Les protéines en cours de synthèse subissent des modifications très précoces de leur extrémité N-terminale, dès lors que celle-ci émerge du tunnel de sortie du ribosome. La première modification est l’excision de la méthionine initiatrice, assurée par une méthionine aminopeptidase (MetAP), précédée de sa déformylation par une enzyme peptide déformylase (PDF) chez les bactéries et dans les mitochondries et chloroplastes. Ce processus est ubiquitaire et essentiel, et a été décrit dans tout le règne du vivant. Chez les bactéries, les PDFs de type 1B se fixeraient au ribosome à proximité de l’extrémité du tunnel de sortie du peptide naissant, via son hélice α C-terminale. Or des analyses métagénomiques récentes ont révélé la présence insoupçonnée de gènes codant des PDFs putatives chez des virus marins. De manière inattendue, toutes les PDF virales présentent des séquences C-terminales très courtes et dépourvues de l’hélice α3. L’identification de ces PDFs atypiques soulève alors de nouvelles questions quant à leur possible interaction au ribosome et à leur fonction biologique. L’objectif de ma thèse a donc été de réaliser la caractérisation complète et intégrée de la peptide déformylase du bactériophage Vp16T, dont la séquence est l’une des plus courtes connues à ce jour. J’ai montré que le phage Vp16T code une protéine active, in vivo et in vitro, et qu’elle peut se lier au ribosome malgré l’absence d’hélice α C-terminale. La caractérisation structure-fonction de Vp16PDF a révélé des caractéristiques uniques qui pourraient alors expliquer sa fonction au cours de la réplication du phage. Ainsi j’ai montré que l’expression de Vp16PDF chez E. coli modifie la structure de l’enveloppe, induit l’accumulation d’agrégats et finalement inhibe la croissance bactérienne. De plus, l’étude de souches bactériennes mutantes a montré que Vp16PDF interfère spécifiquement avec le repliement et l’adressage de protéines membranaires. Cette dernière fonction pourrait permettre de déstabiliser la membrane de l’hôte et ainsi favoriser la libération des particules virales. / Being synthesized proteins undergo very early changes in their N-terminal end, since it emerges from the outlet channel of the ribosome. The first modification is the excision of the initiator methionine, provided by a methionine aminopeptidase (MetAP), preceded by its deformylating enzyme peptide deformylase (PDF) in bacteria and in mitochondria and chloroplasts. This process is ubiquitous and essential, and has been described in the kingdom of life. In bacteria, Type 1B PDFs would bind to the ribosome near the end of the outlet tunnel of the nascent peptide via its C-terminal helix α. But recent metagenomic analyzes revealed the unexpected presence of genes encoding putative PDFs in marine viruses. Unexpectedly, all viral PDF have very short C-terminal sequences and lacking the α3 helix. The identification of these atypical PDFs then raises new questions about their possible interaction with ribosome and their biological function. The aim of my thesis was therefore to achieve the complete and integrated characterization of peptide deformylase bacteriophage Vp16T, the sequence is one of the shortest known to date. I showed that the phage Vp16T code an active protein in vivo and in vitro, and can bind to the ribosome despite the absence of the C-terminal helix α. The structure-function characterization Vp16PDF revealed unique features that could then explain its function in the replication of the phage. Thus I have shown that expression in E. coli Vp16PDF modifies the envelope structure, induces accumulation of aggregates and ultimately inhibits bacterial growth. In addition, the study of mutant bacterial strains showed that Vp16PDF specifically interfere with the folding and addressing of membrane proteins. This latter function could help destabilize the membrane of the host and thereby promote release of viral particles.

