La traduction est un processus itératif réalisé par le ribosome. Chez Escherichia coli, le ribosome est composé d’une grande sous-unité 50S et d’une petite sous-unité 30S (S correspondant au coefficient de sédimentation). La traduction débute par la mise en place d’une interaction entre le codon d’initiation de l’ARNm et l’anticodon de l’ARNt initiateur. Cette interaction, finement régulée par les facteurs d’initiations IF1, IF2 et IF3, conduit à la formation du complexe d’initiation 30S (30SIC). Par titration calorimétrique isotherme (ITC), nous avons disséqué la thermodynamique de l’ensemble des voies possibles de formation du 30SIC. Sur la base des affinités mesurées, il a été possible d’en déduire un ordre d’assemblage préférentiel. Par cryo-microscopie électronique, nous avons ensuite essayé d’obtenir la structure de ce complexe à haute résolution. La fixation du 50S représente la dernière étape de l’initiation. Par ITC, nous avons cherché à en déterminer les paramètres thermodynamiques, puis nous avons poursuivi avec l’élongation en commençant par étudier l’incorporation d’un aminoacyl-ARNt. Enfin, la réalisation d’une étude comparative par ITC de trois antibiotiques capables de se fixer au tunnel de sortie du peptide, nous a permis d’identifier les forces moléculaires mises en jeu lors de leur interaction avec le ribosome. / Translation is an iterative process achieved by the ribosomal machinery. In Escherichia coli, the ribosome is composed of a large 50S subunit and a small 30S subunit (S being the sedimentation coefficient). Translation begins with the establishment of the interaction between the mRNA codon and the initiator tRNA anticodon. This interaction, under the control of initiation factors IF1, IF2 and IF3, leads to the formation of the 30S initiation complex (30SIC). Using isothermal titration calorimetry (ITC), we explored the thermodynamic landscape of all possible pathways for 30SIC formation. Based on affinities derived from ITC, we propose a preferred assembly pathway. Using cryo-electron microscopy, this knowledge was used to obtain high-resolution structures of 30SIC intermediates. Binding of the 50S is the last step for initiation. Using ITC, thermodynamic parameters were derived followed by the incorporation of an aminoacyl-tRNA. Lastly, we realized, using ITC, a comparative study of three antibiotics binding to the nascent peptide exit tunnel of the ribosome. This study leads us to determine the molecular forces involved in their interaction with the ribosome.

Le ribosome est une machinerie cellulaire importante impliquée dans la synthèse protéique de toute cellule vivante. Par conséquent, le ribosome est l'une des principales cibles des antibiotiques naturels, qui sont capables de tuer les cellules bactériennes en bloquant la synthèse protéique. Toutefois, certaines bactéries sont résistantes à ces antibiotiques en raison de petites modifications au niveau de leurs ribosomes. Entre autres, Staphylococcus aureus (S. aureus) est un agent pathogène responsable de nombreuses infections graves chez l’Homme. Les structures cristallines d'antibiotiques en complexe avec des ribosomes de bactéries non-résistantes, non-pathogènes, Gram négatives ont fourni un aperçu sans précédent des mécanismes d'action de ces antibiotiques. Cependant, aucune structure de ribosome de bactéries pathogènes, hautement résistantes, Gram positives telles que S. aureus n’a encore été identifiée.Dans cette étude, nous présentons la première structure de ribosome de S. aureus à haute résolution (3.9 Å) résolue par cryo-microscopie électronique (cryo-ME). Nous mettons en évidence plusieurs caractéristiques de l'organisation des ribosomes spécifiques des bactéries Gram-positives. Nous décrivons également le protocole de purification et de cristallisation du ribosome de S. aureus pour de futures études de cryo-ME et de cristallographie aux rayons X.Tous les résultats obtenus dans ces travaux, faciliteront la