Reductionist biology has yielded tremendous insight into the basis of biochemistry and genetic disease. However, the remarkable failure of reductionist biology to explain complex problems, especially cancer, has led to the development of systems biology. The vast complexity of biological systems remains the most difficult problem in biology today. In order to understand this complexity, we need tools to massively multiplex measurements of a signaling network. Therefore, we developed lysate microarray technology to fill this need. In this work, we discuss three ways in which lysate microarrays were applied to human disease. In the first work, we discuss a key stage in malaria development. The liver-stage malaria parasite represents a promising target for intervention, and we present the first use of lysate microarray technology as a screening tool for host-parasite interactions in an infectious disease. We identified three cancer-related pathways that are modified in malaria infection, and studied the p53 pathway in depth. Our finding that the parasite downregulates p53 and that treatment with Nutlin-3 strongly decreases parasite load may lead to the development of a prophylactic malaria vaccine. In the second work, we began by screening drug combinations and varying dosing schedule in triple-negative breast cancers (TNBCs). We systematically explored stimulation space and collected a large lysate microarray dataset, which was used for statistical analysis. We identified a sensitization effect when a growth factor signaling inhibitor was presented before a genotoxic agent. This sensitization was generalizable among a subset of TNBCs and may generally be important for cancers driven by growth factor signaling, as we found the effect extends to nonTNBC cancers. We hope this data will be useful in guiding cancer treatment strategies in patients. In the third work, we study the changing role of the DNA Damage Response (DDR) as a cell line evolves towards cancer. We used the MCF10A progression series and studied how these cell lines respond to genotoxic agents. We identified differences in cell fates after treatment, and collected a large lysate microarray dataset for statistical analysis. Early analysis of the data indicates gross rewiring within the DDR between the MCF10A cell lines.

Background: The biological mechanisms underlying early-and advanced-stage epithelial ovarian cancers (EOCs) are still poorly understood. This study explored kinase-driven metabolic signalling in early and advanced EOCs, and its role in tumour progression and response to carboplatin-paclitaxel treatment. Methods: Tumour epithelia were isolated from two independent sets of primary EOC (n-72 and 30 for the discovery and the validation sets, respectively) via laser capture microdissection. Reverse phase protein microarrays were used to broadly profile the kinase-driven metabolic signalling of EOC with particular emphasis on the LBK1-AMPK and AKT-mTOR axes. Signalling activation was compared between early and advanced lesions, and carboplatin-paclitaxel-sensitive and -resistant tumours. Results: Advanced EOCs were characterised by a heterogeneous kinase-driven metabolic signature and decreased phosphorylation of the AMPK-AKT-mTOR axis compared to early EOC (P<0.05 for AMPK alpha T172, AMPK alpha 1 S485, AMPK beta 1 S108, AKT S473 and T308, mTOR S2448, p70S6 S371, 4EBP1 S65, GSK-3 alpha/beta S21/9, FOXO1 T24/FOXO3 T32, and FOXO1 S256). Advanced tumours with low relative activation of the metabolic signature and increased FOXO1 T24/FOXO3 T32 phosphorylation (P=0.041) were associated with carboplatin-paclitaxel resistance. Conclusions: If validated in a larger cohort of patients, the decreased AMPK-AKT-mTOR activation and phosphorylation of FOXO1 T24/FOXO3 T32 may help identify carboplatin-paclitaxel-resistant EOC patients.

Submitted by MARCIA ROVADOSCHI (marciar@unifra.br) on 2018-08-16T19:52:36Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_MauberEduardoSchultzMoreira.pdf: 14104089 bytes, checksum: cdd198bace6b9a1b1e4ce9262baded58 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-16T19:52:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_MauberEduardoSchultzMoreira.pdf: 14104089 bytes, checksum: cdd198bace6b9a1b1e4ce9262baded58 (MD5) Previous issue date: 2015-03-23 / Cancer is a public health problem of great impact. Relapses require higher doses of drugs or new approaches to minimizing toxicity. The use of liposome-based carrier systems pharmaceuticals may be an alternative by the use of the enhanced permeability and retention effect present in the tumor area. The aim of this project was to develop and characterize liposomes containing arsenic trioxide (ATO). They were prepared according reverse phase evaporation method using ethyl acetate (EA) as solvent followed by ultrasonication with probe to reduce the size and homogenization. In determining the arsenic, titanium and residual EA we used Atomic Absorption Spectrometry with Graphite Furnace (GF- AAS), Mass Spectrometry Inductively Coupled Plasma (ICP -MS) and Gas Chromatography coupled to mass detector (GC-MS), respectively. We also carried out stability studies with formulations being subjected to room temperature (25° C), cooling (4 to 8° C) and climate chamber (40° C and 60% humidity) for a period of 90 days. Cytotoxicity assays were performed by the method of reduction of 3- (4,5) dimetiltialzoil 2,5 - diphenyltetrazolium bromide (MTT). Data of physical-chemical characterization showed that the best condition was sonication with a power of 750 W, 40% amplitude and cycles of 8 seconds on and 2 seconds off, to avoid overheating. The average particle size was 87.5±1.07 nm and polydispersity index (IPD) 0.28±0.03 for liposomes blank (BL) and 71.17±0.06 nm and 0.29±0.04 for liposomes containing TOA (LAs / LAS). TOA content of LAs was 1.0 mg ml-1 and the encapsulation efficiency (%EE) of 7,43±0.72%. ICP-MS showed the presence of titanium in the formulation and the determination of the residual solvent was below the tolerable limit. The stability study showed that formulations remained stable over a period of 30 days, regardless of storage condition wherein the stored under refrigeration remained stable for 60 days. Cytotoxicity assays with MTT revealed that in 72 hours the LB, AE and the buffer did not exercise death activity. The reverse phase evaporation method followed by ultrasonication appears to be suitable for obtaining liposomal vesicles containing arsenic trioxide . / Câncer é um problema de saúde pública de grande impacto. As recidivas necessitam de doses maiores de fármacos ou de novas abordagens para minimizar a toxicidade. O uso de sistemas carreadores de fármacos baseados em lipossomas pode ser uma alternativa por fazer uso do efeito permeabilidade e retenção aumentada presente na área do tumor. O objetivo desta dissertação foi desenvolver e caracterizar lipossomas contendo trióxido de arsênio (TOA). Foi utilizado o método de evaporação em fase reversa com solvente acetato de etila (AE) seguido de ultrassonicação com sonda para reduzir o tamanho e homogeinização. Na determinação do arsênio, titânio e acetato de etila residual utilizaram-se as técnicas de Espectrometria de Absorção Atômica com Forno de Grafite (GF- AAS), Espectrometria de Massa com Plasma Indutivamente Acoplado (ICP-MS) e Cromatografia a Gás acoplado a detector de massa (GCMS), respectivamente. Foi realizado também estudo de estabilidade com as formulações sendo submetidas a temperatura ambiente (25°C), refrigeração (4 a 8°C) e câmara climática (40°C e umidade de 60%), por um período de 90 dias. Os ensaios de citotoxicidade foram realizados pelo método de redução do 3-(4,5) dimetiltialzoil-2,5 difeniltetrazolium (MTT). Os dados da caracterização físico-química mostraram que a melhor condição de sonicação foi com potência de 750 W, amplitude de 40% e ciclos de 8 segundos ligado e 2 segundos desligado, para evitar o aquecimento. O tamanho médio foi de 87,5 ± 1,07 nm e índice de polidispersão (IPD) 0,28 ± 0,03 para os lipossomas branco (LB) e 71,17 ± 0,06 nm e 0,29 ± 0,04 para os lipossomas contendo TOA (LAs/LAS), respectivamente. O teor de TOA nos LAs foi de 1,0 mg mL-1 e a eficiência de encapsulação (%EE) de 7,43 ± 0,72%. O ICP-MS revelou a presença de titânio nas formulações e a determinação do solvente residual ficou abaixo do limite tolerável. O estudo de estabilidade mostrou que as formulações permaneceram estáveis por um período de 30 dias, independente da condição de armazenamento, sendo que as armazenadas sob refrigeração permaneceram estáveis por 60 dias. Os ensaios de citotoxicidade com MTT revelaram que em 72 horas os LB, AE e a solução tampão não exerceram atividade de morte. O método de evaporação em fase reversa seguido de ultrassonicação parece ser adequado para a obtenção de vesículas lipossomais contendo trióxido de arsênio.

Orientadores: Sergio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T20:51:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RomeroVargas_FreyFrancisco_D.pdf: 4482249 bytes, checksum: 951ba98ea20426e2308c178f17a7680d (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Uma nova miotoxina fosfolipase A2 (BtTX-II) foi purificada a partir do veneno total de Bothriopsis taeniata através de dois passos cromatográficos, envolvendo inicialmente cromatografia de exclusão molecular, seguida de HPLC de fase reversa. BtTX-II foi caracterizada bioquimicamente através de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) mostrando uma única banda eletroforética com massa relativa (Mr) de 14000 Da, em condições não reduzidas e reduzidas (DTT 1M). A pureza e massa molecular foram confirmadas por espectrometria de massa (MALDI-Tof MS), a qual determinou uma massa molecular de 13889,98 Da. BtTX-II apresentou atividade catalítica de 12,075 ± 0,138 nmoles/mg/min em presença do substrato cromogênico específico ácido 4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoico. Análise de composição de aminoácidos da PLA2 (BtTX-II) corroborou seu caráter básico. A análise dos peptídeos trípticos foi determinada por ESI-QTof-MS/MS espectrometria de massa e as regiões contendo peptídeos internos mostraram semelhança com outras PLA2s miotóxicas botrópicas cataliticamente