satisfactory results.

Els tumors cerebrals humans són relativament freqüents a persones d'edat avançada. El seu correcte diagnòstic té gran importància per garantir procediments terapèutics o decisió clínica adequats. La espectroscòpia per ressonància magnètica nuclear in vivo és una eina per al diagnòstic no invasiu amb gran potencial davant la sospita de lesió intracerebral. Es pot adquirir en la mateixa exploració que les imatges per ressonància magnètica amb un petit augment del temps total. En canvi, l'espectroscòpia d'alta resolució ha estat molt utilitzada en l'anàlisis d'extractes de metabòlits de biòpsies tumorals o bé de fluids corporals per a una millor resolució i separació dels diferents components moleculars de la mostra. Aquesta tesi tracta de l'anàlisi in vivo i in vitro de patrons espectrals de tumors cerebrals humans i també de lesions cístiques associades a aquests tumors. L'anàlisi d'espectres in vivo ha emprat també la metodologia de reconeixement de patrons espectrals. En l'estudi de lesions cístiques, hem desenvolupat un classificador automàtic basat en patrons espectrals in vivo per distingir entre lesions malignes, benignes i abscessos. Els líquids cístics han estat estudiats quimicament. S'han detectat àcid siàlic i àcid hexurònic, compostos moltes vegades presents a elements macromoleculars de matriu extracel·lular. S'han realitzat extraccions de metabòlits solubles en àcid perclòric (PCA) dels líquids per observar-ne el patró espectral. Els principals resultats d'aquest apartat són que el senyal observat in vivo a 2,03 ppm, generalment associat a N-acetilaspartat, correspon en bona part a un element macromolecular, possiblement siàlic associat a proteïnes. S'han analitzat els patrons in vivo i en dissolucions model a camp clínic (1,5 Teslas) de mio-inositol i glicina, donada la seva importància en la gradació de tumors astrocítics i en la discriminació d'altres tipus tumorals com hemangiopericitomes i meningiomes, i s'ha dissenyat una corba de calibració amb dissolucions model per determinar les quantitats relatives de cadascun a l'espectre in vivo. Això permetrà la comparació d'aquests valors amb els obtinguts a l'anàlisi de biòpsies in vitro. En aquest apartat, s'ha comprovat que la quantitat relativa de mio-inositol disminueix amb l'augment del grau tumoral. També es van plantejar, a l'anàlisi de patrons espectrals a camp clínic, fórmules discriminatòries experimentals ("classificadors"), com la basada en mio-inositol/glicina i lípids per a discriminar glioblastoma de metàstasis amb una millora de la discriminació diferencial per 22% dels casos de glioblastoma. Les anàlisis in vitro s'han fet mitjançant extraccions de metabòlits solubles en PCA amb posterior avaluació del patró espectral mitjançant una anàlisi estadística, per detectar metabòlits útils en la discriminació futura de tipus tumorals difícils de diferenciar en exploracions in vivo. A més, s'han realitzat tests preliminars de reconeixement de patrons espectrals in vitro. S'han obtingut les evidències per entendre les diferències observades in vivo. Finalment, la detecció de concentracions de glicina in vivo als tumors astrocítics de grau baix, més reduïda que la obtinguda in vitro, suggereix una restricció de la mobilitat de la glicina al teixit intacte, possiblement degut a la seva associació amb macromolècules cel·lulars. A més, aquesta Tesi també tracta de la col·laboració al desenvolupament d'una eina d'auxili al diagnòstic de tumors cerebrals, basada en patrons espectrals de RMN de 1H, anàlisi d'imatges per ressonància magnètica, anatomies patològiques i dades clíniques, associada al projecte INTERPRET (International Network for Pattern Recognition of Tumours using Magnetic Resonance, http://carbon.uab.es/INTERPRET). Aquesta eina es troba en procés de certificació industrial i està sent sotmesa a avaluació en diferents centres clínics. / Human cerebral tumours are relatively frequent neoplasms. access to closed cranial spaces is difficult and then proper diagnositc is important to ensure correct therapeutic proceedings.In vivo magnetic resonance spectroscopy is an important diagnostic tool for abnormal intracraneal masses. Spectra can be acquired in the same magnetic resonance imaging exploration, with little additional time. On the other hand, high resolution spectroscopy, by