description à l’échelle atomique du ribosome de S. aureus et ses complexes fonctionnels’ ’dans un futur proche. La combinaison des méthodes de cristallographie aux rayons X et de cryo-ME aidera à atteindre cet objectif. Les résultats obtenus serviront de base pour le développement de nouveaux composés contre la bactérie pathogène et extrêmement résistante qu’est S. aureus. / The ribosome is a large cellular machinery that performs the protein synthesis in every living cell. Therefore, the ribosome is one of the major targets of naturally produced antibiotics, which can kill bacterial cells by blocking protein synthesis. However, some bacteria are resistant to these antibiotics due to small modifications of their ribosomes. Among them, Staphylococcus aureus (S. aureus) is a severe pathogen that causes numerous infections in humans. The crystal structures of complexes of antibiotics with ribosomes from Gram-negative non-pathogenic non-resistant bacteria have provided unparalleled insight into mechanisms of antibiotics action. However, the structure of the ribosome from Gram-positive pathogenic and highly resistant bacteria such as S. aureus was still unidentified.In this study we present the first high resolution structure of the ribosome from S. aureus solved at 3.9 Å by cryo-electron microscopy (cryo-EM). We demonstrate several features of the ribosome organization which are unique for Gram-positive bacteria. We also describe the protocol of purification and crystallization of S. aureus ribosome for future cryo-EM and X-ray crystallography studies.All the results obtained in this work will help to describe S. aureus ribosome and its functional complexes at the atomic level in the nearest future. The combination of X-ray crystallography and cryo-EM methods will help to achieve this aim. The obtained results will provide a foundation for the development of new compounds against the pathogenic and extremely resistant bacteria S. aureus.

Le travail effectué dans cette thèse présente une nouvelle approche de la théorie du code circulaire dans les gènes qui a été initiée en 1996. Cette approche consiste à analyser les motifs construits à partir de ce code circulaire, ces motifs particuliers sont appelés motifs de code circulaire. Ainsi, nous avons développé des algorithmes de recherche pour localiser les motifs de code circulaire dans les séquences d'acides nucléiques afin de leur trouver une signification bioinformatique. En effet, le code circulaire X identifie dans les gènes est un ensemble de trinucleotides qui a la propriété de retrouver, synchroniser et maintenir la phase de lecture. Nous avons commencé notre analyse avec le centre de décodage du ribosome (ARNr) qui est une région majeure dans le processus de traduction des gènes aux protéines. Puis, nous avons étendu les résultats obtenus avec le ribosome aux ARN de transfert (ARNt) pour étudier les interactions ARNr-ARNt. Enfin, nous avons généralisé la recherche de motifs de code circulaire X dans l'ADN aux chromosomes d'eucaryotes complets. / The work done in this thesis presents a new direction for circular code identified in 1996 by analysing the motifs constructed from circular code. These particular motifs are called circular code motifs. We applied search algorithms to locate circular code motifs in nucleic acid sequences in order to find biological significance. In fact, the circular code X, which was found in gene sequences, is a set of trinucleotides that have the property of reading frame retrieval, synchronization and maintenance. We started our study in the ribosomal decoding centre (rRNA), an important region involved in the process of translating genes into proteins. Afterwards, we expanded our scope to study the interaction of rRNA through the X circular code. Finally, we search for the X circular code motifs in the complete DNA sequences of chromosomes of the eukaryotic genomes. This study introduced new properties to the circular code theory.

