Jaburetox (Jbtx) é um peptídeo de 10 kDa derivado de uma das isoformas de urease de Canavalia ensiformis. Em um estudo anterior realizado com o triatomíneo vetor da doença de Chagas Triatoma infestans, esse peptídeo foi encontrado interagindo com a proteína UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (UAP), alterando também sua atividade enzimática no sistema nervoso central, in vivo e in vitro. A UAP já foi encontrada em eucariotos, bactérias e vírus, estando relacionada com as rotas de produção de quitina, N-glicosilação e síntese de glicoinositolfosfolipídeos. Assim, o presente trabalho tem três objetivos: i) investigar o efeito de Jbtx sobre a atividade enzimática e a expressão gênica da UAP do inseto modelo Rhodnius prolixus, ii) clonar e expressar a UAP e iii) estudar a UAP filogeneticamente. Para a primeira parte, foram avaliados, no triatomíneo R. prolixus, a atividade enzimática da UAP e o perfil de expressão dessa enzima e da quitina sintase em insetos controles e alimentados com Jbtx. Para a segunda, o cDNA da enzima de R. prolixus foi clonado em vetor pET-15b e expressado em Escherichia coli Rosetta 2. A purificação da enzima recombinante foi feita por cromatografia de afinidade a níquel. Para a terceira parte, foram buscadas sequências de aminoácidos homólogas às da UAP de R. prolixus no servidor pHmmer e foi construída uma árvore filogenética com o método de Máxima Verossimilhança. Os resultados obtidos indicam que o Jbtx aumenta a atividade enzimática da UAP em glândulas salivares, corpo gorduroso e epiderme, enquanto diminui a expressão da UAP em intestino médio anterior, túbulos de Malpighi, glândulas salivares, corpo gorduroso, epiderme e sistema nervoso central, assim como a expressão da quitina sintase nos mesmos órgãos e no intestino médio posterior. Foi obtida uma UAP recombinante de 56 kDa, compatível com peso molecular previsto in silico. A árvore filogenética construída contém 40 sequências, sendo 38 de insetos e 2 sequências de grupo externo. A árvore segue o padrão de evolução dos insetos e foi identificado um novo organismo com potenciais dois genes codificantes de UAP. Esse trabalho apresenta a primeira evidência de que Jbtx altera a expressão gênica em R. prolixus. O resultado obtido pela análise filogenética indica que a UAP é uma enzima ancestral à diversificação em Insecta. / Jaburetox (Jbtx) is a 10 kDa peptide derived from a urease isoform of Canavalia ensiformis. In a previous work with the triatomine vector of Chagas’ disease Triatoma infestans, this peptide was found interacting with the protein UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase (UAP), also increasing the UAP enzymatic activity in the central nervous system in vivo and in vitro. UAP has been described in eukaryotes, bacteria and virus, and is involved in chitin production, N-linked glycosylation and glyco inositol phospholipids synthesis pathway. Thus, the present work has three main aims: i) to understand the effect of Jbtx on this enzyme on the model insect Rhodnius prolixus, ii) to clone and express UAP and iii) to study UAP from a phylogenetic point of view. Firstly, UAP enzymatic activity and its expression profile, as well as the chitin synthase expression, were analysed in the triatomine R. prolixus in saline- or Jbtx-fed insects. Secondly, the cDNA from R. prolixus’ UAP was cloned into the pET-15b vector and expressed in Escherichia coli Rosetta 2. The recombinant enzyme was purified through a nickel affinity chromatography. Thirdly, homolog sequences to R. prolixus’ UAP were searched in pHmmer database and a phylogenetic tree was built using the Maximmum Likelihood method. The results obtained indicate that Jbtx increases UAP enzymatic activity in salivary glands, fat body and epidermis, while decreasing UAP’s expression in the anterior and posterior midgut, Malpighian tubules, salivary glands, fat body, epidermis and central nervous system, as well as the chitin synthase expression in the same organs and the posterior midgut. A 56 kDa recombinant UAP was obtained, in agreement with the in silico estimated size. The phylogenetic tree built has 40 sequences, from which 38 are from insects and 2 are from mammals (external group). The tree follows the insect evolution patterns and a new organism containing two potential UAP coding genes was identified. This work presents the first evidence that Jbtx is able to interfere in the gene expression in R. prolixus. The results obtained through phylogenetic analysis shows that UAP is an enzyme ancestral to the diversification in Insecta.