ativas. BtTX-II, pertencente à classe PLA2 D49, exibiu atividade ótima a pH 8,0 e temperatura de 37 ºC. Na ausência de Ca2+ e na presença de alguns íons divalentes, tais como Mg2+, Mn2+, Zn2+ e Cd2+ (10mM), a atividade fosfolipásica foi significativamente diminuída. Também foi demonstrado o efeito inibitório de crotapotinas crotálicas sobre a atividade PLA2 da BtTX-II. O efeito neurotóxico da BtTX-II foi analisado através de estudos miográficos em preparações neuromusculares "ex vivo", mostrando que BtTX-II induz um leve bloqueio na junção neuromuscular em preparações Biventer cervicis de pintainho. Tais preparações foram utilizadas para o estudo morfológico quantitativo da BtTX-II, o que mostrou uma leve atividade miotóxica "in vitro" com a concentração de 50?g de BtTX-II. O efeito miotóxico também foi avaliado através de ensaios de liberação de creatina kinase plasmática e análise histopatológica do músculo gastrocnêmio de camundongo "in vivo", com estes últimos testes foram observandos maiores mudanças morfológicas quando comparadas aos estudos "in vitro", mostrando estar diretamente relacionada com a liberação de CK. BtTX-II induz miotoxicidade local após injeção intramuscular, mas não produz miotoxicidade sistêmica após injeções intravenosa. O efeito edematogênico foi estudado através do modelo coxim plantar de camundongo e mostrou ser elevado nas primeiras horas após injeções subcutâneas, em todas as concentrações aplicadas (1- 20 ?g). O efeito citotóxico "in vitro" foi caracterizado utilizando uma cultura celular da linhagem de mioblastos/miotubos de músculo esquelético de camundongo. BtTX-II não induz citotoxicidade em mioblastos; mas BtTX-II evidenciou atividade citotóxica em miotubos, em uma concentração padrão de 20 ?g. Nossos resultados sugerem que BtTX-II atua no processo de regeneração muscular em baixas concentrações (10 ?g) durante o período de 28 dias após as injeções intramusculares no gastrocnêmio de camundongo, demonstrando ser apropriado para a análise na regeneração muscular, pois induz necrose e não acarreta lesão do tecido vascular nem nervoso, o que é de suma importância para o processo de regeneração muscular. Isto foi possível pela presença de células satélite envolvidas neste processo junto com o infiltrado inflamatório notório em todos os períodos da regeneração / Abstract: A new miotoxin phospholipase A2 (BtTX-II) was purified from Bothriopsis taeniata crude venom through two steps cromatográficos, involving molecular exclusion chromatography, as first step, and followed by RP-HPLC. BtTX-II, was characterized biochemically through electrophoresis in polyacrylamide gel (SDS-PAGE) showing a single eletrophoretic band, in reduced and not reduced conditions, with relative mass (Mr) of 14000 Da. The purity and molecular mass was confirmed by mass spectrometry mass (Maldi-Tof SM), showed a molecular mass of 13889.98 Da. BtTX-II showed catalytic activity of 12.075 ± 0.138 nmoles/mg/min upon of the specific chromogenic substrate acid 4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic. Analysis of aminoacid composition of PLA2 (BtTX-II) corroborated its basic character. Tryptic peptide analyse were determined for ESI-QTof-MS/MS mass spectrometry and the regions containing internal peptides showed similarity with other miotoxic botropics PLA2s. BtTX-II belonging to the class PLA2 D49 exhibited an optimal activity in pH 8.0 and at 37 ºC. In the absence of Ca2+ and in presence of some divalent íons such Mg2+, Mn2+, Zn2+ and Cd2+ (10mM), the phospholipasic activity was significantly decreased. Also, it was demonstrated the inhibitory effect of crotalics crotapotins upon activity PLA2 of the BtTX-II. The neurotoxic effect of the BtTX-II was analized through myographic studies in neuromuscular preparations "ex vivo", showing that BtTX-II induce a light blockade at the neuromuscular junction on chicken Biventer cervicis preparations. Such preparations were used for quantitatives morphologic studies, were shown a light myotoxic activity "in vitro" at higher concentration. On the other hand, the myotoxic effect was evaluated through release of plasmatic creatine kinase "in vivo" and was carry out histophatologic analyzes mouse gastrocnemius muscle, with these last tests were observed larger morphologic changes when compared to studies "in vitro", showing directly related with the CK liberation. BtTX-II induces local miotoxicity after intramuscular injection, but it did not produce systemic miotoxicity after intravenous injections. The edematogenic effect was studied through the model mouse paw edema and showed to be high in the first hours after subcutaneous injections, in all applied concentrations (1-20 ?g). The cytotoxic effect "in vitro" was characterized using a cell culture of the rodent lineage of myoblasts/myotubes cells. BtTX-II did not induce citotoxicity in skeletal muscle myoblasts; however, BtTX-II showed cytotoxic activity in myotubes, both with a standard concentration of 20 ?g. Our results suggest that BtTX-II act in the process of muscular regeneration in low concentrations (10 ?g) during a period of 28 days after intramuscular injections in the mouse gastrocnemius muscle, This effect was to be appropriate for muscular regeneration analyzes because it induces necroses and it did not carry out lesion of the vascular nor nervous tissue, thus, it is of supreme importance for the process of muscular regeneration. Those results were possible by the presence of satellite cells involved in these processes together with notorious inflammatory infiltrate in every periods of the regeneration / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