Plus de 200 facteurs pré-ribosomiques sont impliqués dans la maturation des ribosomes. La majorité de ces facteurs sont essentiels à la survie cellulaire, mais la fonction précise de la plupart d’entre eux demeure inconnue. Une des dernières étapes de maturation de la petite sous-unité du ribosome est le clivage du pré-ARNr 20S en ARNr 18S mature. Ce clivage est réalisé par l'endonucléase Nob1 et nécessite également la présence de la NTPase Fap7 ainsi que d’une pléthore d’autres facteurs pré-ribosomiques. La fonction de Fap7 est particulièrement intrigante, car l'homologue humain hCINAP possède une activité adénylate kinase, activité enzymatique qui n’est généralement pas liée à la biogenèse des particules ribonucléoprotéiques. En outre, la fonction de Fap7 est intimement liée à son interaction avec la protéine ribosomique Rps14. La partie C-terminale de Rps14 est essentielle pour le clivage au niveau du site D et est située à proximité de l’extrémité 3’ de l’ARNr 18S dans le ribosome mature. La suppression de cette protéine provoque le syndrome 5q qui est phénotypiquement proche de l’anémie de Diamond-Blackfan. Ces deux protéines interviennent également au niveau d’une voie de régulation de p53 qui est dérégulée dans de nombreux cancers. La combinaison d’études structurales par cristallographie aux rayons X, d’études enzymatiques sur des protéines recombinantes ainsi que des tests de maturation in vitro réalisés sur des pré-ribosomes purifiés, nous a permis de mieux appréhender la fonction de Fap7 au sein de la sous-unité pré-40S du ribosome. Nous avons également montré que l'interaction Fap7-Rps14 est impliquée dans un changement conformationnel majeur au cœur des pré-ribosomes et que cette réorganisation est nécessaire afin d'exposer le site D pour le clivage par l’endonucléase Nob1. / Over 200 pre-ribosomal factors involved in the maturation of ribosomes. Most of these factors are essential to cell survival, but the precise function of most of these factors remains elusive. One of the last steps of maturation of the small subunit of the ribosome is the cleavage of 20S pre-rRNA in 18S rRNA in the cytoplasm. This cleavage is carried out by the endonuclease Nob1 and also requires the presence of other factors such as the methyltransferase Dim1, and a plethora of NTPases including the Rio protein kinases, Prp43 and its cofactor Pfa1, the Ltv1 GTPase and the Fap7 NTPase. The function of Fap7 is especially intriguing since the human homologue bears Adenylate activity, an enzymatic activity not usually linked to ribonucleoprotein biogenesis. In addition, the function of Fap7 is intimately linked its interaction with the Rps14 ribosomal protein. The Rps14 C-terminal is essential of D site cleavage and is located in proximity to the 18S C-terminus in the mature ribosome. The deletion of this protein causes the 5q syndrome that is phenotypically close to Diamond Blackfan anemia. The link between the enzymatic activity of Fap7 and its role in ribosome biogenesis remains enigmatic. Using a combination of structural studies by X-ray crystallography, small angle X-ray scattering (SAXS) in solution, enzymatic studies on purified proteins, and in vitro D site cleavage reaction assays on purified pre-ribosomes, we were able to uncover the function of Fap7 within pre-40S ribosomes. We show that the Fap7/Rps14 interaction is involved in a major conformational change at the heart of the pre-ribosomes and that this structural rearrangement is necessary to expose the D-site for cleavage by the endonuclease Nob1.

Le 5-Fluorouracile (5-FU) est un anti-métabolite intensément utilisé dans les traitements chimio-thérapeutiques de nombreux cancers. Cependant, les mécanismes moléculaires de l'action de cet agent anti-cancer, son impact sur la biologie cellulaire et les processus de résistance restent encore largement à déterminer. Nous avons proposé que le 5-FU, en s'intégrant dans l'ARN induit une altération de la traduction. Dans cette étude, nous avons déterminé pour la lignée de cellules de cancer colorectal HCT116 la dose et le temps de traitement qui induit une modification du comportement cellulaire sans conduire à une mort cellulaire massive. Nous avons ensuite analysé le translatome de ces cellules traitées et celui de cellules non traitées. Pour cela, les fractions cytoplasmiques ont été purifiées et séparées sur gradients de saccharose pour séparer les ARNm qui sont associés aux polysomes de ceux associés aux monosomes et des ARN libres. L'analyse des modifications du translatome induites par le 5-FU montre que cette drogue est capable de stimuler la traduction d'un grand nombre d'ARNm qui codent pour des protéines possédant diverses fonctions. Cette activation traductionnelle est probablement médiée, au moins en partie, par une action du 5-FU sur les microARN. C'est ainsi que nous avons démontré que la stimulation de la traduction de l'ARNm du gène HIVEP2 est un mécanisme dépendant du microARN miR-155 / 5-Fluorouracil (5-FU) is an anti-metabolite intensely used in chemotherapeutic treatments in various cancers. The cellular and molecular mechanisms of action of this anti-cancer agent still remain to be determined. Because 5-FU is incorporated within all classes of RNA, knowledge of the different levels of gene expression regulation affected by 5-FU will help to decipher its mode of action. We hypothesized that the translational control is altered by 5-FU treatment as a consequence of disrupted RNA metabolism. In this study, the colorectal cancer cell line HCT116 has been treated or not by different doses of 5-FU for different periods of time to determine the time and dose window that induces modifications of cell behavior without leading to an extensive cell death. Translational reprogramming was then analyzed during this time and dose window. For this, cytoplasmic fractions were purified and separated through sucrose gradients to distinguish the actively translated mRNAs that are associated with polysomes from the inactive mRNAs associated with monosomes or free mRNAs. A microarray analysis was then performed to identify the mRNAs presented in monosome and polysome fractions with and without treatment. This polysome profiling approach reveals that 5-FU treatment did not turn-off the global translation efficiency, but rather modulates translation efficiency of specific mRNAs. Secondly, more than 640 mRNAs were found to be up-translated following 5-FU treatment. Finally, we have demonstrated that 5-FU induced up-regulation of HIVEP2 by a molecular mechanism involving an action of 5-FU on miR-155

La régulation et le contrôle-qualité de l'expression génique permettent respectivement de maintenir un équilibre entre synthèse et dégradation des ARNm répondant aux besoins cellulaires et d'empêcher l'expression d'ARNm ou protéines aberrants potentiellement toxiques. Pour mieux comprendre ces processus cytoplasmiques, je me suis intéressée à Jlp2, Tac4 et Ska1, trois protéines ayant des liens physiques ou fonctionnels avec des acteurs du contrôle-qualité des ARNm et peptides appartenant aux complexes RQC et SKI. Jlp2 montre des liens de létalité synthétique avec les complexes RQC et SKI mais son absence n'altère pas le " NonStop mRNA Decay ". Elle pourrait donc être impliquée dans une autre voie de contrôle dépendante des complexes RQC et SKI. Tac4 est une ARN hélicase putative associée aux ribosomes, au niveau de l'hélice H16 de l'ARNr 18S comme son homologue putatif mammifère DHX29. Elle interagit également au niveau de régions 3'UTR d'ARNm. Ces observations suggèrent que Tac4 pourrait être impliquée dans la réinitiation de la traduction et le sauvetage de ribosomes non-dissociés récemment identifiés dans la région 3'UTR d'ARNm. Enfin, nous avons identifié Ska1, une protéine appartenant à une nouvelle sous-population de complexes SKI. Nos données suggèrent que ce complexe SKI-Ska1 est impliqué dans la dégradation de transcrits dépourvus de ribosome. Nous proposons un modèle selon lequel ce complexe SKI-Ska1 agirait durant la dégradation de 3'UTR avec l'exosome, puis en arrivant dans la région codante et en rencontrant un ribosome, Ska1 se dissocierait du complexe pour lui permettre d'interagir directement avec le ribosome et poursuivre la dégradation 3'-5' de l'ARN. / Mechanisms responsible for the regulation of gene expression and its quality-control are required, respectively for maintaining an equilibrium between mRNA synthesis and degradation and to prevent synthesis of aberrant mRNAs and proteins potentially toxic for the cells. To better understand these quality-control processes, I studied three factors, Jlp2, Tac4 and Ska1, with physical or functional links described with factors involved in mRNA and protein quality-control, the RQC and SKI complexes. Jlp2 shows synthetic lethality with the RQC and SKI complexes but its deletion has no effect on the NonStop mRNA Decay, suggesting that Jlp2 could be implicated in another control pathway linked to the RQC and SKI complexes. Tac4 is a putative RNA helicase bound to ribosomes, on the 18S rRNA H16 helix, as its mammalian putative homolog DHX29. DHX29 plays a role in translation initiation but surprisingly, Tac4 interacts, in addition to ribosomes, with mRNA 3’UTRs. These observations suggest that Tac4 could be implicated in translation reinitiation and rescue of non-dissociated-ribosomes, recently described within mRNA 3’UTRs. Finally, we identified Ska1, a new factor associated to a SKI complex subpopulation. Our observations suggest that the SKI-Ska1 complex is implicated in the degradation of transcripts devoid of ribosomes. It suggests a model by which the SKI complex would proceed in two steps. First, the SKI-Ska1 complex could assist the exosome to degrade 3’UTR regions of RNAs and then, when its reaches the coding region and encounter a ribosome, Ska1 would leave the complex and allow it to interact directly with ribosomes to proceed further in the 3’-5’ RNA degradation.