Jaburetox (Jbtx) é um peptídeo de 10 kDa derivado de uma das isoformas de urease de Canavalia ensiformis. Em um estudo anterior realizado com o triatomíneo vetor da doença de Chagas Triatoma infestans, esse peptídeo foi encontrado interagindo com a proteína UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (UAP), alterando também sua atividade enzimática no sistema nervoso central, in vivo e in vitro. A UAP já foi encontrada em eucariotos, bactérias e vírus, estando relacionada com as rotas de produção de quitina, N-glicosilação e síntese de glicoinositolfosfolipídeos. Assim, o presente trabalho tem três objetivos: i) investigar o efeito de Jbtx sobre a atividade enzimática e a expressão gênica da UAP do inseto modelo Rhodnius prolixus, ii) clonar e expressar a UAP e iii) estudar a UAP filogeneticamente. Para a primeira parte, foram avaliados, no triatomíneo R. prolixus, a atividade enzimática da UAP e o perfil de expressão dessa enzima e da quitina sintase em insetos controles e alimentados com Jbtx. Para a segunda, o cDNA da enzima de R. prolixus foi clonado em vetor pET-15b e expressado em Escherichia coli Rosetta 2. A purificação da enzima recombinante foi feita por cromatografia de afinidade a níquel. Para a terceira parte, foram buscadas sequências de aminoácidos homólogas às da UAP de R. prolixus no servidor pHmmer e foi construída uma árvore filogenética com o método de Máxima Verossimilhança. Os resultados obtidos indicam que o Jbtx aumenta a atividade enzimática da UAP em glândulas salivares, corpo gorduroso e epiderme, enquanto diminui a expressão da UAP em intestino médio anterior, túbulos de Malpighi, glândulas salivares, corpo gorduroso, epiderme e sistema nervoso central, assim como a expressão da quitina sintase nos mesmos órgãos e no intestino médio posterior. Foi obtida uma UAP recombinante de 56 kDa, compatível com peso molecular previsto in silico. A árvore filogenética construída contém 40 sequências, sendo 38 de insetos e 2 sequências de grupo externo. A árvore segue o padrão de evolução dos insetos e foi identificado um novo organismo com potenciais dois genes codificantes de UAP. Esse trabalho apresenta a primeira evidência de que Jbtx altera a expressão gênica em R. prolixus. O resultado obtido pela análise filogenética indica que a UAP é uma enzima ancestral à diversificação em Insecta. / Jaburetox (Jbtx) is a 10 kDa peptide derived from a urease isoform of Canavalia ensiformis. In a previous work with the triatomine vector of Chagas’ disease Triatoma infestans, this peptide was found interacting with the protein UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase (UAP), also increasing the UAP enzymatic activity in the central nervous system in vivo and in vitro. UAP has been described in eukaryotes, bacteria and virus, and is involved in chitin production, N-linked glycosylation and glyco inositol phospholipids synthesis pathway. Thus, the present work has three main aims: i) to understand the effect of Jbtx on this enzyme on the model insect Rhodnius prolixus, ii) to clone and express UAP and iii) to study UAP from a phylogenetic point of view. Firstly, UAP enzymatic activity and its expression profile, as well as the chitin synthase expression, were analysed in the triatomine R. prolixus in saline- or Jbtx-fed insects. Secondly, the cDNA from R. prolixus’ UAP was cloned into the pET-15b vector and expressed in Escherichia coli Rosetta 2. The recombinant enzyme was purified through a nickel affinity chromatography. Thirdly, homolog sequences to R. prolixus’ UAP were searched in pHmmer database and a phylogenetic tree was built using the Maximmum Likelihood method. The results obtained indicate that Jbtx increases UAP enzymatic activity in salivary glands, fat body and epidermis, while decreasing UAP’s expression in the anterior and posterior midgut, Malpighian tubules, salivary glands, fat body, epidermis and central nervous system, as well as the chitin synthase expression in the same organs and the posterior midgut. A 56 kDa recombinant UAP was obtained, in agreement with the in silico estimated size. The phylogenetic tree built has 40 sequences, from which 38 are from insects and 2 are from mammals (external group). The tree follows the insect evolution patterns and a new organism containing two potential UAP coding genes was identified. This work presents the first evidence that Jbtx is able to interfere in the gene expression in R. prolixus. The results obtained through phylogenetic analysis shows that UAP is an enzyme ancestral to the diversification in Insecta.

Jaburetox (Jbtx) é um peptídeo de 10 kDa derivado de uma das isoformas de urease de Canavalia ensiformis. Em um estudo anterior realizado com o triatomíneo vetor da doença de Chagas Triatoma infestans, esse peptídeo foi encontrado interagindo com a proteína UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (UAP), alterando também sua atividade enzimática no sistema nervoso central, in vivo e in vitro. A UAP já foi encontrada em eucariotos, bactérias e vírus, estando relacionada com as rotas de produção de quitina, N-glicosilação e síntese de glicoinositolfosfolipídeos. Assim, o presente trabalho tem três objetivos: i) investigar o efeito de Jbtx sobre a atividade enzimática e a expressão gênica da UAP do inseto modelo Rhodnius prolixus, ii) clonar e expressar a UAP e iii) estudar a UAP filogeneticamente. Para a primeira parte, foram avaliados, no triatomíneo R. prolixus, a atividade enzimática da UAP e o perfil de expressão dessa enzima e da quitina sintase em insetos controles e alimentados com Jbtx. Para a segunda, o cDNA da enzima de R. prolixus foi clonado em vetor pET-15b e expressado em Escherichia coli Rosetta 2. A purificação da enzima recombinante foi feita por cromatografia de afinidade a níquel. Para a terceira parte, foram buscadas sequências de aminoácidos homólogas às da UAP de R. prolixus no servidor pHmmer e foi construída uma árvore filogenética