La traduction des ARNm est un processus très complexe qui en plus des nombreux facteurs impliqués, nécessite également des étapes de maturation des protéines et ARN pour la production fidèle des protéines. Parmi ces évènements, des modifications post-transcriptionnelles et post-traductionnelles, dont la méthylation est la plus fréquente, sont trouvées dans tous les composants et principalement chez les eucaryotes. Le rôle des méthylations dans la traduction est parfaitement illustré par la protéine Trm112, qui est un activateur essentiel pour la fonction de 4 méthyltransférases (MTase) (Trm9, Trm11, Bud23 et Mtq2) qui modifient des facteurs impliqués dans la synthèse des protéines. Chez la levure, les complexes Trm9-Trm112 et Trm11-Trm112 catalysent la formation de mcm5U34 et m2G10, respectivement sur certains ARNts. Le complexe Bud23-Trm112 modifie l’ARNr 18S pour former la m7G1575 tandis que le complexe Mtq2-Trm112 modifie le facteur de terminaison de classe I eRF1sur la chaine latérale de la glutamine du motif GGQ. Jusqu’à présent, des études structurales et fonctionnelles du réseau d’interaction de la protéine Trm112 se sont uniquement focalisées chez les eucaryotes alors que cette protéine est trouvée dans les 3 domaines du vivant. Dans cette étude, des expériences de co-immunoprécipitations couplées à de la LC-MS/MS ont permis d’étudier le réseau d’interaction de la protéine Trm112 chez l’archée H. volcanii. Celui-ci s’avère être composé de plus de MTase que chez les eucaryotes. Pour la première fois, la structure cristallographique d’un complexe Trm112-MTase d’archée a été déterminée, révélant un mode d’interaction conservé par rapport aux complexes eucaryotes malgré une très faible identité de séquence. De façon très intéressante, un des partenaires de Trm112 chez H. volcanii est orthologue d’une protéine humaine dont nous avons pu démontré qu’elle est une nouveau partenaire de la protéine TRMT112 humaine / Methylation is a widely distributed modification found in a variety of substrates involved in different steps of eukaryotic protein translation. Methylation reactions are catalyzed by enzymes called methyltransferases (MTases) generally using S-adenosyl-L- methionine (SAM or AdoMet) as the methyl donor. The effects of methylation on translation are perfectly illustrated by the Trm112 protein, which is an activating platform, essential for the function of four SAM-dependent MTases (Trm9, Trm11, Bud23 and Mtq2) modifying factors participated in protein synthesis. The Trm9-Trm112 and Trm11-Trm112 complexes methylate some tRNAs to form mcm5U34 and m2G10 respectively. The Bud23-Trm112 complex modifies 18S rRNA to form m7G1715 while the Mtq2-Trm112 complex methylates class I translation termination factor eRF1 at glutamine side chain of GGQ motif. Until now, the study of Trm112 network in eukaryotes has been quite clear structurally and functionally, however, little is known for corresponding proteins in Archaea.My PhD project aims to characterize the Trm112 network in archaea using Haloferax volcanii as a model organism and to decipher the mechanisms of substrate modification by Trm112-MTase complexes. This will help understanding the roles of these enzymes in protein synthesis from an evolutionary point of view.Towards this goal, I have generated several H. volcanii strains (Δtrm112, Δtrm112 Trm112-Flag, …). Co-immunoprecipitation of Trm112-Flag coupled to mass spectrometry allowed me identifying a significant number of methyltransferases (MTases), including putative orthologues of eukaryotic Trm112 partners, as potential interactors. I have next validated these new partners by biochemical approaches (co-purification, enzymatic assays, …) and determined the crystal structure for one Trm112-MTase complex. I have then convincing evidences that H. volcanii Trm12 has more MTase partners than the eukaryotic one. My work opens new routes towards the characterization of the role of Trm112 in archaea but has also led to the identification of a new MTase partner of the eukaryotic Trm112.