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Le ribosome est une machine biomoléculaire primordiale pour la survie de tout organisme du fait de son rôle central au sein de la synthèse protéique. La caractérisation des interactions avec ses nombreux partenaires est un élément crucial pour mieux comprendre les mécanismes de la traduction et de son inhibition chez les eucaryotes et procaryotes. Cette inhibition est d’ailleurs une stratégie utilisée par beaucoup d’antibiotiques ciblant le ribosome pour lutter contre les infections bactériennes. La compréhension de leur mode d’action est devenue une priorité mondiale pour faire face au problème de la résistance bactérienne. Chez les eucaryotes, une autre stratégie est employée par les virus pour bloquer et s’approprier la machinerie traductionnelle de l’hôte grâce à des structures d’ARN non codant (IRES) capables de recruter directement le ribosome. Bien que largement caractérisés, peu de données thermodynamiques et cinétiques sont disponibles concernant ces deux systèmes d’interaction avec le ribosome. Mon projet a pour vocation d’utiliser des approches biophysiques innovantes afin de compléter les études sur les interactions du ribosome d’E. coli avec les macrolides, et du ribosome de S. cerevisiae avec l’IRES intergénique du CrPV. / The ribosome is a biomolecular machine essential for the survival of any organism due to its central role in protein synthesis. The characterization of its interactions with its many partners is a crucial element in better understanding the mechanisms of translation and inhibition in eukaryotes and prokaryotes. Inhibition of translation is a strategy used by many ribosome-targeting antibiotics to fight bacterial infections. Understanding their mode of action has become a global priority in addressing the problem of bacterial resistance. In eukaryotes, another strategy is used by viruses to block and appropriate the host's translational machinery through non-coding RNA structures (IRES) capable of directly recruiting the ribosome. Although widely characterized, few thermodynamic and kinetic data are available for these two ribosome interaction systems. My project is intended to use innovative biophysical approaches in order to provide an original view of the interactions of the E. coli ribosome with macrolides, and of the S. cerevisiae ribosome with the intergenic IRES of the CrPV.

<p>This thesis details the development of a kinetic model of translation which takes into account codon usage. The process of translation involves ribosomes decoding a sequence of codons to produce a protein. Codon usage is important in the kinetics of translation since experiments have shown that codons are processed at different rates. Codons which code for the same amino acid appear with unequal frequencies and certain synonymous codons are preferred by high expression genes. The relationship between translational efficiency and codon adaptation is explored in this thesis.</p> <p>We use a simple physics model called the totally asymmetric exclusion process (TASEP) to emulate the action of ribosomes, and the decoding of mRNA in protein elongation. The simple model is parameterized by an initiation rate that determines how quickly new ribosomes are introduced onto the lattice, and the rate of motion for ribosomes associated with a site on the lattice (codon message). Based on bioinformatics studies, we assign codon speeds so that codons preferred by high expression genes are translated more quickly.</p> <p>The model captures important aspects of translation like ribosome collision and codons of different speeds, and simulating it allows us to see details in dynamics which are inaccessible to experiments. TASEP has non-trivial behaviour when codon rates, and the rate of ribosome binding is varied. Slow codons can cause ribosomes to pause and may lead to a queue. We approximated real genes with its average rate, and with its slowest codons to test the salient features of how codons are used on mRNAs. We found that codon selection is important in determining when queues occur, and the ribosome density on genes. The model also shows that highly expressed genes queue later than low expression genes. The simple model gives us general insights into the translational selection of codons, and the important kinetic parameters.</p> / Master of Science (MSc)