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Prédire la capacité de développement et d'implantation des embryons reste un enjeu majeur pour l’Assistance Médicale à la Procréation (AMP). L’AMP doit répondre au désir du couple d’avoir un enfant en limitant les risques encourus par la mère et l’enfant en cas de grossesse multiple. Tous les laboratoires d’AMP utilisent des critères morphologiques pour évaluer la compétence au développement des embryons en dépit de la faible valeur prédictive de cette analyse. L'interaction ovocyte-cumulus participe à l’acquisition par l'ovocyte de sa compétence au développement. Cette interaction met en jeu l’expression de gènes spécifiques dans les cellules de cumulus (CCs). Notre objectif était d'identifier des marqueurs non invasifs de la compétence ovocytaire au développement. Ainsi nous avons recherché au niveau des CCs des gènes et des protéines exprimés en fonction de l’aptitude de l’ovocyte fécondé à atteindre le stade de blastocyste. L'expression des gènes des CCs a été étudiée par puce à ADN et qPCR haut débit. Après avoir tenu compte de la variabilité des patientes, nous avons identifié les gènes RGS2, POLR3K et CUL4B comme biomarqueurs. L'expression des protéines des CCs a été étudiée par puce à protéines et après validation des anticorps ciblant les protéines d'intérêt, les protéines RGS2, POLR3K et MERTK ont été identifiées comme biomarqueurs de la compétence au développement de l'ovocyte. Ces résultats permettent d’envisager la création d’un modèle prédictif multicritère incluant la morphologie de l’embryon à J2, les gènes et protéines marqueurs. / The ability to predict the developmental and implantation ability of embryos remains a major goal in human assisted reproductive technology (ART).ART should allow couple to become parents while limiting the risks to the mother and the child in case of multiple pregnancy. ART laboratories use morphological criteria to evaluate the oocyte competence despite the poor predictive value of this analysis. The oocyte-cumulus interaction helps the oocyte to acquire its developmental competence partly through the expression of specific genes at the cumulus level. Therefore our aim was to identify at the level of cumulus cells (CCs) genes and proteins related to oocyte developmental competence as non-invasive marker. Gene expression of CCs was studied using microarray and high throughput qPCR according to the developmental competence of the oocyte (ability to reach the blastocyst stage after fertilization). While taking into account the patient variability we identified RGS2, POLR3K and CUL4B as biomarkers at RNA level. Then protein expression of CCs was studied using Reverse Phase Protein Array. After validation of the antibodies targeting the proteins of interests, RGS2, POLR3K and MERTK were identified as protein biomarkers of the developmental competence of the oocyte. These results lead us to consider a multi variables predictive model including the morphology of the embryo at J2, genes and protein markers.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-29T13:14:34Z No. of bitstreams: 1 ana-paula-araujo.pdf: 1867740 bytes, checksum: ab9d7b2866753474ebe7ecb95d8e32d9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-29T13:14:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana-paula-araujo.pdf: 1867740 bytes, checksum: ab9d7b2866753474ebe7ecb95d8e32d9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A eritropoetina (EPO) é um hormônio produzido, principalmente, pelos rins, que regula a produção de células vermelhas do sangue. Trata-se de uma glicoproteína com 166 aminoácidos, três sítios de N-glicosilação e um de O-glicosilação. Apresenta massa molecular na faixa de 30-34 kDa, sendo aproximadamente 40% correspondente aos glicídeos. A EPO está disponível como agente terapêutico produzido através da tecnologia do DNA recombinante em cultura de células de mamíferos. A EPO humana recombinante (rHuEPO) é usada para o tratamento de anemia associada à insuficiência renal crônica. Devido a relevância médica da rHuEPO, sua produção está sendo nacionalizada através do processo de transferência de tecnologia do Centro de Inmunología Molecular (CIM), de Cuba, para o Instituto de Tecnologia de Imunobiológicos (Bio-Manguinhos)/FIOCRUZ. O controle de qualidade sobre o processo produtivo da rHuEPO e seu produto final é bastante rigoroso. Neste contexto, o mapeamento peptídico é um dos mais importantes ensaios usados no controle em processo da produção de proteínas recombinantes. Este ensaio assegura a integridade da estrutura primária das