La synthèse des protéines est un mécanisme central de la vie cellulaire dont la compré-hension est un enjeu pour la recherche biomédicale. Des phénomènes comme les erreurs programméesde la traduction eucaryote ou l’initiation par des structures IRES virales sont impliqués dans les processusde réplication de virus et de bactéries. Mieux appréhender ces processus est une étape essentiellepour aboutir au développement d’approches thérapeutiques innovantes. Les études en molécule uniquepermettent d’observer chaque système réactionnel individuellement et donnent accès à des évènementsasynchrones difficilement observables en mesure d’ensemble, tels la traduction de protéines.Ce manuscrit de thèse présente une approche d’étude de la traduction par un ribosome eucaryote(mammifère) en molécule unique. Nous observons les systèmes traductionnels grâce à des marqueursfluorescents liés à des oligonucléotides pouvant s’hybrider sur les séquences d’ARN messagers traduites.L’observation de ces marqueurs est faite par microscopie de fluorescence en réflexion totale (TIRFM),les ARNm étant accrochés à la surface de l’échantillon. En lisant l’ARNm, le ribosome détache lesmarqueurs, et leurs instants de départ nous permettent de remonter à la dynamique de traductionde ribosomes individuels. Cette méthode permet d’obtenir des données cinétiques statistiques surun grand nombre de systèmes traductionnels en parallèle pouvant alors être ajustées par des lois deprobabilité. Partant de ce principe, mes travaux de thèse ont eu pour objectif d’étendre nos expériencesà une nouvelle problématique biologique : l’étude des évènements non canoniques de la traductioneucaryote. Pour cela nous avons apporté les modifications et les optimisations nécessaires au dispositifet au protocole expérimental pour l’adapter à ces nouveaux enjeux.Nos mesures de la cinétique in vitro de l’élongation eucaryote ont mis à jour un délai dû à uneinitiation non-canonique. En effet, nous réalisons le recrutement du ribosome par l’ARNm grâce àune structure virale de type IRES. Dans nos conditions d’expérience, l’incorporation d’un acide aminéprend environ une seconde tandis que cette structure induit un retard à la traduction de plusieursdizaines de secondes. Nous avons réalisé une étude comparative de plusieurs de ces structures viraleset avons montré que le délai mesuré était une caractérisitique conservée dans le cadre de l’initiation noncanonique. Ce résultat ouvre des perspectives d’études cinétiques tant pour approfondir nos conclusionssur les IRES que pour aborder d’autres évènements non canoniques tel que le décalage de la phase delecture ou le franchissement du codon stop. / The synthesis of proteins is a central mechanism of cellular life whose understandingis an issue for biomedical research. Phenomena such as programmed errors of eukaryotic translation orinitiation by viral IRES structures are involved in virus and bacterial replication processes. A Betterunderstanding of these processes is an essential step towards the development of innovative therapeuticapproaches.Single molecule studies allow each reaction system to be observed individually and give accessto asynchronous events, such as protein translation, that are difficult to observe in overall measurements.This phD manuscript presents a single molecule approach to study translation by a eukaryotic(mammalian) ribosome.We observe the translational systems thanks to fluorescent primers linked to oligonucleotides thatare hybridized to the translated mRNA sequences. These markers are observed by Total InternalReflection Fuorescence Microscopy (TIRFM) ; with the mRNAs attached to the sample surface. Whilereading the mRNA, the ribosome detaches the primers, and their instants of departure give us access tothe translation dynamics of individual ribosomes. This method makes it possible to obtain statisticalkinetic data on a large number of parallel translational systems, which can then be fitted by probabilitylaws. On the basis of this principle, my phD work aimed at extending our experiments to a newbiological issue : the study of non-canonical events in eukaryotic translation. To this end, we havemade the modifications and optimizations necessary for the set-up and the experimental protocol toadapt them to these new challenges.Our measurements of the in vitro kinetics of eukaryotic elongation have revealed a delay due tonon-canonical initiation. Indeed, the ribosome are recruited on the mRNA thanks to a viral, IREStype structure. Under our experimental conditions, the incorporation of an amino acid takes aboutone second while this structure induces a translation delay of several tens of seconds. We carried outa comparative study of several of these viral structures and showed that the measured delay was acharacteristic preserved in the framework of the non-canonical initiation. This result opens up prospectsfor kinetic studies both to deepen our conclusions on IRES and to address other non-canonical eventssuch as programmed frameshifting or STOP codon readthrough.

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<p>The ribosome is part of the indispensable machinery of every living cell. This large macromolecule, which decodes messenger RNA to produce proteins, is the subject of intense study as the mediator of an essential process. The prokaryotic ribosome is a major target for antimicrobial therapy, as its structure differs significantly from the eukaryotic ribosome. At present, the in vivo process of translation on the mature bacterial, or 70S, ribosome is well studied and increasingly understood, while the process of assembling the small (30S) and large (50S) subunits of this complex ribonucleoprotein enzyme has mostly been studied in vitro. Consequently, the significance of in vivo events such as ribosomal RNA (rRNA) maturation and factor-mediated maturation is incompletely understood. By studying the nature and structure of an in vivo assembled immature 30S subunit, this thesis aims to gain a better understanding of the key events in 30S subunit biogenesis. Deletion of the assembly cofactor Ribosome Maturation Factor M (RimM) results in slow growth, inefficient rRNA processing, and accumulation of nonfunctional, immature 30S subunits. This work presents the first cryo-EM model of the immature 30S purified from a RimM knockout strain of <em>E. coli</em>. The structure reveals distortion of the decoding centre and a disrupted 50S-binding interface, attesting to the importance of rRNA processing in 30S maturation. Additionally, the model suggests consequences for ribosomal protein incorporation and rRNA domain position relative to the mature 30S.</p> / Master of Science (MSc)