com o método de Máxima Verossimilhança. Os resultados obtidos indicam que o Jbtx aumenta a atividade enzimática da UAP em glândulas salivares, corpo gorduroso e epiderme, enquanto diminui a expressão da UAP em intestino médio anterior, túbulos de Malpighi, glândulas salivares, corpo gorduroso, epiderme e sistema nervoso central, assim como a expressão da quitina sintase nos mesmos órgãos e no intestino médio posterior. Foi obtida uma UAP recombinante de 56 kDa, compatível com peso molecular previsto in silico. A árvore filogenética construída contém 40 sequências, sendo 38 de insetos e 2 sequências de grupo externo. A árvore segue o padrão de evolução dos insetos e foi identificado um novo organismo com potenciais dois genes codificantes de UAP. Esse trabalho apresenta a primeira evidência de que Jbtx altera a expressão gênica em R. prolixus. O resultado obtido pela análise filogenética indica que a UAP é uma enzima ancestral à diversificação em Insecta. / Jaburetox (Jbtx) is a 10 kDa peptide derived from a urease isoform of Canavalia ensiformis. In a previous work with the triatomine vector of Chagas’ disease Triatoma infestans, this peptide was found interacting with the protein UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase (UAP), also increasing the UAP enzymatic activity in the central nervous system in vivo and in vitro. UAP has been described in eukaryotes, bacteria and virus, and is involved in chitin production, N-linked glycosylation and glyco inositol phospholipids synthesis pathway. Thus, the present work has three main aims: i) to understand the effect of Jbtx on this enzyme on the model insect Rhodnius prolixus, ii) to clone and express UAP and iii) to study UAP from a phylogenetic point of view. Firstly, UAP enzymatic activity and its expression profile, as well as the chitin synthase expression, were analysed in the triatomine R. prolixus in saline- or Jbtx-fed insects. Secondly, the cDNA from R. prolixus’ UAP was cloned into the pET-15b vector and expressed in Escherichia coli Rosetta 2. The recombinant enzyme was purified through a nickel affinity chromatography. Thirdly, homolog sequences to R. prolixus’ UAP were searched in pHmmer database and a phylogenetic tree was built using the Maximmum Likelihood method. The results obtained indicate that Jbtx increases UAP enzymatic activity in salivary glands, fat body and epidermis, while decreasing UAP’s expression in the anterior and posterior midgut, Malpighian tubules, salivary glands, fat body, epidermis and central nervous system, as well as the chitin synthase expression in the same organs and the posterior midgut. A 56 kDa recombinant UAP was obtained, in agreement with the in silico estimated size. The phylogenetic tree built has 40 sequences, from which 38 are from insects and 2 are from mammals (external group). The tree follows the insect evolution patterns and a new organism containing two potential UAP coding genes was identified. This work presents the first evidence that Jbtx is able to interfere in the gene expression in R. prolixus. The results obtained through phylogenetic analysis shows that UAP is an enzyme ancestral to the diversification in Insecta.

Ureases são enzimas que possuem atividades biológicas independentes de suas funções enzimáticas, como indução de exocitose e atividade inseticida. Rhodnius prolixus é um dos modelos de inseto sensíveis a essa toxicidade. Quando testada em tecidos isolados de R. prolixus, a urease de Canavalia ensiformis (JBU) causa diferentes efeitos deletérios modulados por eicosanóides. A via de biossíntese dos eicosanóides envolve fosfolipases A2 (PLA2), que são enzimas responsáveis pela liberação de ácido araquidônico (AA). Uma vez liberado, AA pode ser oxigenado na via da ciclooxigenase, a qual produz prostaglandinas (PGs). Em insetos, a resposta imune compreende as reações humoral e celular e é centralmente modulada por eicosanóides, principalmente PGs. Em busca de uma ligação entre o efeito tóxico de JBU e reações imunológicas em insetos, estudamos os efeitos desta toxina em hemócitos de R. prolixus. Descobrimos que JBU ativa a agregação de hemócitos, tanto após injeção na hemolinfa quanto em células in vitro. Em ensaios in vitro, observamos que os inibidores da síntese de eicosanóides, dexametasona e indometacina, inibem a agregação induzida por JBU, sugerindo que produtos da ciclooxigenase modulam a reação. Após hemócitos cultivados serem tratados com JBU, sítios imunorreativos anti-JBU, danos no citoesqueleto e agregação de núcleos foram observados nas células. Também identificamos e clonamos os transcritos de dois genes de PLA2s de R. prolixus, Rhopr-PLA2III e Rhopr-PLA2XII. Analisamos os perfis de expressão de ambos os genes, e observamos que os transcritos são amplamente distribuídos em vários tecidos, porém em diferentes níveis. Utilizando a estratégia de RNAi, silenciamos a expressão de Rhopr-PLA2XII em ninfas de R. prolixus em uma média de 70% entre variados tecidos. Observamos que a toxicidade de JBU foi diminuída em mais de 50% em ninfas com a expressão de Rhopr-PLA2XII diminuída, indicando que o gene está ligado ao efeito tóxico de JBU nesse inseto. No presente estudo demonstramos pela primeira vez a capacidade de uma urease de induzir a agregação de hemócitos. Da mesma forma, os genes de PLA2 aqui apresentados foram os primeiros a serem identificados e a terem seus transcritos clonados em um vetor da doença de Chagas. Nossos resultados estão de acordo com estudos anteriores que demonstraram que eicosanóides modulam a toxicidade de JBU, contribuindo para a compreensão dos mecanismos entomotóxicos de ação dessas proteínas multifuncionais. / Ureases are multifunctional enzymes that display biological activities independent of their enzymatic function, including induction of exocytosis and insecticidal effects. Rhodnius prolixus, a major vector of Chagas’ disease, is one of the known susceptible models of this toxicity. When