proteínas ao final das etapas de suas purificações. Sendo assim, o objetivo desta dissertação de mestrado foi definir uma metodologia de mapeamento peptídico da rHuEPO, visando o controle de processo da produção deste biofármaco em Bio-Manguinhos. Previamente, a preparação da rHuEPO fornecida pelo CIM foi avaliada quanto a sua homogeneidade e caracterizadapor eletroforeses em gel de poliacrilamida, cromatografia de fase reversa, cromatofocalização eespectrometria de massa. Para obter os peptídeos da rHuEPO, a hidrólise enzimática desta glicoproteína com a enzima tripsina foi avaliada em diferentes tempos de incubação e com relações enzima/substrato distintas. O fracionamento dos peptídeos foi feito por cromatografia líquida de fase reversa em coluna C18, empregando-se diferentes colunas cromatográficas e gradientes de eluição. As principais frações peptídicas isoladas da cromatografia de fase reversa foram analisadas por espectrometria de massa a fim de comprovar a identidade dos peptídeostrípticos da rHuEPO. A especificidade da metodologia desenvolvida foi avaliada através da comparação dos perfis peptídicos do hidrolisado tríptico da rHuEPO e do quimotripsinogênio A. A hidrólise tríptica usando-se relação enzima/substrato de 1/50 (p/p), concentração de rHuEPO de 1 mg/mL e incubação de 1 hora a 37o C hidrolisou mais de 99% da glicoproteína. As colunas cromatográficas de fase reversa Hi-Pore RP 318, Vydac 218TP C18 e Delta Pak C18 se mostraram aptas para o fracionamento dos peptídeos trípticos da rHuEPO. Em comparação à metodologia usada no CIM, o tempo de incubação de hidrólise foi reduzido em, pelo menos,2 horas e a duração da corrida cromatográfica para obtenção do mapa peptídico diminuiu em, pelo menos, 1 hora e 42 minutos. Na análise por espectrometria de massa das frações isoladas da cromatografia de fase reversa, seis peptídeos trípticos da rHuEPO foram observados. Tais frações peptídicas foram identificadas como pertencentes à EPO humana pelo programa Mascot Search Results. Dessa forma, ficou estabelecida uma metodologia de mapeamento peptídico especifica, simples e rápida para ser utilizada no controle em processo da produção da rHuEPO em Bio-Manguinhos. / Erythropoietin (EPO) is a hormone produced mainly by the kidney that regulates the production of red blood cells. It is a glycoprotein with 166 amino acids, three N-glycosylation and one O-glycosylation sites. It has a molecular weight in the range of 30-34 kDa, being approximately 40% of its content corresponding to carbohydrates. EPO is available as a therapeutic agent produced by recombinant DNA technology in mammaliancell culture. The recombinant human EPO (rHuEPO) is used to treat anemia associated with chronic renal disease. Due to rHuEPO medical relevance, its production technology is a subject of transference from the Centro de Inmunología Molecular(CIM), Cuba, to the Instituto de Tecnologia em Imunonobiologicos(Bio-Manguinhos)/FIOCRUZ. The quality control over production process of rHuEPO and its final product is quite rigorous. In this context, peptidemapping is one of the most important tests used in process control of recombinant proteins production. This test ensures the primary structure integrity of a protein after its purification processes. Thus, the objective of this dissertation was to define a methodology for peptide mapping of rHuEPO aiming to be used in the process control of this biopharmaceutical production in Bio-Manguinhos. Previously, the preparation of rHuEPO provided by CIM was characterized by polyacrylamidegel electrophoresis, reversed phase chromatography, chromatofocusing and mass spectrometry. In order to obtain rHuEPO peptides, the enzymatic hydrolysis of this glycoprotein with the enzyme trypsin was assessed at differents incubation times and enzyme/substrate ratio. Peptides fractionation was performed by reverse phase liquid chromatography, using distincts C18 columns and elution gradients. The main peptide fractions from reversed phase chromatography were analyzed by mass spectrometry to confirm the identity of rHuEPO tryptic peptides. The specificity of the developed methodology was evaluated by comparing peptides profiles from rHuEPO and Chymotrypsinogen A tryptic hydrolysates. The tryptic digestion using enzyme/substrate ratio of 1/50 (w/w), substrate concentration of 1 mg/mL and incubation for 1 hour at 37°C hidrolysated more than 99% of the glicoprotein. The reversed phase columns Hi-Pore RP318, Vydac 218TP C18 e Delta Pak C18 were able to fractionate the rHuEPO tryptic peptides. Compared to the methodology used in CIM, the hydrolysis incubation time was reduced by at least 2 hours and the chromatographic running time to obtain the peptide map was decreased by at least 1 hour and 42 minutes. The mass spectrometry analysis of the fractions isolated from reversed-phase chromatography showed six tryptic peptides of rHuEPO. These peptide fractions were identified as belonging to human EPO by the program Mascot Search Results. Thus it was established an specific, simple and fast peptide mapping methodology to use in process control of rHuEPO in Bio-Manguinhos.

