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Texte remanié de: thèse--Sc. phys.--Aix-Marseille II, 1973. N°: 46. / C.N.R.S. A.O. 7567. Extrait de "Molecular and general genetics" T. 121, 1973, pp. 151-162 . Conservé sous la cote: [4° THS. Pièce. 663].

Dans les cellules eucaryotes, la biogenèse des ribosomes débute par la transcription des unités répétées d'ADN ribosomique (ADNr) par l'ARN polymérase I (Pol I). Ce processus génère un transcrit primaire (pré-ARNr), qui contient les séquences correspondant aux ARNr matures 18S, 5.8S et 25S. Le quatrième ARNr (5S) est transcrit indépendamment par Pol III. Le pré-ARNr s'associe de manière co-transcriptionnelle avec des protéines ribosomiques et de nombreux facteurs de maturation pour former une grande particule pré-ribosomique précoce appelée " particule 90S ". Cette particule précoce subit des étapes complexes de maturation générant les particules pré-40S et pré-60S à l'origine des deux sous-unités ribosomiques matures. Une partie de mes travaux de thèse a consisté en l'étude de l'hétérodimère Rpf2-Rrs1 chez la levure. Cet hétérodimère est connu pour son rôle essentiel dans le recrutement au sein des pré-ribosomes de la RNP 5S, une particule contenant l'ARNr 5S associé aux protéines ribosomiques RpL5 et RpL11. Nous avons révélé que Rpf2 et Rrs1 interagissent avec la chromatine de l'ADNr par des expériences d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) et que cette interaction ne dépend pas de l'intégrité des particules pré-ribosomiques. De plus, Rpf2 et Rrs1 interagissent avec des sous-unités de la Pol I et avec plusieurs facteurs associés à la chromatine de l'ADNr in vivo. Ces données suggèrent que le complexe Rpf2-Rrs1 est impliqué dans la régulation de la transcription Pol I en plus de sa fonction dans l'assemblage des pré-ribosomes. Nous avons observé par des expériences d'étalements de Miller que la perte d'expression de Rpf2 et Rrs1 est corrélée avec de fortes perturbations dans l'organisation des unités d'ADNr. Grâce à des expériences de " run-on ", une technique permettant d'évaluer la présence de Pol I actives sur l'ADNr in vivo, j'ai pu montrer par ailleurs que la perte d'expression de Rpf2 et Rrs1 affecte fortement le niveau de transcription Pol I. Des expériences complémentaires suggèrent que le complexe Rpf2-Rrs1 semble être présent sur l'ADNr en absence de transcription Pol I et a la capacité d'interagir directement avec l'ARN Pol I purifiée in vitro. Ces résultats suggèrent que le complexe Rpf2-Rrs1 joue un rôle crucial dans la coordination fonctionnelle entre transcription de l'ADNr et assemblage des particules pré-ribosomiques chez la levure. Une autre partie de mes travaux de thèse a porté sur l'étude de l'hélicase Prp43p. Prp43p est une hélicase à boite DEAH impliquée à la fois dans la synthèse des ribosomes et dans l'épissage des pré-ARNm. Cette hélicase interagit avec des protéines à domaine G-patch qui stimulent son activité enzymatique in vitro par un mécanisme inconnu. Durant ma thèse, nous avons pu montrer que l'activation de Prp43 par des protéines à domaine G-patch semble être en lien avec le mode unique de liaison de l'ATP par cette famille d'hélicases. Des données structurales indiquent que la base purique de la molécule d'ATP est empilée entre l'arginine 159 (R159) du domaine RecA1 et la phénylalanine 357 (F357) du domaine RecA2 dans le site actif de Prp43. L'étude in vitro d'un mutant de Prp43 portant une substitution du résidu F357 en alanine (F357A), nous a permis de montrer que l'absence de l'empilement de la base de l'ATP avec le résidu F357 découple les activités ATPase et hélicase de Prp43. En revanche, la substitution du résidu R159 en alanine affecte à la fois les activités ATPase et hélicase de l'enzyme. Nous avons observé par ailleurs que le mutant R159A induit le même phénotype que celui résultant de l'absence de la protéine Gno1, un des partenaires à domaine G-patch de Prp43. Ce résultat suggère fortement que les défauts