tested in isolated tissues of R. prolixus, jack bean urease (JBU) causes different deleterious effects modulated by eicosanoids. The eicosanoid biosynthetic pathway involves phospholipase A2 (PLA2) enzymes that are responsible for releasing arachidonic acid (AA), along with other products. Once released, AA may enter different enzymatic oxygenation pathways, among which is the cyclooxygenase pathway, yielding products such as prostaglandins (PGs). In insects, the immune response comprises cellular and humoral reactions, and is centrally modulated by eicosanoids, mainly PGs. Searching for a link between JBU toxic effect and immune reactions in insects we have studied the effects of this toxin on R. prolixus hemocytes. We have found that JBU triggers aggregation of the hemocytes either after injection in the hemocoel as well as in isolated cells. In vitro assays in presence of the eicosanoid synthesis inhibitors dexamethasone and indomethacin counteracted JBU's effect, indicating eicosanoids, more specifically cyclooxygenase products, are likely to modulate the reaction. Cultured cells were treated with JBU and immune reactive sites were found in the cells along with damage to the cytoskeleton. The highest concentration of JBU used in the cultured cells also led to nuclei aggregation of adherent hemocytes. We have also identified two genes and cloned the transcripts with complete coding sequences of two PLA2s from R. prolixus, Rhopr- PLA2III and Rhopr-PLA2XII. We have analyzed their expression profiles and found the transcripts to be distributed in various tissues, but at different levels. We have knocked down 70% of Rhopr-PLA2XII expression in 5th instar R. prolixus, and JBU's toxicity was decreased by more than 50%, indicating that Rhopr-PLA2XII gene is linked to JBU's toxic effect in this insect. This was the first time effects of an urease on insect hemocytes were demonstrated. The PLA2 genes here presented were also the first to be identified and to have their transcripts cloned in a Chagas’ disease vector. Our findings support previous data demonstrating that eicosanoids modulate JBU's toxicity, and contribute to the understanding of the mechanisms of entomotoxic action of this multifunctional protein.

Orientador: João Aristeu da Rosa / Banca: Maria Tercilia Vilela de Azeredo Oliveira / Banca: Marcos Takashi Obara / Resumo: Estima-se que 6 a 7 milhões de pessoas estejam infectadas com Trypanosoma cruzi no mundo, a maioria na América Latina, sendo a transmissão vetorial responsável ainda por, aproximadamente, 80% dos casos. Atualmente são descritas 151 espécies de triatomíneos agrupadas em cincos tribos formadas por 18 gêneros. O gênero Rhodnius conta com 19 espécies de potenciais vetores, podendo veicular T. cruzi e Trypanosoma rangeli. É considerado um dos gêneros taxonomicamente mais complexos da subfamília Triatominae, devido as semelhanças morfológicas e a distribuição geográfica que podem se sobrepor entre algumas de suas espécies dificultando seu estudo, apesar das diversas técnicas empregadas para sua distinção. Com o desenvolvimento atual das técnicas moleculares tornou-se possível a caracterização de espécies de triatomíneos por meio de marcadores mitocondriais e nucleares, tendo essa se tornado uma variável a mais para a taxonomia dos triatomíneos, assim como a já utilizada morfologia e a recentemente popularizada morfometria geométrica. A adição de novas variáveis possibilita que dados já existentes possam ser comprovados e/ou corrigidos. Neste trabalho foram obtidos subsídios que ampliam o conhecimento e que agregados aos já existentes podem proporcionar uma diferenciação mais minuciosa e precisa de espécies englobadas no gênero Rhodnius, de modo a contribuir para estabelecer uma classificação mais apropriada. A obtenção dos dados foi conduzida, por meio de estudo molecular, utiliza... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Worlwide, it is estimated that 6 to 7 million people are infected with Trypanosoma cruzi, mostly in Latin America and the vector transmission is still responsible for approximately 80% of the cases. There are currently 151 described species of triatomine, grouped into five tribes, formed by 18 genres. The Rhodnius genre includes 19 species, which can transmit T. cruzi and Trypanosoma rangeli. It is considered one of the most complex taxonomically genera of Triatominae, due to its morphological similarities and geographical distribution that may overlap among some species hindering their study, despite the various techniques used for their distinction. With the current development of molecular techniques it has become possible to characterize triatomine species through mitochondrial and nuclear markers, this became one more toll for the taxonomy of triatomines, just as the already used morphology and recently popularized geometric morphometry. The addition of new variables enables the verification and or correction of existing data. This work has generated valueable data that amplify the knowledge which in addition to the existing may provide a more accurate differentiation of species included in the genre Rhodnius, in order to help establish a more appropriate classification. Data collection was performed by DNA analysis, using mitochondrial markers - cytochrome b and cytochrome oxidase I, in addition to morphological parameters, as, median process of pygophore, the anterolat... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-03-21T11:26:04Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1278550 bytes, checksum: c271b17eabe8ba087f6b1cde6cb236e2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-21T11:26:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1278550 bytes, checksum: c271b17eabe8ba087f6b1cde6cb236e2 (MD5) Previous issue date: 2015-09-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Triatomíneos são artrópodes hematófagos transmissores do Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli. É sabido que o comportamento alimentar e a transmissão de patógenos por estes vetores variam entre as diferentes espécies e são dependentes, direta ou indiretamente, de moléculas bioativas da saliva que auxiliam na interação vetor-parasito-hospedeiro. Neste sentido, caracterizamos e comparamos o repertório sialoproteômico de três importantes espécies dos principais gêneros de triatomíneos das Américas: Rhodnius prolixus, Triatoma lecticularia e Panstrongylus herreri, identificando 221 proteínas, sendo 69 de R. prolixus, 100 de T. lecticularia e 52 de P. herreri. Dentre os principais achados, encontramos a alta prevalência de nitroforinas em R. prolixus (68%) e de lipocalinas em T. lecticularia (79%) e P. herreri (49%). Neste contexto, as proteínas mais significativas por spot de R. prolixus, T. lecticularia e P. herreri mais abundantes, apresentando expressiva diferença entre as outras, foram Nitrophorin-4 (28,7%), Salivary lipocalin 5 (65,2%) e Putative triabin (20,5%), respectivamente. Outro achado significativo foi a única molécula presenta nas três espécies estudadas, a proteína não categorizada T1HT34, a qual atuaria como elo proteico entre elas, identificando-se como paráloga da Putative fry-like conserved. Os dados encontrados pela caracterização pelo Gene Ontology, vieram a corroborar achados anteriores, evidenciando-se todas as funções identificadas como beneficiadas pelo repasto sanguíneo dos triatomíneos. / Triatomine bugs are blood-sucking arthropods transmitters of Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli. It is known that eating behavior and the transmission of pathogens by these vectors vary between different species and are dependent, directly or indirectly, of bioactive molecules in saliva that help in vector-parasite-host interaction. In this sense, characterize and compare the sialoproteômico repertory of three important species of major triatomine genera of the Americas: Rhodnius prolixus, Triatoma lecticularia and Panstrongylus herreri, identifying 221 proteins, 69 of R. prolixus, 100 T. lecticularia and 52 P. herreri. Among the main findings, we found a high prevalence of nitroforinas in R. prolixus (68%) and lipocalin in T. lecticularia (79%) and P. herreri (49%). In this context, the most significant protein per spot R. prolixus, T. lecticularia and P. herreri most abundant, with significant difference among others, were Nitrophorin-4 (28.7%) Salivary lipocalin 5 (65.2%) and Putative triabin (20.5%), respectively. Another significant finding was the single molecule presents the three species studied, not categorized protein T1HT34, which would act as a protein link between them, identifying themselves as paráloga of Putative fry-like conserved. The data obtained by the characterization by the Gene Ontology, came to corroborate previous findings, showing up all the functions identified as beneficiaries of the blood meal of the insects.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-26Bitstream added on 2014-06-13T20:36:32Z : No. of bitstreams: 1 ferreirafilho_jcr_me_arafcf.pdf: 627816 bytes, checksum: b1c11f69fc69c2ac25f9a07f076cafa8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Os membros da subfamília Triatominae são vetores do protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas. Eles compreendem 144 espécies agrupadas em 18 gêneros e são encontrados principalmente nas Américas, desde o sul dos Estados Unidos ao sul da Argentina e Chile. Essencialmente a identificação desses insetos tem sido baseada na descrição comparativa da morfologia de indivíduos adultos incluindo as estruturas da genitália masculina e feminina, aspectos gerais do corpo como cabeça, tórax, antena e coloração, entre outros. Entretanto a distinção por critérios morfológicos apresenta limitações para caracterização de espécies do gênero Rhodnius devido às semelhança entre elas, especialmente entre R. prolixus, R. domesticus, R. robustus, R. neglectus, and R. nasutus, espécies conhecidas como “grupo prolixus”. Nesse estudo as técnicas de biologia molecular, sequenciamento do gene 16S e PCR-RFLP, foram utilizados para caracterização de sete espécies de Rhodnius. Os produtos do sequenciamento do gene 16S das espécies R. brethesi; R. nasutus, R. nasutus, R. neglectus, R. pictipes; R. prolixus, R. robustus, e R. sp geraram alinhamento de 380 pares de bases com 48 sítios polimórficos. A visualização das bandas geradas pelas enzimas de restrição BstUI, HhaI, RsaI and Mbol com as sete amostras de Rhodnius possibilitou distingui-las com exceção de R. prolixus, R. neglectus e R.robustus. Os dois métodos feitos para as mesmas amostras confirmaram a validade da utilização do método PCR-RFLP para identificação de R. brethesi, R. nasutus, R. pictipes e R. sp, uma vez que o gene 16S já é um marcador estabelecido para as espécies de Rhodnius e as duas metodologias apresentaram os mesmos resultados, confirmaram também o trabalho realizado por Naegele et al. 2006 em que a técnica de PCR-RFLP distinguiu R. stale, R. pictipes, R. Prolixus and R. domesticus / The members of the subfamily Triatominae are vectors of the protozoan Trypanosoma cruzi, which is the etiologic agent of Chagas disease. They consist of 144 species grouped into 18 genera and are found mainly in the Americas, from the southern United States to southern Argentina and Chile. Essentialy, the identification of these insects has been based on the comparative description of the morphology of adult specimens, including the structures of both the male and female genitalia, general body features like head, thorax, antennae and color, among others. However, this method is not particularly useful in the characterization of species belonging to the genus Rhodnius because they are very similar morphologically, specially R. prolixus, R. domesticus, R. robustus, R. neglectus, and R. nasutus, which are known as “prolixus complex”. In this study molecular biology techniques, such as sequencing of 16S gene and