Submitted by MARCIA ROVADOSCHI (marciar@unifra.br) on 2018-08-17T19:52:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_FernandaReisFavarin.pdf: 2215176 bytes, checksum: f94c01cb7f3e20eec81ca0cf6c5bf3bd (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-17T19:52:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_FernandaReisFavarin.pdf: 2215176 bytes, checksum: f94c01cb7f3e20eec81ca0cf6c5bf3bd (MD5) Previous issue date: 2017-05-11 / Ascorbic acid (AA) is a water soluble vitamin and also is widely used as an antioxidant in the food, chemical and pharmaceutical industry. Among vitamins, this chemical compost is known as one of the most unstable, due to its stability can be affected by temperature, oxidation, light, enzymes, pH and metal catalysts. With the use of nanotechnology, the AA can be encapsulated in liposomes, which play the role of a shield, protecting the AA from all those factors mentioned above. The liposomes are biocompatible and biodegradable vesicular structures formed by bilayers of phospholipids around an aqueous core, but more unstable than other nanoparticles. The purpose of the liposomes usage is to protect the AA from degradation. Thus, this work aims to prepare liposomes containing ascorbic acid, to characterize and to analyze its antioxidant activity. First, an analytical method for the quantification of ascorbic acid by high performance liquid chromatography (HPLC) was co-validated. After co-validation, liposomal formulations containing 1 mg/mL ascorbic acid (LIP-A) and blank liposomal formulations (LIP-B) - without the active ingredient - were prepared for comparison using the reverse phase evaporation method. After preparation of these formulations, they were characterized according to their refractive index, average particle diameter, polydispersity index (PDI), zeta potential, pH, content, encapsulation efficiency, stability and, DPPH• and ABTS• free radical scavenging activity. In stability, three formulations were prepared and each formulation was divided into three vials, each vial was stored in a different condition. Here are the conditions: climatic chamber (40 0 °C), room temperature (25 2 °C) and refrigerator (4 1 °C). Through the results of the co-validation it was possible to realize that the ascorbic acid‘s quantification method is linear, specific and precise and, can be used for the quantification of ascorbic acid in LIP-A. The prepared liposomes presented 161 6 nm of mean vesicle diameter, a 0,231 0,02 polydispersity index, -7.3 1,1 mV zeta potential, 3,2 0,04 pH and a 19 1,1% encapsulation efficiency. The initial AA content of LIP-A was 1 mg/mL , and the initial antioxidant activity of LIP-A was 12.0 1,1 mMol and 11.4 1,4 mmol of TE/ml for the DPPH• and ABTS• radicals, respectively. The content and free radical scavenging activity varied according to the condition in which LIP-A were stored (climatic chamber, room temperature or refrigerator), because the AA’s stability depends on temperature in which it is stored. During the stability analysis, it was possible to see that LIP-B in climatic chamber condition presented instability from 15º on, while LIP-A remained stable till day 30. These results suggest that the AA, It is suggested that AA as an antioxidant leaves the liposomes more stable. The best condition for the LIP-A storage was the refrigerator one. In this condition the liposome remained stable for 30 days regarding to its mean diameter, PDI, zeta potential and pH. This condition also presented a higher content and antioxidant activity for longer than in the other ones. / O ácido ascórbico (AA) é uma vitamina hidrossolúvel e um antioxidante amplamente utilizado pela indústria alimentícia, química e farmacêutica. Entre as vitaminas, é conhecida como uma das mais instáveis, pois sua estabilidade pode ser afetada pela temperatura, oxigênio, luz, enzimas, pH e catalisadores metálicos. O AA pode ser protegido destes fatores sendo encapsulado em lipossomas, através da nanotecnologia. Os lipossomas são estruturas vesiculares formadas por bicamadas de fosfolipídios ao redor de um núcleo aquoso, são vesículas biocompatíveis e biodegradáveis, mas são mais instáveis. O objetivo da utilização de lipossomas neste trabalho é que estas vesículas protejam o AA da degradação. Sendo assim, a proposta deste trabalho é preparar lipossomas contendo ácido ascórbico, caracterizá-los e analisar sua atividade antioxidante. Primeiramente foi co-validado um método analítico para a quantificação de ácido ascórbico por cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE). Após a co-validação foram preparadas formulações lipossomais contendo ácido ascórbico (LIP-A) na concentração de 1 mg/mL e formulações lipossomais brancas – sem o ativo (LIP-B) para fins de comparação, através do método de evaporação em fase reversa. Após a preparação destas formulações, elas foram caracterizadas de acordo com seu índice de refração, diâmetro médio de partícula, índice de polidispersão (IPD), potencial zeta, pH, teor, eficiência de encapsulação, atividade sequestrante de radicais livres DPPH• e ABTS• e estabilidade. Na estabilidade foram preparadas três formulações e cada formulação foi dividida em três frascos, cada frasco foi armazenado em uma condição diferente: câmara climática (40 0 °C), temperatura ambiente (25 2 °C) e geladeira (4 1 °C). Através dos resultados da co-validação foi possível perceber que o método para quantificação do ácido ascórbico é linear, específico e preciso e pode ser utilizado para a quantificação de ácido ascórbico em LIP-A. Os lipossomas preparados apresentaram 161 6 nm de diâmetro médio de vesícula, 0,231 0,02 de índice de polidispersão, - 7,3 1,1 mV de potencial zeta, 3,2 0,04 de pH e uma eficiência de encapsulação de 19 1,1 %. O teor de AA inicial do LIP-A foi de 1 mg/mL, e a atividade antioxidante inicial do LIP-A para o radical DPPH foi de 12,0 1,1 μMol de TE/mL e para o ABTS 11,4 1,4 μMol de TE/mL. O teor e a atividade antioxidante variaram de acordo com a condição em que os LIP-A foram armazenados (câmara climática, temperatura ambiente ou geladeira), pois a estabilidade do AA depende da temperatura em que ele é armazenado. Durante as análises de estabilidade foi possível perceber que o LIP-B na condição de câmara climática ficou instável a partir do 15º, enquanto o LIP-A permaneceu estável até o dia 30, sugere-se que o AA por ser um antioxidante deixou os lipossomas mais estáveis. A melhor condição para o armazenamento do LIP-A foi em geladeira, nesta condição os lipossomas se mantiveram estáveis em relação ao seu diâmetro médio, IPD, potencial zeta e pH por 30 dias. E apresentou um maior teor e atividade antioxidante por mais tempo que nas outras condições.