de maturation observés en l'absence de Gno1 résultent d'un défaut d'activation de l'activité hélicase de Prp43. Ainsi l'empilement de la base nucléotidique entre les résidus F357 et R159 parait important pour l'activité et la régulation de cette famille d'hélicases. / In eukaryotic cells, ribosome synthesis begins with the transcription of ribosomal DNA (rDNA) by RNA polymerase I (Pol I). This process generates a primary transcript (pre-rRNA), containing the sequences corresponding to the mature 18S, 5.8S and 25S rRNAs. The fourth rRNA (5S) is transcribed independently by RNA Pol III. The pre-rRNA associates co-transcriptionally with some ribosomal proteins and many maturation factors to generate a large initial pre-ribosomal particle called the 90S particle. This particle undergoes a complex maturation process generating the pre-40S and pre-60S particles that will generate the mature ribosomal subunits. The first part of my thesis work consisted in the study of the Rpf2-Rrs1 heterodimer in yeast. This heterodimer is known to be essential for the maturation of pre-60S particles through the recruitment of the 5S RNP, a module containing the 5S rRNA associated to ribosomal proteins RpL5 and RpL11. We showed that Rpf2 and Rrs1 interact with rDNA chromatin using chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments and that this interaction does not depend on the integrity of the pre-ribosomal particles. Moreover, both Rpf2 and Rrs1 interact with Pol I subunits and with several rDNA chromatin-associated factors in vivo. These data suggest a function of the Rpf2-Rrs1 heterodimer in the regulation of Pol I transcription in addition to its role in the maturation of pre-60S particles. Interestingly, we observed using Miller spread experiments that loss of expression of Rpf2 or Rrs1 is correlated with strong perturbations in the organization of rDNA units. Using the "run-on" experiment, a technique allowing to determine the occupancy of active polymerases on the rDNA units, I further showed that loss of expression of Rpf2 or Rrs1 strongly affects Pol I transcription in yeast cells. Additional experiments suggest that the Rpf2-Rrs1 complex is present on rDNA units in absence of Pol I transcription in vivo and interacts with purified Pol I in vitro. These data strongly suggest that the Rpf2-Rrs1 heterodimer is a prime candidate to plays a crucial role in the functional coupling between rDNA transcription and pre-ribosome assembly in yeast cells. The second part of my thesis work focused on the study of the Prp43 helicase in yeast. Prp43 is a helicase from the DEAH/RHA family required for both the synthesis of ribosomes and the splicing of pre-mRNAs. Prp43 interacts with G-patch domain-containing proteins which activate its enzymatic activity in vitro by an unknown mechanism. During my thesis, we showed that the activation of Prp43 by G-patch proteins seems to be linked to the unique nucleotide binding mode of this helicase family. Previous structural data showed that the base of the ATP molecule is stacked between two residues, R159 of the RecA1 domain and F357 of the RecA2 domain in the active site of Prp43. The in vitro study of a Prp43 mutant bearing a substitution of F357 to an alanine (F357A) showed that the lack of stacking of the nucleotide base to the F357 residue uncouples the NTPase and helicase activities of Prp43 in vitro. In contrast the substitution of R159 to an alanine (R159A) reduced both the ATPase and helicase activities of the enzyme. We observed in addition that the Prp43 R159A mutation induces the same phenotype as the one resulting from the absence of Gno1, one of the G-patch domain-containing partners of Prp43. This result strongly suggests that the processing defects observed in the absence of Gno1 result from a failure to activate the Prp43 helicase. Overall we propose that the stacking of the ATP base between residues R159 and F357 is important for the activity and regulation of this helicase family.