another hand, has been widely used in perchloric extracts analysis and for body liquids and fluids to achieve a better resolution and separation of different sample compounds. This thesis deals with the in vivo and in vitro analyses of spectral patterns of human cerebral tumours and also cystic lesions associated with these tumours or with infectious abscesses. Pattern recognition techniques have also been applied to in vivo spectral analyses of data. We have developed an automatized classifier based in the spectral pattern recorded in vivo from cystic lesions to distinguish between malignant and benign tumours and abscesses. Cystic fluids have also been chemically analysed and we have found sialic and hexuronic acids, often present in macromolecular components of the extracellular matrix. We have also carried out perchloric acid (PCA) extraction of soluble metabolites of cyst fluids to characterize its spectral pattern. Main results of this part were that the 2,03 ppm signal in vivo, generally attributed to N-acetyl aspartate, is mainly due to a macromolecular component, possibly protein-bound sialic acid. Furthermore, we have analysed in vivo and model solution spectral patterns (clinical field, 1,5 Teslas) of myo-inositol (mI) and glycine (gly), due to their possible importance in astrocytic tumour grading and also for discrimination of other tumoral types as hemangioperycitomas and meningiomas. We have also designed a calibration curve with model solutions to calculate de mI/gly in in vivo spectra. This has allowed comparison of these values with in vitro ones, obtained from biopsy PCA extractanalyses. In this part, we have verified that the relative concentration of myo-inositol decreases with increasing tumoral grade. In in vivo spectral pattern analysis, we have also proposed experimental discriminative formulas (classifiers), as one based in myo-inositol/glycine and lipids, to discriminate glioblastomas from metastasis with an improvement of discrimination in 22% of the glioblastoma cases. In vitro analyses have been carried out with PCA-soluble metabolites, with further evaluation of spectral pattern by means of statistical analyses, in order to detect metabolites potentially useful in discrimination of tumoral types difficult to be performed in toward?¿? clinical practice. Moreover, preliminary studies with pattern recognition techniques on the in vitro data have been started. These studies will provide evidence-based facts to understand the in vivo detected differences. We have confirmed previous results, such as the high myo-inositol concentration in hemangioperycitomas, being a very important differential diagnostic feature. Finally, detection of the in vivo apparent glycine concentration in astrocytic tumours, lower than the in vitro detected concentration, suggests a reduction of glycine mobility in intact tissue, possibly due to its association with cell macromolecules. This thesis also describes the collaboration in the development of a decision-support-system to aid cerebral tumour diagnosis, based in 1H-RMN spectral patterns, magnetic resonance imaging analysis, anatomical pathology and clinical data, associated to the INTERPRET project (International Network for Pattern Recognition of Tumours using Magnetic Resonance, http://carbon.uab.es/INTERPRET). This system is presently in process of industrial certification and its performance is being evaluated at several clinical centres.

Nuclear Magnetic Resonance has experienced an increasing interest in the drug discovery field that has led to its wide use on nearly every stage of drug development. For this reason, during the present thesis we propose to use some of the tools offered by NMR to target various systems related with cancer.Initially we intended to get acquainted with the NMR most outstanding methodologies for the detection and characterization of binding events; and for this goal various proteins involved in cellular apoptosis (XIAP and Bcl-XL) were used to set up both ligand and receptor based NMR experiments. First we developed two novel labeling methodologies for the selective NMR observation of Trp, which coupled to the use of receptor-based experiments provided insight in the characterization of XIAP-ligand complexes, as well as significant advantages for HTS. Later, ligand based