L’intérêt grandissant porté au cours de ces dix dernières années aux monolithes organiques pour des applications électroséparatives se justifie en partie par leur préparation aisée au sein de systèmes miniaturisés, le large choix des monomères précurseurs disponibles, ainsi que la possibilité d’ajuster les paramètres structuraux du matériau final par un contrôle judicieux des conditions opératoires. Au cours de ce travail, la synthèse de nouvelles phases monolithiques a été mise au point selon une stratégie en deux étapes. Dans une première étape, la copolymérisation radicalaire photo-initiée du Nacryloxysuccinimide avec le diméthacrylate d’éthylène glycol réalisée en présence de toluène, a permis l’élaboration de monolithes macroporeux réactifs et hautement perméables. La présence d’esters de succinimide dans la structure chimique du monolithe polymère a été mise à profit pour fonctionnaliser la surface du monolithe par des greffons de nature variée par réaction de substitution nucléophile faisant intervenir des dérivés aminés. Le choix judicieux des greffons a permis la mise au point rapide de phases stationnaires présentant des propriétés électrochromatographiques ciblées. Ainsi, le contrôle du caractère hydrophobe des supports obtenus par greffage d’alkylamines de taille variable a été mis en évidence par la séparation de dérivés benzéniques selon un mécanisme à polarité de phase inversée avec de très bonnes efficacités (200000 plateaux par mètre). L’utilisation de phases stationnaires monolithiques greffées par des sélecteurs aromatiques a été proposée comme alternative aux monolithes aliphatiques hydrophobes. La synthèse de monolithes organiques hydrophiles a été possible par la fonctionnalisation du support réactif par des alkyldiamines. La préparation d’une phase stationnaire chirale a été réalisée selon une approche originale de chimie click consistant à immobiliser un dérivé de cyclodextrine. Dans le but d’étendre l’application des monolithes à base de NAS au greffage de biomacromolécules, une nouvelle matrice monolithique incorporant dans sa structure chimique un co-monomère hydrophile a été élaborée. Les résultats préliminaires ont montré que l’augmentation du caractère hydrophile du squelette monolithique permet d’accroître sensiblement la réactivité des esters de Nhydroxysuccinimide en milieu aqueux / The continuously growing interest observed over the past ten years in the field of organic monoliths dedicated to electroseparation applications is mainly due to their easy preparation methods which are also well-suited to the development of miniaturized systems, the wide range of available monomers and the possibility of tuning the structural parameters of the final material by a judicious control of the synthesis conditions. In the present work, the synthesis of new monolithic stationary phases has been developed using a two-stage strategy. In a first step, the photo-initiated free radical copolymerization of Nacryloxysuccinimide with ethylene glycol dimethacrylate was performed in the presence of toluene allowing the preparation of reactive and macroporous monoliths with high permeability properties. The presence of succinimide esters in the chemical structure of the polymer monolith was used to functionalize the surface of the monolith by various grafts through nucleophilic substitution reaction involving amino derivatives. The judicious choice of the grafts permits the fast development of stationary phases with target electrochromatographic properties. Indeed, the tuning of the hydrophobic nature of the monolithic materials was obtained by the grafting of varied alkylamines and was demonstrated by the separation of benzene derivatives by reversed phase mechanism with very good efficiencies (200 000 plates per meter). The use of monolithic stationary phases grafted with aromatic selectors has been proposed as an alternative to the aliphatic-grafted hydrophobic monoliths. The synthesis of organic hydrophilic monoliths was possible by functionalization of the reactive support by alkyldiamines. The preparation of a chiral stationary phase was performed using an original click chemistry approach involving the immobilization of a cyclodextrin derivative. With the aim to extend the application range of NAS-based monoliths to the grafting of biomacromolecules for selective capture and enzymatic digestion applications, a new monolithic matrix incorporating in its chemical structure a hydrophilic comonomer was prepared. Preliminary results showed that the increase in the hydrophilic character of the polymeric skeleton allows increasing significantly the reactivity of N-hydroxysuccinimide esters in aqueous medium