<p>Ribosome assembly is a complex process, facilitated by more than 20 protein factors in bacteria. GTPases and ATPases represent the energy driving force of these factors. In my research as a PhD student, I studied the function of two GTPases, YjeQ and RbgA, involved in the assembly of the small and the large ribosomal subunits, respectively.</p> <p>We isolated and characterized <em>in-vivo</em> assembled immature small (30S) and large (50S) subunits using a perturbation in the genes coding for these proteins. We observed that both subunits contained an incomplete ribosomal protein content, mainly lacking late-binding r-proteins. Additionally, we observed distortions in the functional core of the immature ribosomal subunit, particularly in the mRNA decoding center of the 30S subunit, the peptidyltransferase center of the 50S subunit, and tRNA binding sites.</p> <p>Additionally, we have determined that the YjeQ protein interacts with the 30S subunit through its N-terminal OB-fold domain, and C-terminal Zn-finger motif. The binding site of YjeQ on the 30S subunit prevents the interaction with tRNAs, translation factors, and the 50S subunit.</p> <p>Finally, we uncovered a novel functional interplay between RbgA and the ribosomal protein L16 during late stages of ribosomal assembly. We proposed that recruitment of L16 to the assembling 50S subunit would induce a conformational rearrangement that would ultimately promote the GTP-dependent release of RbgA.</p> <p>The function of the assembly factors associated with the process of <em>in-vivo</em> ribosome assembly is not known, and thus a framework on how ribosomes are built is still elusive. I believe the research presented in this thesis provides novel insights into the role of YjeQ and RbgA in the assembly of ribosomes</p> / Doctor of Philosophy (PhD)

<p>Our understanding of the mechanism of ribosome assembly in bacteria is still in its infancy. Work from our laboratory and others have recently established that some protein assembly factors assist the assembly process at its late stages, mediating the correct folding of the functional core of the 30S and 50S subunits. The GTPase YjeQ is an assembly factor that displaces the upper domain of h44 of the mature 30S subunit upon binding, inducing a distortion in the decoding center. We hypothesized that the displacement of h44 is caused by the zinc-finger domain of YjeQ and mediates the release of RbfA, another assembly factor involved in 30S subunit maturation. To understand how the zinc-finger domain of YjeQ implements the functional interplay with RbfA, we constructed several deletion mutants of the domain. We found that the zinc-finger domain of YjeQ was required to bind the 30S subunit, but not the C-terminal extension (CTE) of the domain. The CTE was necessary for stimulation of GTPase activity upon binding to the 30S subunit and removal of bound RbfA from the 30S subunit. The data presented here suggests that the zinc-finger domain is essential for YjeQ to bind the 30S subunit and to implement the functional interplay with RbfA. Ongoing structural studies of the complex formed by the YjeQ CTE variant and the 30S subunit will provide a three dimensional view of the conformational changes that occur to implement the functional interplay between YjeQ and RbfA at the late stages of 30S subunit assembly.</p> / Master of Science (MSc)

Plusieurs études ont permis la caractérisation de la structure et de la fonction du ribosome. En ce qui attrait à la biogénèse du ribosome, nombreux aspects restent à être découverts et compris de façon plus dynamique. En effet, cette biogénèse englobe une variété de voies de modifications et d’assemblages requises pour la maturation des ARNr et pour leurs liaisons avec les protéines ribosomales. De ce fait, les protéines Noc ont été caractérisées comme des facteurs d’assemblages et ont permis la découverte d’une des premières indications sur l’ordre spatio-temporel de la maturation du ribosome. Ainsi, en utilisant la levure comme modèle, notre objectif est d’étudier d’avantage l’échange des complexes composés des protéines Noc ainsi que leur localisation intranucléaire. Ainsi, la nature des interactions de Noc2p avec Noc1p et Noc3p et l’influence de l’arrêt du transport intranucléaire ont été étudiés en utilisant des promoteurs inductibles, la microscopie à fluorescence, des immunobuvardages, qRT-PCR et des purifications par affinité. / Several studies have been performed to characterize the ribosome as far as to understand its structure and its function. However, major aspects of ribosome biogenesis remain elusive or gave only a static picture of the process. In fact, ribosome biogenesis involves dynamic processing and assembly pathways that are required for rRNA modification and folding, in addition to rRNA binding with some ribosomal proteins. One set of assembly factors, the Noc proteins, allowed one of the first indications about the spatio-temporal ordering of ribosome maturation. By using yeast as model, our objective is to provide a dynamic picture of the Noc proteins complexes exchange and nuclear localization by determining the nature of Noc2p interactions with Noc1p and Noc3p and by studying the influence of reversibly arrested intranuclear transport on these proteins and on Rix7p, an AAA-ATPase. In order to achieve these aims, inducible promoter, fluorescent microscopy, western blot, qRT-PCR and affinity purification analyses were used.

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