PCR-RFLP, was used to contribute to the characterization of seven species of Rhodnius. The products of the sequencing of the 16S species R. brethesi; R. nasutus, R. nasutus, R. neglectus, R. pictipes; R. prolixus, R. robustus, and R. sp generated a alingment of 380bp with 48 polymorphic sites. The visualization of the bands arising from the use of restriction enzymes BstUI, HhaI, RsaI and Mbol with samples of seven species of Rhodnius possible to distinguish them except for R. prolixus, R. neglectus and R.robustus. The two methods performed in parallel for the same samples confirmed the validity of using the enzymatic method for specific identification of R. brethesi, R. nasutus, R. pictipes e R. sp, since the 16S gene is already an established marker for it and the two methods showed the same results, confirmed too the work performed by Naegele et al.2006 that the PCR-RFLP technic distinguished R. stale, R. pictipes, R. Prolixus and R. domesticus

Ureases são enzimas que possuem atividades biológicas independentes de suas funções enzimáticas, como indução de exocitose e atividade inseticida. Rhodnius prolixus é um dos modelos de inseto sensíveis a essa toxicidade. Quando testada em tecidos isolados de R. prolixus, a urease de Canavalia ensiformis (JBU) causa diferentes efeitos deletérios modulados por eicosanóides. A via de biossíntese dos eicosanóides envolve fosfolipases A2 (PLA2), que são enzimas responsáveis pela liberação de ácido araquidônico (AA). Uma vez liberado, AA pode ser oxigenado na via da ciclooxigenase, a qual produz prostaglandinas (PGs). Em insetos, a resposta imune compreende as reações humoral e celular e é centralmente modulada por eicosanóides, principalmente PGs. Em busca de uma ligação entre o efeito tóxico de JBU e reações imunológicas em insetos, estudamos os efeitos desta toxina em hemócitos de R. prolixus. Descobrimos que JBU ativa a agregação de hemócitos, tanto após injeção na hemolinfa quanto em células in vitro. Em ensaios in vitro, observamos que os inibidores da síntese de eicosanóides, dexametasona e indometacina, inibem a agregação induzida por JBU, sugerindo que produtos da ciclooxigenase modulam a reação. Após hemócitos cultivados serem tratados com JBU, sítios imunorreativos anti-JBU, danos no citoesqueleto e agregação de núcleos foram observados nas células. Também identificamos e clonamos os transcritos de dois genes de PLA2s de R. prolixus, Rhopr-PLA2III e Rhopr-PLA2XII. Analisamos os perfis de expressão de ambos os genes, e observamos que os transcritos são amplamente distribuídos em vários tecidos, porém em diferentes níveis. Utilizando a estratégia de RNAi, silenciamos a expressão de Rhopr-PLA2XII em ninfas de R. prolixus em uma média de 70% entre variados tecidos. Observamos que a toxicidade de JBU foi diminuída em mais de 50% em ninfas com a expressão de Rhopr-PLA2XII diminuída, indicando que o gene está ligado ao efeito tóxico de JBU nesse inseto. No presente estudo demonstramos pela primeira vez a capacidade de uma urease de induzir a agregação de hemócitos. Da mesma forma, os genes de PLA2 aqui apresentados foram os primeiros a serem identificados e a terem seus transcritos clonados em um vetor da doença de Chagas. Nossos resultados estão de acordo com estudos anteriores que demonstraram que eicosanóides modulam a toxicidade de JBU, contribuindo para a compreensão dos mecanismos entomotóxicos de ação dessas proteínas multifuncionais. / Ureases are multifunctional enzymes that display biological activities independent of their enzymatic function, including induction of exocytosis and insecticidal effects. Rhodnius prolixus, a major vector of Chagas’ disease, is one of the known susceptible models of this toxicity. When tested in isolated tissues of R. prolixus, jack bean urease (JBU) causes different deleterious effects modulated by eicosanoids. The eicosanoid biosynthetic pathway involves phospholipase A2 (PLA2) enzymes that are responsible for releasing arachidonic acid (AA), along with other products. Once released, AA may enter different enzymatic oxygenation pathways, among which is the cyclooxygenase pathway, yielding products such as prostaglandins (PGs). In insects, the immune response comprises cellular and humoral reactions, and is centrally modulated by eicosanoids, mainly PGs. Searching for a link between JBU toxic effect and immune reactions in insects we have studied the effects of this toxin on R. prolixus hemocytes. We have found that JBU triggers aggregation of the hemocytes either after injection in the hemocoel as well as in isolated cells. In vitro assays in presence of the eicosanoid synthesis inhibitors dexamethasone and indomethacin counteracted JBU's effect, indicating eicosanoids, more specifically cyclooxygenase products, are likely to modulate the reaction. Cultured cells were treated with JBU and immune reactive sites were found in the cells along with damage to the cytoskeleton. The highest concentration of JBU used in the cultured cells also led to nuclei aggregation of adherent hemocytes. We have also identified two genes and cloned the transcripts with complete coding sequences of two PLA2s from R. prolixus, Rhopr- PLA2III and Rhopr-PLA2XII. We have analyzed their expression profiles and found the transcripts to be distributed in various tissues, but at different levels. We have knocked down 70% of Rhopr-PLA2XII expression in 5th instar R. prolixus, and JBU's toxicity was decreased by more than 50%, indicating that Rhopr-PLA2XII gene is linked to JBU's toxic effect in this insect. This was the first time effects of an urease on insect hemocytes were demonstrated. The PLA2 genes here presented were also the first to be identified and to have their transcripts cloned in a Chagas’ disease vector. Our findings support previous data demonstrating that eicosanoids modulate JBU's toxicity, and contribute to the understanding of the mechanisms of entomotoxic action of this multifunctional protein.