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A biogênese do ribossomo é um processo complexo, altamente ordenado e regulado, no qual o transcrito primário é processado por endo e exonucleases para gerar os RNAs ribossomais maduros. Este processo foi melhor caracterizado em Saccharomyces cerevisiae, porém alguns fatores atuantes em humanos tiveram uma função divergente descrita. Um desses fatores é a proteína NIP7, altamente conservada em eucariotos, que atua na formação da subunidade ribossomal 60S, em levedura, e 40S, em humanos. Assim, esse trabalho propôs a caracterização funcional da proteína CrNIP7, homóloga a NIP7, presente em Chlamydomonas reinhardtii. C. reinhardtii é uma alga verde unicelular ancestral a plantas, utilizada como modelo eucarioto para estudos de fotossíntese e de flagelos. Nesse trabalho, um estudo de complementação funcional foi realizado utilizando duas linhagens de Saccharomyces cerevisiae diferentes e em ambas CrNIP7 complementou a função de Nip7p de leveduras, indicando uma participação na síntese da subunidade 60S do ribossomo. Uma busca por parceiros de interação de CrNIP7 foi também realizada, utilizando CrNIP7 como isca para rastrear uma biblioteca de cDNA de C. reinhardtii em sistema de duplo híbrido em leveduras, o que resultou em dois novos potenciais parceiros de interação. Esses parceiros foram identificados como proteínas preditas conceitualmente no genoma de C. reinhardtii, denominadas Predicted e G-patch. Adicionalmente, a interação entre CrNIP7 e CrSBDS, proteína homóloga a Sdo1 (de levedura) e HsSBDS (de humanos), foi confirmada através de um experimento de duplo híbrido dirigido. A interação entre as proteínas CrNIP7 e CrSBDS foi validada por pull down e um teste preliminar sugeriu que CrNIP7 e Predicted também interagem in vitro. Análises de bioinformática indicam que Predicted, G-patch e CrSBDS tenham regiões intrinsicamente desordenadas, as quais podem se estruturar na interação com seus parceiros. Em conjunto, os resultados desse trabalho contribuem para entendimento do papel de CrNIP7 na biogênese de ribossomos em Chlamydomonas reinhardtii em comparação com outros modelos eucarióticos. / Ribosome biogenesis is a complex, highly regulated and ordered process in which the primary transcript is processed by endo- and exonucleases to generate the mature ribosomal RNAs. This process was best characterized in Saccharomyces cerevisiae, but some factors have been described in humans with different function. One of these divergent factors is NIP7, a highly conserved protein in eukaryotes, which acts in the formation of ribosomal 60S subunit, in yeast, and 40S, in humans. Based on this, this work proposed the functional characterization of CrNIP7 protein, homologous to NIP7, from Chlamydomonas reinhardtii. C. reinhardtii is a green alga, ancestral to plants, that is used as an eukaryote model for photosynthesis and flagella studies. In this study, a functional complementation assay was performed using two different strains of Saccharomyces cerevisiae and, in both approaches, CrNIP7 protein complemented the function of Nip7p from yeast, indicating its participation in the synthesis of the 60S ribosomal subunit. A two-hybrid assay was carried out using CrNIP7 as bait to screen a C. reinhardtii cDNA library in order to find out CrNIP7 interaction partners, wich resulted in two novel potentially partners. The interacting proteins were identified as conceptually predicted proteins in the genome of C. reinhardtii and were called Predicted and G-patch. Additionally, the interaction between CrNIP7 and CrSBDS, a protein homologous to Sdo1 (yeast) and HsSBDS (humans), was confirmed by a direct two-hybrid assay. The interaction between CrNIP7 and CrSBDS proteins was validated by pull down and a preliminary test suggested that CrNIP7 and Predicted also interact in vitro. Bioinformatics analyzes indicate that Predicted, G-patch and CrSBDS have intrinsically disordered regions, which can be ordered in the moment of interaction. Taken together, the results of this work contribute to understand the role played by CrNIP7 in ribosome biogenesis in Chlamydomonas reinhardtii compared to other eukaryotic models.

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La synthèse du ribosome est un processus compliqué, très hiérarchisé et essentiel à toutes les cellules vivantes. La complexité de ce processus tient notamment au fait que les différentes étapes de la biogenèse du ribosome eucaryote sont temporellement et spatialement organisées dans des compartiments cellulaires différents (le nucléole, le nucléoplasme et le cytoplasme). Il est toutefois connu que le pré-ARNr 35S (le précurseur de trois des quatre ARNr, les ARNr 18S, 5.8S et 25S) est pris en charge dès sa synthèse par des facteurs impliqués dans sa maturation. Ainsi, la formation d’un ribosome requiert l’association, sur le transcrit naissant, des facteurs de synthèse, au nombre de 400. Ces facteurs essentiels interagissent transitoirement avec l’ARNr et ne font pas partie des particules ribosomiques matures impliquées dans la traduction. Leur rôle est d’assister le remodelage constant du pré-ribosome et le processus d’assemblage des sous-unités.