experiments such as STD, WaterLOGSY and iLOE were applied to the screening of weak binders for Bcl-XL, and the resulting information applied to the reconstruction of dual binders in a fragment-based drug discovery approach. In a second stage the same NMR tools were applied to the development of protein-protein interaction inhibitors, in particular for the pro-angiogenic protein VEGF; and to this end two different strategies were proposed. First, a small diverse library of D-oligopeptides was screened for weak ligands using the former fragment-based strategy. A second approach consisted on the identification of active compounds in complex plant extract mixtures using a combination of methionine selective labeling schemes and receptor-based experiments. In the latter case various flavonoids were identified as VEGF binders and the information harvested from NMR experiments allowed us to propose a binding mode for this type of molecules.Lastly, in a much more classic context, we decided to attempt the characterization of a medium sized oligopeptide by NMR. In particular we focused on Kahalalide F a marine origin depsipeptide with very promising anticancer activity; and although a SAR profile would be very useful from a medicinal chemistry perspective such molecules still pose a challenge to their structural characterization particularly stemming from its intrinsic flexibility. Several media were explored including H2O, DMSO, and membrane mimics (SDS micelles); in the latter the peptide seems to adopt a preferred structure allowing us to propose a model for the monomeric insertion of Kahalalide F within membrane-like environments. Such a model supports that part of the peptide's cytotoxic activity occurs at a membrane level and that this activity is linked to the formation of a turn within its N-terminus section. / La resonancia magnética nuclear se utiliza en la actualidad en prácticamente todas las etapas del proceso de descubrimiento y caracterización de fármacos. Durante la presente tesis nos propusimos explorar estas facetas de la RMN tomando como modelo diferentes sistemas relacionados con cáncer.En primer lugar utilizamos proteínas involucradas en apoptosis (XIAP y Bcl-XL) para implementar varias metodologías de RMN para la caracterización de fenómenos de interacción intermolecular. Se pusieron a punto esquemas de marcaje selectivo de triptófano y se evaluó su aplicabilidad en procesos de cribado de compuestos. Otros experimentos de cribado masivo (STD, WaterLOGSY) se emplearon para identificar nuevos ligandos de Bcl-XL; posteriormente, estrategias de reconstrucción de fragmentos nos permitieron diseñar ligandos duales.Las mismas herramientas se utilizaron para el diseño y desarrollo de moléculas antiangiogénicas, inhibidoras de la interacción entre VEGF y sus receptores. Para este fin, se plantearon dos estrategias diferentes en la identificación de inhibidores: en primer lugar se pretendía diseñar un ligando peptídico de afinidad elevada partiendo de dipéptidos de menor afinidad y utilizando estrategias de reconstrucción de fragmentos. Una segunda estrategia consistía en la identificación de compuestos activos presentes en extractos de plantas utilizando esquemas de marcaje selectivo para VEGF, en concreto marcaje selectivo de metioninas. En este último caso se consiguieron identificar varios compuestos flavonoides capaces de interaccionar con VEGF y su modo de unión se caracterizó utilizando información derivada de experimentos de RMN.Por último se llevo a cabo la caracterización estructural de Kahalalido F mediante RMN. Este depsipéptido de origen marino se encuentra en la actualidad en fases clínicas de desarrollo contra varios tipos de cáncer, y su caracterización estructural presenta enorme interés en la comprensión de su modo de acción. Se exploraron las preferencias conformacionales del péptido en varios medios incluyendo: H2O, DMSO, y medios miméticos de membrana (micelas SDS). El péptido adopta una estructura preferente en presencia de micelas de SDS, lo que nos permiten proponer un modelo estructural para la inserción monomérica de Kahalalido F en entornos de membrana lipídica; esto sugiere que parte de su actividad citotóxica ocurre a nivel de membrana para lo cual la formación de un giro  en la sección N-terminal del péptido también parece relevante.