La régulation de l’expression génique chez les bactéries résulte d’un processus complexe comprenant deux étapes majeures, la transcription des gènes en ARNm et leur traduction en protéines. Les études qui allient les données de transcription et de traduction sont rares et l’importance de chacun de ces deux mécanismes dans un processus global d’adaptation n’est pas encore clairement définie. Or, les faibles corrélations entre les niveaux d’ARNm et de protéines chez les bactéries et, plus particulièrement chez la bactérie modèle Lactococcus lactis, suggèrent l’importance des régulations traductionnelles.Aujourd’hui des exemples de mécanismes de régulation de la traduction à l’échelle moléculaire se multiplient, néanmoins il n’existe que très peu de méthodes systémiques permettant d’étudier ces régulations à l’échelle globale. Dans cette thèse, l’état de traduction de chacun des ARNm de la cellule a été estimé par la mesure du traductome. Ainsi, pour chaque ARNm, le pourcentage de molécules en traduction et sa densité en ribosomes ont été déterminés. Pour la première fois, une image complète de l’état de traduction de la bactérie a été obtenue montrant une grande variabilité traductionnelle au sein de la population des transcrits. De plus, il a été démontré que cet état traductionnel était très régulé. De fait, lors d’une carence nutritionnelle, la machinerie de traduction est globalement diminuée et il est observé une redistribution de l’efficacité de traduction vers des gènes nécessaires à la bactérie pour être adaptée au stress imposé. D’autre part, cette forte variabilité de l’état de traduction au sein des ARNm a pu être reliée à des différences au niveau du mécanisme propre de la traduction. En effet, les coefficients de contrôle des trois grandes étapes de la traduction, estimés par modélisation à partir des données de traductome, dépendent fortement de la nature des gènes. Ainsi un contrôle au niveau de l’étape d’initiation a été démontré comme attendu pour la majorité des gènes. Mais pour un grand nombre de gènes, un contrôle par l’élongation (et pour un nombre plus restreint par la terminaison) a été aussi mis en évidence chez L. lactis. Dans le contrôle global de l’expression génique, il a d’autre part été mis en évidence que les processus de traduction et de dégradation des ARNm étaient impliqués et associés à des régulations coordonnées ou non en fonction des conditions de croissance.En conclusion, ces travaux de thèse ont montré l’importance des régulations de la traduction. Plus largement, ils ont souligné la nécessité de caractériser les différents niveaux de régulations de l’expression génique afin de mieux appréhender la physiologie de la cellule / In bacteria, regulation of gene expression results from a complex program composed of two main steps: transcription of genes into mRNA and their translation into proteins. Few studies integrate both transcription and translation, so their relative importance in the global process of bacterial adaptation is not yet well defined. However, weak correlations between mRNA and protein levels were found in bacteria, in particular in the lactic acid bacteria model Lactococcus lactis, suggesting significant translation regulations in this bacterium.Nowadays, translation regulation mechanisms are mainly investigated at the molecular level since only few systemic methods exist to study these regulations at a genome-wide scale. During this PhD, translation state of all mRNA was estimated by translatome measurement. For each mRNA in the cell, percentage of its molecules in translation and its ribosome density were determined. For the first time in bacteria, a detailed picture of the translation state of all transcripts was obtained. Large variation of translation state was observed within the transcript population demonstrating a high diversity of translational regulations in a given physiological state. In addition, during nutrient starvation, the global translation machinery was decreased and associated with a redistribution of the translation efficiency towards genes required to stress adaptation.Changes in translation state were related to specific kinetics of the three elementary steps of translation. From translatome data, control coefficients of initiation, elongation and termination on the global translation process were modeled. The translation limiting step was strongly dependent on gene function. Although a control by initiation was observed for most of the genes of L. lactis, a large set of genes was elongation limited, and even few genes were limited by termination.In the global control of gene expression, both translation and mRNA decay were involved and led to coupled or uncoupled regulations according to growth conditions.Finally, this work has demonstrated the importance of translation regulations in bacteria. This result strengthens the necessity to include all the different layers of gene expression regulation in order to better understand cell physiology