<p>Parmi ces facteurs de synthèse, nous avons caractérisé en détail, chez la levure et chez l’homme, la protéine Las1 impliquée dans la maturation des deux extrémités de l’ITS2, séquence qui sépare les ARNr 5.8S et 25S/28S. Chez la levure, en absence de la protéine Las1, les analyses de profils de polysomes révèlent un déficit de sous-unité 60S et l’apparition d’« halfmères ». Les techniques de purification d’affinité et de gradient de sédimentation nous indiquent que Las1 est associée aux pré-ribosomes 60S et qu’elle interagit avec de nombreux facteurs de synthèse de la petite, de la grande sous-unité ou des deux. De plus, Las1 copurifie avec des pré-ribosomes qui contiennent aussi les exoribonucléases 5’-3’ Rat1/Rai1 et Xrn1. Rai1 coordonne la maturation aux deux extrémités de l’ARNr 5.8S. Nous suggérons que Las1 appartient à un macrocomplexe connectant spatialement des sites de clivages éloignés sur la séquence primaire du pré-ARNr qui seraient rapprochés suite au reploiement de l’ITS2.<p>Un autre aspect de ce travail de thèse consiste en l’étude de l’assemblage des particules ribonucléoprotéiques et plus spécifiquement du pré-ribosome et des sous-unités ribosomiques eucaryotes. Nous avons utilisé la technique d’immunoprécipitation de chromatine (Ch-IP) pour caractériser l’assemblage d’une structure appelée le « SSU processome ». Celui-ci correspond à un pré-ribosome en formation ainsi que l’assemblage des protéines ribosomiques sur l’ARNr naissant.<p>Enfin, nous avons étudié le rôle d’une plateforme d’activation de méthyltransférases d’ARN et de protéines, la protéine Trm112 dans la ribogenèse. Nous avons montré que chez la levure, Trm112 est impliquée dans la synthèse du ribosome et dans la progression de la mitose. En absence de cette protéine, les pré-ARNr sont dégradés par un mécanisme de surveillance. Trm112 copurifie avec plusieurs facteurs de synthèse du ribosome dont la méthyltransférase Bud23, impliquée dans la modification post-transcriptionnelle de l’ARNr18S. Trm112 est requise pour cette méthylation et nous postulons que la protéine Bud23 est incapable de se lier aux pré-ribosomes en l’absence de Trm112.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ribosomes are macromolecular machines that are responsible for production of every protein in a living cell. Yet we do not know the details about how these machines are formed. The ribosome consists of four RNA strands and roughly 80 proteins that associate with each other in the nucleolus and form pre-ribosomal complexes. Eukaryotes, in contrast to prokaryotes, need more than 200 non-ribosomal factors to assemble ribosomes. These associate with pre-ribosomal complexes at different stages as they travel from the nucleolus to the cytoplasm and are required for pre-rRNA processing. We do however lack knowledge about the molecular function of most of these factors and what enables pre-rRNA processing. Especially, information is missing about how non-ribosomal factors influence folding of the pre-rRNA and to what extent the pre-ribosomal complexes are restructured during their maturation.  This thesis aims to obtain a better understanding of the earliest events of ribosome assembly, namely those that take place in the nucleolus. This has been achieved by studying the essential protein Mrd1 by mutational analysis in the yeast Saccharomyces cerevisiae as well as by obtaining structural information of nucleolar pre-ribosomal complexes. Mrd1 has a modular structure consisting of multiple RNA binding domains (RBDs) that we find is conserved throughout eukarya. We show that an evolutionary conserved linker region of Mrd1 is crucial for function of the protein and likely forms an essential module together with adjacent RBDs. By obtaining structural information of pre-ribosomal complexes at different stages, we elucidate what structuring events occur in the nucleolus.  We uncover a direct role of Mrd1 in structuring the pre-rRNA in early pre-ribosomal complexes, which provides an explanation for why pre-rRNA cannot be processed in Mrd1 mutants. / <p>At the time of the doctoral defense, the following papers were unpublished and had a status as follows: Paper 3: Manuscript. Paper 4: Manuscript.</p>

Life is anti-entropic and highly organized phenomenon with two characteristics reinforcing each other: homochirality and the stereospecific catalysis of chemical reactions. The exclusive presence of L-amino acids and R-sugars in living world well depict this. Hypothetically, the amino acids and sugars of reverse chirality could form a parallel kingdom which is highly orthogonal to the present world. The components from this mirror kingdom, such as protein or nucleic acid, will be much more resistant to the defensive mechanism of present living system, which could be of great value. Therefore, by gradually rewiring the present bio-machineries, we look to build a bridge leading us to the space of mirror-imaged biomolecules. We begin by investigating protein synthesis with mirror amino acid since most amino acids contain one chiral center to be inversed comparing to sugars. In this work, we analyzed three stages critical for the incorporation of D-amino acid into ribosomal protein synthesis: amino acylation, EF-Tu binding of amino acyl-tRNA and delivery bias, and ribosome catalyzed peptidyl transfer. We have demonstrated that the affinity between EF-Tu and amino acyl-tRNA plays critical role on D-amino acid incorporation, and built a platform aimed to select for ribosome tolerating D-amino acid better. / Chemistry and Chemical Biology

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