Las enfermedades cardiovasculares (ECVs) son la principal causa de mortalidad en el mundo Occidental. El interés de prevenir y tratar las ECVs ha desencadenado un rápido desarrollo de los sistemas de adquisición de imágenes médicas. Por este motivo, la cantidad de datos de imagen recolectados en las instituciones de salud se ha incrementado considerablemente. Este hecho ha aumentado la necesidad de herramientas automatizadas para dar soporte al diagnóstico, mediante una interpretación de imagen confiable y reproducible. La tarea de interpretación requiere traducir los datos crudos de imagen en parámetros cuantitativos, los cuales son considerados relevantes para clasificar la condición cardiaca de un paciente. Para realizar tal tarea, los métodos basados en modelos estadísticos de forma han recibido favoritismo dada la naturaleza tridimensional (o 3D+t) de las imágenes cardiovasculares. Deformando el modelo estadístico de forma a la imagen de un paciente, el corazón puede analizarse de manera integral. Actualmente, el campo de las imágenes cardiovasculares esta constituido por diferentes modalidades. Cada modalidad explota diferentes fenómenos físicos, lo cual nos permite observar el órgano cardiaco desde diferentes ángulos. El personal clínico recopila todas estas piezas de información y las ensambla mentalmente en un modelo integral. Este modelo integral incluye información anatómica y funcional que muestra un cuadro completo del corazón del paciente. Es de alto interés transformar este modelo mental en un modelo computacional capaz de integrar la información de manera global. La generación de un modelo como tal no es simplemente un reto de visualización. Requiere una metodología capaz de extraer los parámetros cuantitativos relevantes basados en los mismos principios técnicos. Esto nos asegura que las mediciones se pueden comparar directamente. Tal metodología debe ser capaz de: 1) segmentar con precisión las cavidades cardiacas a partir de datos multimodales, 2) proporcionar un marco de referencia único para integrar múltiples fuentes de información, y 3) asistir la clasificación de la condición cardiaca del paciente. Esta tesis se basa en que los modelos estadísticos de forma, y en particular los Modelos Activos de Forma, son un método robusto y preciso con el potencial de incluir todos estos requerimientos. Para procesar múltiples modalidades de imagen, separamos la información estadística de forma de la información de apariencia. Obtenemos la información estadística de forma a partir de una modalidad de alta resolución y aprendemos la apariencia simulando la física de adquisición de otras modalidades. Las contribuciones de esta tesis pueden ser resumidas así: 1) un método genérico para construir automáticamente modelos de intensidad para los Modelos Activos de Forma simulando la física de adquisición de la modalidad en cuestión, 2) la primera extensión de un simulador de Resonancia Magnética Nuclear diseñado para producir estudios cardiacos realistas, y 3) un método novedoso para el entrenamiento automático de modelos de intensidad y de fiabilidad aplicado a estudios cardiacos de Resonancia Magnética Nuclear. Cada una de estas contribuciones representa un artículo publicado o enviado a una revista técnica internacional. / Cardiovascular diseases (CVDs) are the major cause of death in the Western world. The desire to prevent and treat CVDs has triggered a rapid development of medical imaging systems. As a consequence, the amount of imaging data collected in health care institutions has increased considerably. This fact has raised the need for automated analysis tools to support diagnosis with reliable and reproducible image interpretation. The interpretation task requires to translate raw imaging data into quantitative parameters, which are considered relevant to classify the patient’s cardiac condition. To achieve this task, statistical shape model approaches have found favoritism given the 3D (or 3D+t) nature of cardiovascular imaging datasets. By deforming the statistical shape model to image data from a patient, the heart can be analyzed in a more holistic way. Currently, the field of cardiovascular imaging is constituted by different modalities. Each modality exploits distinct physical phenomena, which allows us to observe the cardiac organ from different angles. Clinicians collect all these pieces of information to form an integrated mental model. The mental model includes anatomical and functional information to display a full picture of the patient’s heart. It is highly desirable to transform this mental model into a computational model able to integrate the information in a comprehensive manner. Generating such a model is not simply a visualization challenge. It requires having a methodology able to extract relevant quantitative parameters by applying the same principle. This assures that the measurements are directly comparable. Such a methodology should be able to: 1) accurately segment the cardiac cavities from multimodal datasets, 2) provide a unified frame of reference to integrate multiple information sources, and 3) aid the classification of a patient’s cardiac condition. This thesis builds upon the idea that statistical shape models, in particular Active Shape Models, are a robust and accurate approach with the potential to incorporate all these requirements. In order to handle multiple image modalities, we separate the statistical shape information from the appearance information. We obtain the statistical shape information from a high resolution modality and include the appearance information by simulating the physics of acquisition of other modalities. The contributions of this thesis can be summarized as: 1) a generic method to automatically construct intensity models for Active Shape Models based on simulating the physics of acquisition of the given imaging modality, 2) the first extension of a Magnetic Resonance Imaging (MRI) simulator tailored to produce realistic cardiac images, and 3) a novel automatic intensity model and reliability training strategy applied to cardiac MRI studies. Each of these contributions represents an article published or submitted to a peer-review archival journal.