Ureases são enzimas que possuem atividades biológicas independentes de suas funções enzimáticas, como indução de exocitose e atividade inseticida. Rhodnius prolixus é um dos modelos de inseto sensíveis a essa toxicidade. Quando testada em tecidos isolados de R. prolixus, a urease de Canavalia ensiformis (JBU) causa diferentes efeitos deletérios modulados por eicosanóides. A via de biossíntese dos eicosanóides envolve fosfolipases A2 (PLA2), que são enzimas responsáveis pela liberação de ácido araquidônico (AA). Uma vez liberado, AA pode ser oxigenado na via da ciclooxigenase, a qual produz prostaglandinas (PGs). Em insetos, a resposta imune compreende as reações humoral e celular e é centralmente modulada por eicosanóides, principalmente PGs. Em busca de uma ligação entre o efeito tóxico de JBU e reações imunológicas em insetos, estudamos os efeitos desta toxina em hemócitos de R. prolixus. Descobrimos que JBU ativa a agregação de hemócitos, tanto após injeção na hemolinfa quanto em células in vitro. Em ensaios in vitro, observamos que os inibidores da síntese de eicosanóides, dexametasona e indometacina, inibem a agregação induzida por JBU, sugerindo que produtos da ciclooxigenase modulam a reação. Após hemócitos cultivados serem tratados com JBU, sítios imunorreativos anti-JBU, danos no citoesqueleto e agregação de núcleos foram observados nas células. Também identificamos e clonamos os transcritos de dois genes de PLA2s de R. prolixus, Rhopr-PLA2III e Rhopr-PLA2XII. Analisamos os perfis de expressão de ambos os genes, e observamos que os transcritos são amplamente distribuídos em vários tecidos, porém em diferentes níveis. Utilizando a estratégia de RNAi, silenciamos a expressão de Rhopr-PLA2XII em ninfas de R. prolixus em uma média de 70% entre variados tecidos. Observamos que a toxicidade de JBU foi diminuída em mais de 50% em ninfas com a expressão de Rhopr-PLA2XII diminuída, indicando que o gene está ligado ao efeito tóxico de JBU nesse inseto. No presente estudo demonstramos pela primeira vez a capacidade de uma urease de induzir a agregação de hemócitos. Da mesma forma, os genes de PLA2 aqui apresentados foram os primeiros a serem identificados e a terem seus transcritos clonados em um vetor da doença de Chagas. Nossos resultados estão de acordo com estudos anteriores que demonstraram que eicosanóides modulam a toxicidade de JBU, contribuindo para a compreensão dos mecanismos entomotóxicos de ação dessas proteínas multifuncionais. / Ureases are multifunctional enzymes that display biological activities independent of their enzymatic function, including induction of exocytosis and insecticidal effects. Rhodnius prolixus, a major vector of Chagas’ disease, is one of the known susceptible models of this toxicity. When tested in isolated tissues of R. prolixus, jack bean urease (JBU) causes different deleterious effects modulated by eicosanoids. The eicosanoid biosynthetic pathway involves phospholipase A2 (PLA2) enzymes that are responsible for releasing arachidonic acid (AA), along with other products. Once released, AA may enter different enzymatic oxygenation pathways, among which is the cyclooxygenase pathway, yielding products such as prostaglandins (PGs). In insects, the immune response comprises cellular and humoral reactions, and is centrally modulated by eicosanoids, mainly PGs. Searching for a link between JBU toxic effect and immune reactions in insects we have studied the effects of this toxin on R. prolixus hemocytes. We have found that JBU triggers aggregation of the hemocytes either after injection in the hemocoel as well as in isolated cells. In vitro assays in presence of the eicosanoid synthesis inhibitors dexamethasone and indomethacin counteracted JBU's effect, indicating eicosanoids, more specifically cyclooxygenase products, are likely to modulate the reaction. Cultured cells were treated with JBU and immune reactive sites were found in the cells along with damage to the cytoskeleton. The highest concentration of JBU used in the cultured cells also led to nuclei aggregation of adherent hemocytes. We have also identified two genes and cloned the transcripts with complete coding sequences of two PLA2s from R. prolixus, Rhopr- PLA2III and Rhopr-PLA2XII. We have analyzed their expression profiles and found the transcripts to be distributed in various tissues, but at different levels. We have knocked down 70% of Rhopr-PLA2XII expression in 5th instar R. prolixus, and JBU's toxicity was decreased by more than 50%, indicating that Rhopr-PLA2XII gene is linked to JBU's toxic effect in this insect. This was the first time effects of an urease on insect hemocytes were demonstrated. The PLA2 genes here presented were also the first to be identified and to have their transcripts cloned in a Chagas’ disease vector. Our findings support previous data demonstrating that eicosanoids modulate JBU's toxicity, and contribute to the understanding of the mechanisms of entomotoxic action of this multifunctional protein.