The adulteration of phytotherapic formulations has been increasing considerably in the recent years in several countries, by the fact that there is not an established efficient monitoring for the control of the manipulation and commercialization of the so called natural medicines . As the possibility of adulteration is relatively wide in terms of compound classes, the need of analytical methods with good sensitivity and selectivity, which are able to identify and quantify simultaneously more than one pharmaceutical in the same phytotherapic formulation, is very important. Considering the well known effects of these adulterants and its use and abuse in the formulations for weigh loss, two separations methods were developed in this study to enable the study of benzodiazepines alprazolam, clonazepam, chlordiazepoxide, diazepam, flurazepam, lorazepam, medazepam and midazolam as possible adulterants in phytotherapic formulations. For the electrophoretic method the optimized conditions were: buffer phosphate 100 mM, 15% acetonitrile (pH 2,0) as an electrolyte; fused silica capillary coated with a 60 cm layer of polymida (9,5 cm to the detector window) with 75 Um of internal diameter, operating at 25 °C; 15 kV of applied voltage, UV detection at 200 nm and anodic hydrodynamic injection for 2 seconds with a pressure of 30 mbar. The chromatographic method was optimized as the following conditions: eluent acetonitrile: water 40:60 (v / v) (pH 4,0) at flow 0,5 mL/min, UV detection at 230 nm and injection of 20 μL. The adulteration in these phytotherapic formulations occurs usually with the use of only one pharmaceutical class: a benzodiazepine, a anorexic and a antidepressant. It is not expected to find in the same sample more than one benzodiazepine. Therefore, the eletroforetic and chromatography proposed methods do not have the objective to detect all of benzodiazepines together in a same sample, but rather to promote the individual identification of all in a sample. The RP-HPLC method was validated for the determination of these benzodiazepines and applied for the determination of the adulterants in phytotherapic formulations used in the treatment of obesity, which have been commercialized as natural medicines by Brazilian pharmacies. The recovery experiments promoted recoveries values higher than 84,25 % for all the analyzed adulterants. The developed methods introduced high sensitivity, analytical precision, low cost and rapid analysis, confirming the applicability of the methods as an alternative for the control and monitoring of abuse use of these pharmaceuticals in phytotherapic formulations passible of adulteration. / A adulteração de formulações fitoterápicas tem aumentado consideravelmente nos últimos anos em alguns países, pelo fato de que ainda não há uma fiscalização eficiente estabelecida para o controle da manipulação e comercialização dos chamados medicamentos naturais . Como a possibilidade de adulteração é relativamente ampla em termos de classes de compostos, surge assim, a necessidade de métodos analíticos de boa seletividade e sensibilidade, capazes de identificar e quantificar simultaneamente mais de um fármaco na mesma formulação fitoterápica. Sabendo-se dos efeitos indesejados que esses adulterantes podem causar, além da necessidade de alertar a sociedade sobre os perigos do uso e abuso desses adulterantes nas formulações para emagrecimento, desenvolveu-se neste trabalho dois métodos de separação, para possibilitar o estudo da presença dos benzodiazepínicos alprazolam, clonazepam, clordiazepóxido, diazepam, flurazepam, lorazepam, medazepam e midazolam como possíveis adulterantes em produtos fitoterápicos: eletroforese capilar de zona (CZE) e cromatografia líquida de alta eficiência por fase reversa (RP-HPLC). Para o método eletroforético as condições otimizadas foram: eletrólito de trabalho tampão fosfato 100 mM, 15% acetonitrila (pH 2,0); capilar de sílica fundida revestido de poliimida de 60 cm de comprimento (com 9,5 cm da janela do detector) com diâmetro interno de 75 Um, operando a 25°C; voltagem aplicada de 15 kV; detecção UV em 200 nm e injeção hidrodinâmica anódica durante 2 segundos com pressão de 30 mBar. O método cromatográfico foi otimizado na seguinte condição: eluente acetonitrila:água 40:60 (v/v) (pH 4,0) em fluxo 0,5 mL/min; detecção UV em 230 nm e injeção de 20 μL. As adulterações nestas formulações fitoterápicas ocorrem, geralmente, com o uso de somente uma classe de fármacos: um benzodiazepínico, um anorexígeno e um antidepressivo. Não se espera encontrar em uma mesma amostra mais de um benzodiazepínico, portanto, os métodos eletroforéticos e cromatográficos propostos não têm como objetivo detectar todos os benzodiazepínicos juntos em uma mesma amostra e sim, promover a identificação individual de todos em uma amostra. O método de RP-HPLC foi validado para a determinação desses benzodiazepínicos e empregado na análise de formulações fitoterápicas utilizadas no tratamento da obesidade, as quais são comercializadas como medicamentos naturais por farmácias de manipulação brasileiras. Os ensaios de recuperação realizados promoveram recuperações acima de 84,25 % para todas as espécies de adulterantes analisadas. Os métodos desenvolvidos apresentaram alta sensibilidade, precisão analítica, baixo custo e análises rápidas, comprovando a aplicabilidade dos mesmos como uma alternativa para o controle e fiscalização do uso abusivo destes fármacos presentes em formulações fitoterápicas passíveis de adulteração.