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste trabalho utilizou-se a técnica fluorescência de raios X usando radiação síncrotron (SR-TXRF) para estudar, quantitativamente, o transporte de cloro, potássio e cálcio na hemolinfa, urina e túbulos de Malpighi (TM) em ninfas de quinto estágio do Rhodnius prolixus (R. prolixus), considerando a excreção destes elementos em diferentes dias após o repasto sanguíneo. R. prolixus é um dos principais vetores do Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de Chagas. R. prolixus fornece um sistema modelo particularmente útil porque seus TMs tanto secretam quanto reabsorvem íons a taxas elevadas. Os TMs filtram a hemolinfa e secretam um líquido que é muitas vezes comparado com a urina primária em vertebrados. Os resultados obtidos mostram que a concentração de potássio na urina é substancialmente maior do que na hemolinfa. A concentração de cloro na hemolinfa é menor do que na urina, mas a diferença não é tão marcada como no caso do potássio. No caso do Rhodnius é razoável interpretar a elevada concentração de potássio na urina como adaptativo para o problema de excreção imediato do inseto. A concentração de cálcio nos TMs é substancialmente maior em comparação com os valores encontrados na hemolinfa e urina. Este resultado mostra que o cálcio é retido no corpo do R. prolixus e pouco eliminado. Os resultados obtidos estão coerentes com a literatura. Avaliou-se também o efeito no transporte de Cl, K e Ca após um repasto de sangue de coelho contaminado com HgCl2 de modo a avaliar o efeito da presença deste metal tóxico no balanço iônico nos fluidos de excreção urina e hemolinfa e também pelo principal órgão de transporte, os túbulos de Malpighi. As excreções de Cl e K pela urina são afetadas pela ingestão. Este resultado é esperado levando-se em consideração a ingestão de excesso de Cl através do HgCl2. O transporte de Cl, K e Ca na hemolinfa do Rhodnius prolixus não é afetada pela ingestão de HgCl2. Nos túbulos de Malpighi, as altas concentrações de Ca obtidas foram comparáveis àquelas encontradas nos insetos controle. Pode-se concluir que SR-TXRF é um método muito promissor para análises diretas, rápidas e confiáveis para a quantificação simultânea de elementos envolvidos na regulação do transporte e em todo o sistema excretor de insetos. Além disso, o estudo do transporte e a excreção de elementos no inseto Rhodnius prolixus abrem oportunidade para a maior compreensão de efeitos da poluição em espécies de invertebrados. / In this work, we investigated changes in the concentrations of Cl, K and Ca, in 5th instar using total reflection X-ray fluorescence Rhodnius prolixus with synchrotron radiation (SR-TXRF). The elements were quantified using urine, hemolymph and Malpighian tubules samples collected on different days after a blood meal. Rhodnius prolixus is one of the most important vectors of the Trypanosoma cruzi, causative agent of Chagas? disease. R. prolixus provides a particularly useful model system because its MTs both secrete and reabsorb ions at high rates. The TMs filter hemolymph and secrete a liquid that is often compared with the primary urine in vertebrates. The experimental results showed that the concentration of potassium in the urine is substantially greater than in the hemolymph. The concentration of chlorine in the hemolymph is generally less than in the urine, but the difference is not so marked as in the case of potassium. In the case of Rhodnius, it is reasonable to interpret the high concentration of potassium in the urine as adaptive to the animals? immediate excretory problem. The concentration of calcium in the TMs is substantially greater than in both the hemolymph and the urine. This result shows that that calcium is retained in the body and not eliminated. These results are in accordance with the literature. We also investigated whether dietary mercury contamination may influence the transport of Cl, K and Ca by the hemolymph, urine and Malpighian tubules of R. prolixus fed on blood containing HgCl2. The results suggested that dietary Hg contamination may influence the Cl and K contents during excretion of the urine. It was expected considering the large amounts of chlorine ingested by Rhodnius prolixus in its meals of blood containing HgCl2. Statistical analysis showed no significant variation in all elements contents for hemolymph samples. The main conclusion which can be drawn from the results is that in all the insects studied calcium is deposited in Malpighian tubules. These observations point out that the analytical approach of the SR-TXRF method can be efficiently used to measure elements involved in the transport regulation into insect Malpighian tubules and also provides useful data concerning the biological effects of pollution on invertebrate species.